Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae.

ĐạI HọC THáI NGUYÊN

TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM




phạm thanh dung


Tờn ti:
Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme

- glucosidase từ
đậu đen lên men bằng chủng
Aspergillus oryzae


khóa luận TốT NGHIệP đại học

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm
Khoa : CNSH - CNTP
Khoá học : 2010 - 2014



Thỏi Nguyờn, 2014

ĐạI HọC THáI NGUYÊN

TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM




phạm thanh dung
Tờn ti:
Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme

- glucosidase từ
đậu đen lên men bằng chủng
Aspergillus oryzae


khóa luận TốT NGHIệP đại học


Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm
Khoa : CNSH - CNTP
Lớp : 42 - CNTP
Khoá học : 2010 - 2014
Giảng viên hớng dẫn : 1. ThS. Nguyễn Đức Tiến
2.ThS. Trần Thị Lý

Thái Nguyên, 2014



LỜI CẢM ƠN
Có được kết quả nghiên cứu này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến:
ThS. Nguyễn Đức Tiến - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và
môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu
hoạch, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên, khuyến
khích tôi rất nhiệt tình và chu đáo trong những lúc khó khăn, truyền cho tôi
kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
ThS. Trần Thị Lý - Giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ về phương diện nghiên cứu, kiến thức và có những
góp ý sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời yêu thương chân thành nhất đến bố mẹ, anh chị tôi đã
luôn ở bên cạnh tôi ủng hộ và động viên trong suốt quá trình thời gian học tập
và thực hiện đề tài này.
Tôi chân thành cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi, chia sẻ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề
tài tốt nghiệp.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Sinh viên

Phạm Thanh Dung



DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Thành phần chất dinh dưỡng trong đậu đen 3

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức
chế ezyme α-glucosidase của phần kết tủa thu được 31

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến tinh chế hoạt chất ức chế
enzyme α-glucosidase 33

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức chế
enzyme α-glucosidase 34

Bảng 4.4. Khoảng biến đổi các yếu tố 36

Bảng 4.5. Bảng thiết kế ma trận 37

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô chân không đến chất lượng dịch cô và
thời gian cô. 42

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của áp suất cô chân không đến thời gian cô đặc dịch
đậu đến lên men 43

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của túi Kraft và lọ thủy tinh đến chất lượng bảo quản
chế phẩm sau 3 tháng bảo quản 44

Bảng 4.10. Đánh giá chất lượng sản phẩm hoạt chất AGIs 45




DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Aspergillus oryzae (Hệ sợi) 5
Hình 2.2. Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) 5
Hình 2.3. Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới 6
Hình 2.4. Cấu tạo của enzyme α-glucosidase 7
Hình 2.5. Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase 7
Hình 2.6. Sơ đồ ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường của cơ
thể 10
Hình 4.1. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt
chất ức chế ezyme α-glucosidase của phần kết tủa thu được 31
Hình 4.2. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt
chất ức chế ezyme α-glucosidase của phần dịch lỏng thu được 32

Hình 4.3. Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến tinh chế hoạt chất ức chế
enzyme α-glucosidase 33

Hình 4.4. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức
chế enzyme α-glucosidase 35

Hình 4.5. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu tinh chế bằng
dung môi hữu cơ 38

Hình 4.6. Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới tinh chế hoạt
chất AGIs của chủng A.oryaze 38

Hình 4.7. Tương tác giữa nhiệt độ với nồng độ tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs 39
Hình 4.8. Tương tác giữa nồng độ với tỷ lệ dung môi tới khả năng sinh hoạt
chất AGIs 40

Hình 4.9. Tương tác giữa tỷ lệ dung môi với nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt
chất AGIs 41

Hình 4.10. Phương trình hàm kỳ vọng 42

Hình 4.11. Ảnh hưởng của áp suất cô chân không đến thời gian cô đặc dịch
đậu đến lên men 43

Hình 4.12. Sơ đồ quy trình trích ly và tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên
men 46


DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT


AGIs Ức chế enzyme α-glucosidase
TPCN Thực phẩm chức năng
A.oryzae Aspergillus oryzae
ĐTĐ Đái tháo đường
IC
50

Nồng độ ức chế 50% của mẫu
CT Công thức
HPLC Sắc khí lỏng cao áp
VADS Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam




MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích 1

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Đậu đen lên men 3

2.1.1. Đậu đen 3

2.1.2. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae) 4

2.1.3. Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới 5

2.2. Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) 7

2.2.1. Giới thiệu về enzyme α-glucosidase 7

2.2.2. Giới thiệu về hoạt chất AGIs 8

2.3. Trích ly hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 11

2.3.1. Cơ sở của quá trình trích ly 11

2.3.2. Phương pháp trích ly hoạt chất AGIs 13

2.4. Tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 14

2.4.1. Cơ sở của quá trình tinh chế AGIs từ đậu đen lên men 14

2.4.2. Các phương pháp tinh chế 14

2.5. Phương pháp thu nhận AGIs 16

2.5.1. Phương pháp cô đặc 16

2.5.2. Phương pháp sấy 17

2.6. Các loại bao bì dùng để bảo quản 18

2.7. Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs trong và ngoài nước 20

2.7.1. Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs thế giới 20

2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 21

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 23

3.1. Đối tượng nghiên cứu 23

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 23

3.3. Hoá chất và thiết bị sử dụng 23

3.4. Nội dung nghiên cứu 23

3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh
chế hoạt chất AGIs 23

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 24
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt
chất AGIs 24

3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm 24

3.4.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất
AGIs 24
3.5. Phương pháp nghiên cứu 24

3.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

3.5.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 28

3.5.3. Quy trinh tinh chế sơ bộ hoạt chất AGIs 30

3.5.4. Phương pháp sử lý số liệu 30

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh
chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 31

4.1.1. Lựa chọn nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu
đen lên men 31
4.1.2. Lựa chọn tỷ lệ dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch
trích ly đậu đen lên men 33



4.1.3. Lựa chọn nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch trích ly
đậu đen lên men 34

4.1.4. Tối ưu hóa nhiệt độ, nồng độ, tỷ lệ dung môi, đến hiệu quả tinh chế
hoạt chất AGIs 35

4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 42

4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs
42
4.2.2. Xác định áp suất chân không cho quá trình cô dịch 43

4.3. Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế hoạt chất AGIs bằng phương pháp
lọc gel 44

4.4. Nghiên cứu bao bì bảo quản chế phẩm AGIs 44

4.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế AGIs từ đậu
đen lên men 45

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1. Kết luận 48

5.2. Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) là một trong những nhóm
phổ biến được ứng dụng giúp ổn định đường huyết cho người tiểu đường,
thừa cân và béo phì. Chất AGIs có chức năng ngăn sự tạo thành
monosaccharide từ disaccharide, làm cho quá trình tổng hợp insulin diễn ra dễ
dàng và hạn chế hấp thụ monosaccharide. Chất AGIs có thể được tổng hợp
bằng con đường hóa học hoặc tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật.
Chất AGIs tổng hợp theo con đường hóa học hiện thường gây một số
tác dụng phụ như rối loạn chức năng gan và chứng đau dạ dày. Tuy nhiên chất
AGIs từ đậu đỗ lên men bởi Aspergillus oryzae (A.oryzae) có độ an toàn cao,
không có tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay đã có nhiều công trình
nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thực phẩm thương mại có hiệu quả chức năng
hỗ trợ ổn định đường huyết, phòng chống tiểu đường, thừa cân và béo phì.
Tác Giả Nguyễn Đức Tiến Trưởng bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và

môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu
hoạch đã nghiên cứu ‘‘Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase và thử nghiệm sản xuất thực phẩm
chức năng’’. Đã nghiên cứu trích ly hoạt chất ức chế AGIs từ đậu đen lên
men thu được hàm lượng AGIs là 86,8%, IC50 là 5,4mg/ml. Nếu chỉ dừng lại
ở trích ly thì hoạt chất thu được lẫn rất nhiều tạp chất khác. Việc tinh chế hoạt
chất AGIs là rất cần thiết.
Từ những lý do trên tôi tiên hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh
chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng
Aspergillus oryzae”.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen
lên men bằng chủng Aspergillus oryzae.
1.3. Yêu cầu
- Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả
tinh chế hoạt chất AGIs.
2

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sắc ký lọc gel đến hiệu quả tinh
chế hoạt chất AGIs.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm.
- Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs.
3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đậu đen lên men
2.1.1. Đậu đen
Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrical Skeels hay Vigna unguiculata

walp.subsp.cylindrica (L) Verdc. Có hai loại đậu đen: Loại vỏ đen ruột trắng và
loại vỏ đen ruột xanh thường gọi là đậu đen xanh lòng (loại này thường được sử
dụng làm thuốc hơn). Hàm lượng protein trong đậu đen có thể sánh với protein
trong các thực phẩm thịt hay bơ sữa. Chất đạm thực vật có trong đậu đen là loại
protein quý và đặc biệt đậu đen có đủ 10 loại axit amin cần thiết như: Lysine,
methionine, tryptophane, phenylalanine, threonine, valine, leucine, isoleucine,
arginine và histidine.
Bảng 2.1. Thành phần chất dinh dưỡng trong đậu đen
STT Thành phần Tỷ lệ trong 100g hạt đậu đen
1 Nước 14,0g
2 Lipit 1,7g
3 Gluxit 53,3g
4 Protein 24,2g
5 Celluloze 4,0g
6 Canxi (Ca) 56,0mg
7 Photpho (P) 354,0mg
8 Sắt (Fe) 6,1mg
9 Caroten 0,06mg
10 Vitamin B1 0,50mg
11 Vitamin B2 0,21mg
12 Vitamin PP 1,8mg
13 Vitamin C 3,0mg
14 Các thành phần khác… -
4

Đậu đen cũng được xác nhận là có tác dụng lợi tiểu và tiêu độc cơ thể.
Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có
tác dụng ổn định lượng đường trong máu. Trường hợp cơ thể kháng insulin
mắc bệnh tiểu đường thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ
năng lượng một cách chậm hơn và cuối cùng ổn định lượng đường huyết. Tại

Hoa Kỳ, người ta đã thực hiện một nghiên cứu đối chứng những người mắc
bệnh tiểu đường tuýp 2 được chia làm 2 nhóm, nhóm ăn theo tiêu chuẩn quy
định đối với người mắc bệnh tiểu đường, khẩu phần ăn có 24g chất xơ đậu
đen/ngày và một nhóm khác dùng tới 50g chất xơ đậu đen/ngày. Kết quả hai
nhóm đều giảm lượng đường huyết và insulin nhưng ở nhóm sau lượng
cholesterol toàn phần giảm được gần 7%, triglycerid giảm 10,2% và hàm
lượng cholesterol xấu giảm 12,5%. Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện
đậu đen lên men còn giàu chất AGIs [3].
2.1.2. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae)
Aspergillus oryzae (A.oryzae) thuộc chi Aspergillus. Họ
Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và
thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường
dùng để làm tương. Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa
gạo khi làm rượu Sake. Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một
nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine (1854 - 1922).
Nấm sợi A.oryzae đã được chọn lọc để có các chủng có hoạt tính rất
cao, được sử dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau ở nhiều nước khác
nhau ngay từ những thập niên 60 và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phổ
biến, nâng cao và chuyên sâu. Nấm này còn được dùng để sản xuất tương
Nhật từ đậu tương, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là
shoyu (soy sauce). Và nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất
nhiều loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase,
cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [2;25].
5


Hình 2.1. Aspergillus oryzae (Hệ sợi)


Hình 2.2. Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính)

Hiện nay trên thế giới đã tìm thấy một loại chất chiết từ các chủng
Aspergillus.sp lên men đậu tương có khả năng ức chế enzym α-glucosidase.
Nhóm tác giả Klich chứng minh đậu tương lên men bằng A.oryzae cho hợp
chất ức chế enzym α-glucosidase cao hơn so với lên men bằng Asp. Elegans
và Asp.Reurhizus vì vậy chủng nấm mốc A.oryzae là nguyên liệu phù hợp
nhất cho sản xuất hoạt chất AGIs.
2.1.3. Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới
Trên thế giới có nhiều công trình đã và đang nghiên cứu công nghệ sản xuất
các sản phẩm lên men đậu chế biến, quá trình nghiên cứu không chỉ dừng lại việc
6

cung cấp thực phẩm, mà còn hướng đến các tác dụng lớn hơn trong việc phòng một
số bệnh như: béo phì, tiểu đường. Theo nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự,
chiết xuất Touchi từ đậu lên men là thực phẩm truyền thống của Trung Quốc, có
chứa họat chất AGIs với hàm lượng IC
50
0,05 - 0,55mg/g [9].
Hiện nay chất chiết từ đậu lên men Tuochi chứa hoạt chất AGIs được sử
dụng trong dược phẩm, thực phấm sản xuất, thực phẩm chức năng, thực phẩm y tế
chăm sóc đặc biệt nó không chỉ tạo ra sự đa dạng về sản phẩm mà còn mang đến
một số tác dụng trong phòng bệnh như: bệnh tiểu đường, béo phì…
Ứng dụng trong dược phẩm dưới nhiều hình thức như: Viên nén, viên
nang, hay dạng viên rắn như: Nutritionalsupplement bao gồm khoảng 100mg
Touchi chiết xuất và khoảng 166,67mg phaseolamin. Hay thuốc providesabout
gồm có 300mg Touchi và khoảng 500mg phaseolamin. Khả năng ức chế của nó
thể ngăn cản sự hình thành của 100gram carbohydrates. Mang đến lợi ích cho
người sử dụng vì tính thuận tiện về vận chuyển.
Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng: Như bổ sung sản xuất
trà, các sản phẩm đồ uống, súp xiro đây cũng là hướng mới trong quá trình

sản xuất và thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới.
Theo nghiên cứu của ToyoRoshi, Kawasaki, Nhật Bản bột Tuochi được
nghiền mịn và bổ sung vào trà với hàm lượng 0,3g và giá trị IC
50
là 1,03g/l,
sau đó đóng gói vào túi nhôm, các bệnh nhận được một gói trà, hòa tan với
100ml nước uống trước bữa ăn. Để so sánh tác dụng của loại trà này người ta
cũng tiến hành thử nghiệm với loại trà không bổ sung bột Tuochi [23]. Kết
quả cho thấy ở các bệnh nhân sử dụng loại trà có hàm lượng Touchi, nồng độ
đường trong máu ổn định và nồng độ chất béo trung tính giảm so với các bệnh
nhân không sử dụng trà có bổ sung Touchi.

Hình 2.3. Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới

7

2.2. Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs)
2.2.1. Giới thiệu về enzyme α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ đầu
khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α-D-glucose nối với
nhau bằng liên kết 1-4glycosides. Enzyme α-glucosidase có thể có nhiều
nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật việc
khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt
động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme những thông số cơ
này chỉ có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một enzyme α-glucosidase
cụ thể.


Hình 2.4. Cấu tạo của enzyme α - glucosidase
Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen

mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20kb.

Hình 2.5. Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase

8

2.2.2. Giới thiệu về hoạt chất AGIs
2.2.2.1. Nguồn sản xuất hoạt chất AGIs
Hoạt chất AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:
Trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc
bằng con đường vi sinh vật:
a. AGIs từ thực vật
Chất AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con phần khác nhau của thực
vật. Đây là nguồn thu nhận AGIs phong phú và đa dạng nhất. Năm 2006,
Atsuo và cộng sự [5] đã công bố dịch chiết bằng methanol từ lá cây hoa sữa
phơi khô có khả năng AGIs ruột non của chuột. Năm 2002, Ye và cộng sự đã
nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một loại thảo mộc Trung
Quốc tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột [7]. Gần đây Phuwapraisirisan
và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá rau
Corchorus olitorius ( Thái Lan) [21].
Ngoài ra, trên thực tế còn rất nhiều loài thực vật chứa chất AGIs (1-
deoxynojirimicin hay DNJ từ lá dâu [1]) đã được các nhà khoa học nghiên
cứu và công nhận. Tuy nhiên, sản xuất các chất AGIs từ thực vật trên quy mô
lớn rất tốn kém và phức tạp.
b. Chất AGIs từ động vật
Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra
khả năng AGIs của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm)
[19]. Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở nồng độ 0,5mg/ml
thì khả năng AGIs từ nấm men là 68%. Từ dịch chiết Hải Sâm, các nhà khoa
học đã thu được ba loại AGIs.

c. Chất AGIs từ vi sinh vật
Việc sản xuất chất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm
nghiên cứu của các nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử
dụng an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay
một số chủng vi sinh vật như:
A. oryzae, Actinomucor elegans, Rhizopus arrhizus, Streptomyces ,
Actinoplanes và Flavobacterium saccharophilium, Saccharomyces cerevisiae đã
9

được nghiên cứu cho sinh tổng hợp chất AGIs [10]. Một số AGIs phổ biến như:
acarbose - một pseudo - tetrasaccharite được thu nhận từ canh trường lên men
Actinoplanes spp. SE - 50. Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus. Adiposin, trestatin B, cyclophellitol và CKD - 711 được lấy từ
Streptomyces calvus TM - 521, Streptomyces dimorphogenes và Phellinus spp [11].
Tuy nhiên AGIs từ A.oryzae là hướng nghiên cứu mới.
Phần lớn các chất AGIs từ vi sinh vật có cấu trúc tương tự gốc
pyranosyl của α-glucosidase, như: Acarbose và Voglibose từ vi sinh vật.
Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài
Actinoplanes SE50) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị IC
50

= 0,5µM [22]. Acarbose không làm tăng tiết insulin, không làm giảm glucose
trong máu lúc đói khi dùng điều trị ở người. Sau Acarbose, năm 1984,
Kameda và cộng sự đã tìm ra valiolamine - AGIs từ vi khuẩn Streptomyces
hygroscopicus [15]. Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện
cyclo (dehydroala-L-Leu), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp. F
70614 có khả năng AGIs của nấm men và của ruột non lợn [17].
2.2.2.2. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2
Bệnh đái tháo đường biểu hiện mức đường trong máu cao hơn 7
mmol/l. Insulin là hoocmon có chức năng vận chuyển đường vào bên trong tế

bào. Khi thiếu insulin, đường không thể vào bên trong tế bào mà bị thải ra
ngoài qua đường nước tiểu, khi ấy con người cảm thấy mệt mỏi, khát nước và
giảm cân.
Bệnh nhân tiểu đường được phân thành hai nhóm:
Tiểu đường tuýp 1 hay còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin: Do
tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên
phải tiêm hoặc uống insulin.
Tiểu đường túyp 2 hay còn gọi là tiểu đường không lệ thuộc insulin:
Chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh tiểu đường cơ thể người vẫn tiết ra insulin
nhưng không đủ khiến đường không được đưa vào tế bào mà chỉ lưu hành
trong máu. Muốn điều trị bệnh này người ta chỉ cần áp dụng một chế độ ăn
hợp lý là kiềm chế được bệnh.
10

Các thuốc chữa bệnh đái tháo đường được chia làm 6 nhóm gồm:
Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất ức chế dipeptidyl
peptidase IV và hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs). Hiện nay, một loạt
các chất AGIs được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường như voglibose, acarbose.
Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử
dụng hoạt chất AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ như sau: Tinh bột hoặc đường,
còn được gọi là cacbonhydrat cấu tạo gồm hai hay nhiều monosaccharide
(glucose và fructose). Để cơ thể hấp thụ được, cacbonhydrate sẽ bị phân cắt
hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa. Dưới tác
dụng của enzyme α-glucosidase chúng sẽ phân cắt thành các monosaccharide
tại ruột non. Chất AGIs có thể kìm hãm hoạt tính enzyme α-glucosidase nên
ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng
hợp insullin diễn ra dễ dàng hơn.
AGIs có trung tâm hoạt động chứa acid carboxylic. AGIs là chất kìm
hãm cạnh tranh. Khi tiếp xúc với α-glucosidase, AGIs sẽ gắn vào trung tâm
hoạt động của enzyme này và làm giảm hoạt lực của enzyme, ngăn không cho

α-glucosidase thủy phân các polysaccharide thành monosaccharide nên có tác
dụng điều hòa lượng đường trong máu.
2.2.2.3. Ảnh hưởng của hoạt chất AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể

Hình 2.6. Sơ đồ ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường của cơ thể
Tinh b
ộ
t

Saccarose ( Glucose+Fr
uctose)

Maltose (Glucose +Glucose)
Ch
ấ
t
ứ
c ch
ế

α
-
gluco
s
ida
se

Ch
ấ
t

ứ
c ch
ế

Glucose
Glucose Fructose Glucose
Glucose huyết
Amylase

11

Các kết quả nghiên cứu cho thấy AGIs có tác dụng gia tăng peptide-1
dạng glucagon (GLP-1) và peptide-2 dạng glucagon (GLP-2) trong huyết
tương. Nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kế. GLP-1 kích thích
sự tiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh sôi tế bào beta. GLP-2 cải thiện
cấu trúc và chức năng của ruột non bằng cường cấu trúc của lông nhung và
tăng hoạt tính vận chuyển vào enzyme. GLP-2 làm giảm sự viêm ruột. GLP-1
vad GLP-2 được tạo ra khi có sự kích thích thần kinh, hormone hoặc yếu tố
dinh dưỡng. AGIs có khả năng ngăn cản sự phân cắt carbohydrate nên kéo dài
thời gian có mặt của carbohydrate trong ruột. Do vậy một lượng lớn
carbohydrate sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và tương tác với tế bào
Langerhans làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP-2. Người ta cho rằng glucose ở
ngoại biên ruột non sẽ bị lên men tạo các acid béo chuỗi ngắn và kích thích
tiết GLP-1 và GLP-2 hoặc quá trình vận chuyển glucose phụ thuộc vào natri
khi qua màng tế bào Langerhans sẽ kích thích sự tiết GLP-1 và GLP-2. Nồng
độ GLP-1 trong huyết tương tăng thúc đẩy quá trình kiểm soát glycemic và
cản trở sự có mặt glucose trong máu [19].
2.3. Trích ly hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men
2.3.1. Cơ sở của quá trình trích ly
Trích ly (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp)

để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Trường hợp thường gặp nhất là sự chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung
môi hữu cơ. Dung môi có tỷ trọng nhỏ hơn sẽ ở lớp trên như: Eter, benzene,
các hyđrocacbua,… dung môi có tỷ trọng lớn hơn sẽ ở lớp dưới như:
Chloroform, tetracloriccacbon, đicloetan… Khi trộn lẫn hai pha nước và dung
môi hữu cơ với nhau, pha này có thể khuếch tán một ít sang pha kia nhưng về
cơ bản một pha vẫn là nước và pha kia vẫn là dung môi hữu cơ. Khi lắc hai
pha lại với nhau, thể tích hai pha khi lắc không bằng đúng như thể tích trước
khi lắc. Tuy nhiên để cho đơn giản, giả thiết rằng thể tích của pha là không
đổi khi lắc. Trích ly nhằm mục đích điều chế hay phân tích.
Một hệ trích ly có thể là: Trích ly lỏng - rắn; Trích ly lỏng - lỏng. Dựa
vào trạng thái của nguyên liệu và đặc tính của dung môi người ta chia làm:
12

- Trích ly tĩnh là trong suốt quá trình trích ly nguyên liệu và dung môi
không được đảo trộn.
- Trích ly động là nguyên liệu và dung môi được khuấy trộn để tăng sự
tiếp xúc, nhờ đó mà hiệu suất trích cao hơn.
Trong quá trình trích ly tùy loại nguyên liệu mà gia nhiệt hoặc không
gia nhiệt. Loại nguyên liệu ít bị biến đổi hay biến đổi theo chiều hướng có lợi
khi gia nhiệt thì có thể gia nhiệt trong quá trình để tăng khả năng hòa tan của
các cấu tử nguyên liệu, làm thời gian trích ly nhanh hơn.
Dựa vào phương pháp, số bậc trích ly có thể chia thành trích ly gián
đoạn gồm:
- Trích ly đơn (chiết một lần): Toàn bộ quá trình thực hiện trong một
thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi tiếp xúc một lần. Phương pháp
thường cho hiệu suất thấp.
- Trích ly lặp (chiết nhiều lần): Nếu hệ số phân bố không đủ lớn thì
phải chiết nhiều lần như chiết một lần thì lượng chất tan còn trong dịch chiết
lượng đáng kể người ta cho thêm dung môi chiết mới và chiết một hoặc nhiều

lần nữa. Nhờ đó mà đường đi của dung môi được kéo dài tạo điều kiện cho
dung môi bão hòa chất tan. Toàn bộ quá trình vẫn thực hiện trên một thiết bị.
Hiệu suất phương pháp cao hơn chiết đơn nhưng tốn dung môi, thời gian và
công suất. Tùy thuộc vào chiều chuyển động của dung môi và nguyên liệu ta
có trích ly nhiều lần xuôi dòng và ngược dòng. Trích ly nhiều lần ngược dòng
là cho dung môi vào dung dịch cần ly chiết chạy ngược dòng nhau. Đây là
một quá trình liên tục, mục đích tách hai hay nhiều chất tan ra bằng một loạt
sự phân chia giữa hai pha lỏng - lỏng. Nguyên tắc chiết lỏng - lỏng là chuyển
chất cần phân tích trong dung môi thứ nhất sang dung môi thứ hai và điều
kiện chất đó không tan trong dung môi thứ nhất.
Việc chọn loại hình trích ly sao cho hiệu suất cao nhất với chi phí về
dung môi, thời gian, thiết bị dễ chế tạo và vận hành là cần thiết. Một số
phương pháp hòa tan chiết xuất bao gồm:
- Phương pháp ngâm: Chuẩn bị nguyên liệu cho vào cột có kích thước
nhất định. Đổ dung môi ngâm qua đêm. Dịch chiết thu được đem cô đuổi
dung môi thu hoạt chất
13

- Phương pháp ngấm kiệt: Cho nguyên liệu vào bình ngâm nhỏ giọt,
lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát dịch để nguyên liệu không gây
tắc bình và lẫn vào dịch chiết. Đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn với tấm kim loại có
đục lỗ ở đáy bình. Cho từ từ nguyên liệu đã được làm ẩm vào bình vừa san
đều và nén nhẹ. Cho tới 2/3 thể tích bình đặt giấy lọc và để các bi thủy tinh
hoặc các tấm sứ, thép không gỉ có đục lỗ lên trên mặt nguyên liệu tránh khối
nguyên liệu bị xáo trộn khi đổ dung môi. Đổ dung môi vào bình và ngâm
lạnh, mở khóa ống thoát dịch chiết rồi đổ dung môi tới khi có vài giọt dịch
chiết chảy ra, đóng khóa lại. Đổ dung môi cho tới khi cách mặt nguyên liệu 3
- 4cm, ngâm lạnh 22 - 24 giờ. Sau đó mở khóa cho dịch chiết chảy ra từng
giọt vào bình hứng. Thể tích dịch chiết/1 phút là 0,5 - 1ml.
- Phương pháp trích ly bằng thiết bị Soxhlet: Chuẩn bị nguyên liệu,

bọc giấy, bịt 2 đầu rồi đặt vào trụ chiết. Dùng dung môi chiết trong thời gian
nhất định. Sau khi thực hiện các chu trình chiết lấy dịch chiết ra đem cô chân
không thu được hoạt chất thô.
Trong quá trình trích ly để thu hoạt chất AGIs cũng dựa vào nguyên tắc
chung của quá trình trích ly. Do đó việc lựa chọn phương pháp trích ly sao
cho hiệu quả cao nhất với chi phí về dung môi thời gian, thiết bị đơn giản và
dễ vận hành nhất.
2.3.2. Phương pháp trích ly hoạt chất AGIs
Theo nghiên cứu của Kawabata và cộng sự năm 2001có thể sử dụng
các dung môi hữu cơ có cực như methanol, ethanol, propanol, ethyl axetate,
hexan để chiết chất AGIs từ nấm mốc lên men trên môi trường đậu tương.
Người ta cũng có thể sử dụng kết hợp nước và rượu theo tỷ lệ khác nhau 1/10
hoặc 10/1 hay 1/5 hoặc 5/1. Quá trình trích ly được thực hiện như sau: Đậu
đen sau khi lên men được ngâm trong hỗn hợp (nước và rượu) tỷ lệ
nước/nguyên liệu là 1/15 chiết xuất ở nhiệt độ 40 - 60
0
C trong 1 - 3 giờ. Hoặc
ở nhiệt độ 30
0
C trong 10 giờ đến 7 ngày. Nếu sử dụng nước để chiết xuất:
Đậu lên men sau khi xay, ngâm trong nước với tỷ lệ nước /nguyên liệu là
1/20, chiết xuất ở 40 - 60
0
C trong 12 - 20 giờ hoặc 100 - 140
0
C trong 1 - 3
giờ. Giá trị IC50 là 0,5 - 0,55mg/ml [15].
14

Theo Fujita H, Yamagami và cộng sự năm 2007 bột đậu đen sau lên

men được xay, ngâm với nước theo tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/5. Sau đó chiết
xuất bằng nước nóng 80
0
C, dịch trích ly sau khi ly tâm và lọc sẽ được sấy
phun tạo dạng bột màu nâu sáng (bột Tuochi chiết xuất). Xác đinh hoạt chất
AGIs bằng cách xác định giá trị IC50 (IC50 của bột Tuochi là 0,05 -
0,55mg/ml) [4].
2.4. Tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men
2.4.1. Cơ sở của quá trình tinh chế AGIs từ đậu đen lên men
Bản chất của quá trình tinh chế AGIs là loại bỏ những tạp chất để thu
được một AGIs tinh khiết nhất.
Theo các nghiên cứu cho thấy, hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men là
những chất có trọng lượng phân tử dưới 3000Da. Dịch chiết thu được trong
quá trình trích ly có chứa 30 - 90% là những chất có trọng lượng phân tử từ
3000Da trở lên. Vì vậy việc lựa chọn phương pháp tinh chế có ảnh hưởng trực
tiếp tới hiệu suất thu hồi và hoạt tính của hoạt chất.
Theo nghiên cứu của Kawabata và cộng sự (2001), có thể sử dụng
nhiều phương pháp để loại bỏ thành phần có trọng lượng phân tử từ 3000Da
trở lên như sử dụng phương pháp lọc màng, phương pháp phân tách hai pha
nước hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, propanol,
butanol, chloroform, ethyl acetate, toluene, hexane hoặc bezen Thí nghiệm
cho thấy sản phẩm sau tinh chế có khả năng ức chế lớn gấp 2 đến 1000 lần so
với chất chiết thu được sau trích ly [15].
Theo nghiên cứu của Min-Gu Kang và cộng sự năm 2013, tinh chế hoạt
chất ức chế α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae
(A.oryzae) đã sử dụng hàng loạt các phương pháp sắc ký, sử dụng sắc kí lọc
gel sephadex G-25 đã xác định được trọng lượng phân tử là 360,1Da. IC
50
có
giá trị là 3,1mg/ml [

18
].
2.4.2. Các phương pháp tinh chế
2.4.2.1. Phương pháp lọc màng
Màng lọc là một kỹ thuật được sử dụng để tách các hạt riêng biệt từ
một chất lỏng nhằm mục đích tinh hóa nó. Trong lọc màng, một dung môi
15

được thông qua một màng bán thấm. Tính thấm của màng được xác định bởi
các kích thước của các lỗ chân lông màng, và nó sẽ hoạt động như một rào
cản đối với các hạt lớn hơn các lỗ chân lông, trong khi phần còn lại của dung
môi có thể vượt qua một cách tự do qua màng. Kết quả là một chất lỏng làm
sạch và lọc ở một bên của màng tế bào, với chất tan còn lại ở phía bên kia. Có
nhiều phương pháp khác nhau để đưa chất nào đó thấm qua một màng, một số
phương pháp được áp dụng như: Màng siêu lọc, màng tinh lọc, màng lọc
Nano, màng thẩm thấu ngược.
Tuy nhiên, để lọc được những chất có trọng lượng phân tử dưới
3000Da thì người ta thường dùng đến màng siêu lọc, một số màng siêu lọc
hay được sử dụng như: UF màng “PLBC” của Millipore hoặc UF màng “SEP
1013” của Akikasei.
Theo Kawabata và cộng sự (2001), 30g chất thu được sau khi cô đặc
dịch trích ly được tinh sạch bằng phương pháp lọc màng cho ra 5,8g chất rắn
khô có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase lên đến 90,4% trong đó chất có
trọng lượng phân tử lớn hơn 3000Da chiếm 15% [15].
2.4.2.2. Phương pháp phân tách hai pha nước
Cơ sở kỹ thuật của phương pháp này dựa vào sự phân bố khác nhau của
hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc
trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt.
Một nghiên cứu khác cho thấy khi thêm một hỗn hợp của ethyl acetate
và nước theo tỷ lệ 1/2 vào dịch chiết đã được cô đặc và đặt trong kênh phân

tách thì nó được phân chia thành hai lớp,một lớp hòa tan trong nước và một
lớp hòa tan trong ethyl acetate. Việc xác định hoạt tính chỉ ra rằng các chất
hòa tan trong nước có hoạt tính ức chế là 91,4%, chất tan trong ethyl acetate
có hoạt tính ức chế không đáng kể.
2.4.2.3. Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ
Đây là phương pháp được cho là đơn giản hơn các phương pháp trên
nhưng cũng thu được hoạt tính cao nhất. Việc bổ sung dung môi hữu cơ vào
chất chiết đã được cô đặc với tỷ lệ thích hợp nhằm mục đích kết tủa chất có
trọng lượng phân tử cao để loại bỏ chúng ra ngoài và thu được các chất hòa
tan trong dung môi .
16

Theo Kawabata và cộng sự (2001), sử dụng ethanol để hòa tan các chất
trong dịch chiết đã được cô đặc có trọng lượng phân tử thấp có thể thu được
hoạt tính lên đến 90,8% [15].
2.4.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel
Phương pháp sắc ký lọc gel là dựa trên sự khác nhau về kích thước,
hình dạng và trọng lượng phân tử của các chất có trong hỗn hợp.
Theo nghiên cứu của Fujita và cộng sự (2007), trong phương pháp lọc
gel, sử dụng gel sephadex G-75, những chất có trọng lượng phân tử trên
3000Da sẽ đi ra trước và được loại bỏ, những chất có trọng lượng phân tử
dưới 3000Da do phải đi qua các lỗ gel nên sẽ đi ra chậm hơn và được giữ lại.
Xác định hoạt tính cho thấy, những chất được thoát ra ngoài trước có hoạt
tính thấp, chất có trọng lượng phân tử thấp được đi ra sau có hoạt tính ức chế
enzyme α-glucosidase trong khoảng 85-90% [4;9].
Theo nghiên cứu của Min-Gu Kang và cộng sự năm 2013, tinh chế hoạt
chất ức chế α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae
(A.oryzae) đã sử dụng hàng loạt các phương pháp sắc ký, sử dụng lọc gel
sephadex G-25 đã xác định được trọng lượng phân tử là 360,1Da. IC
50

có giá
trị là 3,1mg/ml [
18
].
2.5. Phương pháp thu nhận AGIs
2.5.1. Phương pháp cô đặc
Cô đặc là phương pháp dùng để nâng cao nồng độ các chất hoà tan
trong dung dịch gồm 2 hai nhiều cấu tử. Quá trình cô đặc của dung dịch lỏng-
rắn hay lỏng - lỏng có chênh lệch nhiệt độ sôi rất cao thường được tiến hành
bằng cách tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn). Tuỳ theo tính
chất của cấu tử khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó), ta có thể
tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) bằng phương pháp nhiệt độ
(đun nóng) hoặc phương pháp làm lạnh kết tinh.
Các phương pháp cô đặc:
- Phương pháp nhiệt (đun nóng): Dung môi chuyển từ trạng thái lỏng
sang trạng thái hơi dưới tác dụng của nhiệt khi áp suất riêng phần của nó bằng
áp suất tác dụng lên mặt thoáng chất lỏng.