nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ đậu tương lên men dùng cho người bệnh tiểu đường

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
∗∗∗∗
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ
ĐỂ TÀI
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG TỪ ĐẬU TƯƠNG LÊN MEN DÙNG CHO
NGƯỜI BỆNH TIỂU ĐƯỜNG
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Hương Trà
Cơ quan chủ trì: Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch
Thời gian thực hiện: 1/2010 – 12/2010
Hà Nội, 2010
CHUYÊN ĐỀ THỰC HIỆN NĂM 2010
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm α-
glucosidaza và nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu
tương.
Chuyên đề 1: Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung và phương pháp nghiên cứu.
Chuyên đề 2: Phân lập các chủng nấm mốc để lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α-
glucosidaza.
Chuyên đề 3: Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng lên men tạo chất kìm hãm α-
glucosidaza và nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc tuyển chọn
Chuyên đề 4: Định tên chủng nấm mốc tuyển chọn (đến mức độ loài).
Chuyên đề 5: Nghiên xứu xác định một số yếu tố thích hợp cho quá trình nuôi cấy tạo
chế phẩm nấm mốc cho lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza.
Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình công nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm
α - glucosidaza.
Chuyên đề 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đậu tương đến khả năng tạo chất kìm
hãm α-glucosidaza của chủng nấm mốc tuyển chọn.
Chuyên đề 7: Khảo sát khả năng lên men tạo chất kìm hãm α - glucosidaza của chủng
nấm mốc lựa chọn trên môi trường đậu tương.

Chuyên đề 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ tới quá trình lên men bề mặt
tạo chất kìm hãm α - glucosidaza của nấm mốc.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
&
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỂ
Chuyên đề 1 “Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung và phương
pháp nghiên cứu”
Thuộc đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ đậu
tương lên men dùng cho người bệnh tiểu”
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Hương Trà
Trưởng nhóm thực hiện: Ths. Nguyễn Thị Hương Trà
Thời gian thực hiện: 1/2010 - 3/2010
Kinh phí thực hiện: 10.000.000 đồng
Hà Nội, 2010
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN CHUYÊN ĐỀ
Chuyên đề 1: Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Hương Trà
Trưởng nhóm thực hiện: Ths. Nguyễn Thị Hương Trà
Thời gian thực hiện: 1/2010 - 3/2010
Kinh phí thực hiện: 10.000.000 đồng
I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
I.1. Vài nét về thực phẩm chức năng
Thuật ngữ thực phẩm chức năng (functional food) để chỉ những chế phẩm thực
phẩm chứa các chất có hoạt tính sinh học cao, có dược tính từ động vật, thực vật, vi
sinh vật, một số chất tổng hợp giống các hoạt chất tự nhiên như vitamin, hương liệu
v.v…. có tính chất thiết dụng gần giống thuốc, nhưng không thay thế thuốc điều trị.
Thực phẩm chức năng đang được các chuyên gia đánh giá là một xu thế dinh dưỡng
của thế kỷ 21, đáp ứng một phần quan trọng về nhu cầu dinh dưỡng và sức khỏe con
người trong cuộc sống hiện đại. Thực phẩm chức năng được phân thành nhiều nhóm,

phụ thuộc tác dụng của sản phẩm như thực phẩm chức năng cho người có đường huyết
cao, thực phẩm chức năng cho người có cholesterol trong máu cao, thực phẩm chức
năng cải thiện tiêu hoá…Tuy nhiên, ở bất cứ hệ thống phân loại nào thì thực phẩm
chức năng có tác dụng giảm đường huyết cũng được quan tâm và xếp thành một nhóm
chính.
Thực phẩm chức năng hiện nay vô cùng phong phú và đa dạng, từ tự nhiên lên
men truyền thống tới các sản phẩm do con người chế biến, nhưng chủ yếu tập trung
vào ba hình thức sau đây:
- Thực phẩm chức năng có nguồn gốc tự nhiên: bao gồm các loại động vật, thực
vật, vi sinh vật mà trong đó bản thân nó có chứa các chất “chức năng” với hàm lượng
lớn, có tác dụng tích cực đối với cơ thể như cà rốt chứa beta - caroten có khả năng làm
sáng mắt, chống lão hoá, ngăn ngừa bệnh ung thư, chè xanh chứa catechin, rong, tảo
giàu axít amin và vitamin có tác dụng giảm béo, giảm hàm lượng cholesterol trong
máu.
- Thực phẩm chức năng là sản phẩm của quá trình chế biến, không có chất bổ
sung như các sản phẩm từ sữa (sữa chua, pho mát) kích thích tiêu hoá, điều hoà huyết
áp, tăng khả năng miễn dịch. Trong quá trình lên men, ngoài việc tạo ra các peptit chức
năng thì một số lượng lớn các vi khuẩn lactic cũng là yếu tố quan trọng tạo nên chức
năng sinh học của sản phẩm.
- Thực phẩm đã qua chế biến và bổ sung các chất “chức năng”. Đây là thành quả
của công nghệ chế biến hiện đại với hàng loạt các sản phẩm chức năng như nước cam
có bổ sung canxi nhằm giảm nguy cơ loãng xương, các thực phẩm có bổ sung vitamin
E có tác dụng dụng tăng cường khả năng sinh dục, làm đẹp da…
I.2. Thực phẩm chức năng từ đậu tương lên men
Cây đậu tương hay còn gọi là đậu nành có tên khoa học là Glycine max, thuộc họ
đậu (Fabaceae). Ở Việt Nam, đậu tương là cây công nghiệp, cây thực phẩm ngắn ngày
có giá trị dinh dưỡng cao dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn chăn nuôi. Chính
vì vậy đậu tương đang là một trong 10 chương trình ưu tiên phát triển của ngành nông
nghiệp nước ta. Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học sau: Protein (40%),
lipit (12-25%), gluxit (10 - 15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các

vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzym, sáp, nhựa, cellulo. Đậu tương được coi là một
nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các axit amin không
thay thế cần thiết cho cơ thể như: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin,
tryptophan, valin.
Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô
hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, giá đậu tương, sữa đậu nành
Trên thế giới, ngoài các sản phẩm từ đậu tương như trên thì đậu tương lên men được sử
dụng rất phổ biến dưới các dạng thực phẩm như natto, miso (Nhật Bản), sufu (Trung
Quốc), tempeh (Indonesia), Doenjang (Hàn Quốc). Đậu tương lên men không những
gia tăng giá trị dinh dưỡng mà còn giảm rất nhiều các chất kháng dinh dưỡng như
trypsin và chymotrypsin. Đó là lý do vì sao ăn các thực phẩm từ đậu tương lên men
không bị chướng bụng, đầy hơi như ăn các sản phẩm từ đậu tương không lên men.
Những nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây cho thấy đậu tương có rất nhiều các
hoạt chất sinh học quí và giá trị của chúng được tăng lên rất nhiều khi trải qua quá trình
lên men nhờ vi sinh vật. Ví dụ như thu nhận dịch sữa đậu tương nảy mầm giàu
isoflavon có hoạt tính sinh học cao (daidzein, genistein) và vitamin E; axit gamma -
aminobutyric (GABA); peptit có khả năng kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin
Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện ra đậu tương lên men còn rất giàu chất kìm
hãm α - glucosidase.
I.3. Cơ sở khoa học của việc sử dụng chất kìm hãm α – glucosidaza để điều trị
bệnh tiểu đường.
Bệnh đái tháo đường còn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển
hóa cacbonhydrat khi hoóc môn insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong
cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7 mmol/l. Hiện nay tỷ lệ tử vong
của bệnh tiểu đường xếp thứ ba sau ung bướu, tim - mạch máu não. Theo Tổ chức
WHO, năm 1985 trên thế giới ước tính có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường.
Sau 10 năm (năm 1994) con số này lên đến 110 triệu người. Năm 2000 có trên 180
triệu người và con số này dự báo sẽ tăng xấp xỉ 370 triệu người vào năm 2030 [8].
Bệnh nhân tiểu đường được phân thành hai nhóm:
Tiểu đường typ 1 hay còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin: do tuyến tụy không

hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên phải tiêm hoặc uống insulin.
Tiểu đường typ 2 hay còn gọi là tiểu đường không lệ thuộc insulin: chiếm tỷ lệ
chủ yếu của bệnh tiểu đường. Cơ thể người bệnh vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ
khiến đường không được đưa vào tế bào mà chỉ lưu hành trong máu. Muốn điều trị
bệnh này người ta chỉ cần áp dụng một chế độ ăn uống hợp lý là kiềm chế được bệnh.
Các thuốc chữa bệnh tiểu đường được chia làm 6 nhóm gồm: biguanides,
sulphonylurea, glinidines, thiazolidinediones, chất kìm hãm dipeptidyl peptidase IV và
chất kìm hãm α – glucosidaza (AGIs). Hiện nay, một loạt các chất kìm hãm enzym α -
glucosidaza được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường như voglibose (U.S. Pat. No.
6,200,958), acarbose (U.S. Pat. No. 5,643,874), miglitol (U.S. Pat. No. 4,639,436).
Hình 1.1. Ảnh hưởng của chất kìm hãm α - glucosidaza đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể
Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng chất
kìm hãm α-glucosidaza để điều trị bệnh tiểu đường như sau: tinh bột hoặc đường
(sucrose) là một chất dinh dưỡng quan trọng còn được gọi là carbohydrate. Cấu tạo của
nó gồm hai hay nhiều monosaccharide (glucose hoặc fructose). Để cơ thể người hấp
thụ được, carbohydrate sẽ phân cắt hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống
enzym tiêu hóa. Dưới tác dụng của amylase, tinh bột bị phân cắt thành maltose.
Sucrose và maltose là các disaccharide. Dưới tác dụng của α - glucosidaza chúng sẽ bị
phân cắt thành các monosaccharide tại ruột non. AGIs có thể kìm hãm α-glucosidaza
nên ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp
insulin diễn ra dễ dàng hơn [28].
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chất kìm hãm α-glucosidaza có tác dụng gia
tăng nồng độ peptit - 1 dạng glucagon (GLP-1) và peptit-2 dạng glucagon (GLP-2)
trong huyết tương. GLP-1 và GLP-2 là các hormon được sinh ra từ tế bào L nội tiết
Tinh bột
(nhiều phân tử glucose)
Mạch máu
nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kết. GLP-1 kích thích sự tiết insulin
phụ thuộc glucoza và sự sinh sôi tế bào beta. GLP-2 cải thiện cấu trúc và chức năng

của ruột non bằng cách tăng cường cấu trúc của lông nhung và tăng hoạt tính vận
chuyển và enzym. GLP-2 làm giảm sự viêm ruột. GLP-1 và GLP-2 được tạo ra khi có
sự kích thích thần kinh, hormon hoặc các yếu tố dinh dưỡng. Chất kìm hãm α-
glucosidaza là một chất kìm hãm α-glucosidaza tự nhiên có khả năng ngăn cản sự phá
hủy cacbonhydrat nên kéo dài thời gian có mặt của cacbonhydrat trong ruột. Do vậy
một lượng lớn cacbonhydrat sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và tương tác với tế
bào L làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP-2. Người ta cho rằng khi có mặt glucoza ở ngoại
biên ruột non, glucoza sẽ bị lên men tạo các axit béo chuỗi ngắn kích thích sự sản xuất
và tiết GLP-1 và GLP-2 hoặc quá trình vận chuyển glucoza phụ thuộc vào Na khi qua
màng tế bào L sẽ kích thích sự tiết GLP-1 và GLP-2. Nồng độ GLP-1 trong huyết
tương tăng sẽ thúc đẩy quá trình kiểm soát glycemic và cản trở sự có mặt glucoza trong
máu.
I.4. Chất kìm hãm α – glucosidaza (AGIs) từ vi sinh vật
AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: chiết xuất từ thực
vật (từ hoa Punica granatum, 1-deoxynojirimicin hay DNJ từ lá dâu), tổng hợp bằng
con đường hóa học (sulfonamit và các dẫn xuất của xanthon) hoặc bằng con đường
sinh học nhờ các vi sinh vật. Tuy nhiên, để sản xuất AGIs ở quy mô lớn bằng con
đường chiết xuất tự nhiên rất tốn kém và không đơn giản, mặt khác AGIs được tổng
hợp theo con đường hóa học lại có nhược điểm là gây một số tác dụng phụ như rối loạn
chức năng gan và các triệu chứng đau dạ dày cho người sử dụng. Do vậy việc sản xuất
AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cũng
như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ
thể sống. Hiện nay một số chủng vi sinh vật như: Aspergillus oryzae, Streptomyces,
Actinoplanes và Flavobacterium saccharophilium, Saccharomyces cerevisiae đã
được nghiên cứu là rất thích hợp cho sinh tổng hợp AGIs [23, 33]. Một số AGIs phổ
biến như: acarbose - một pseudo-tetrasaccharite được thu nhận từ canh trường lên men
Actinoplanes spp. SE-50. Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var. limoneus.
Adiposin, trestatin B, cyclophellitol và CKD-711 được lấy từ Streptomyces calvus TM-
521, Streptomyces dimorphogenes và Phellinus spp [33]. Tuy nhiên, AGIs từ A. oryzae
là hướng nghiên cứu mới.

I.5. A. oryzae và lên men bề mặt
I.5.1. Dinh dưỡng của A. oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Bào tử của A.
oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin. A. oryzae tiết ra môi trường
các enzym thủy phân như cellulase, pectinase, xylanase và hemicellulase khi sống trên
môi trường có nguồn cơ chất tương ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose nên
A. oryzae đã được ứng dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và
trong công nghiệp sản xuất các enzym. Ở Nhật Bản A. oryzae được sử dụng trong quá
trình sản xuất thức ăn như xì dầu, rượu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzym. Ở
Việt Nam A. oryzae được sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tương. Năm 2001, bộ
gen di truyền của A. oryzae đã được phân tích và giải mã. Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc
thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005)
(Hình 1.2).
Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen của A. oryzae (Machida et al., 2005)
Theo khóa phân loại của Klich: A. oryzae có đặc điểm phát triển khác nhau khi
nuôi cấy trên các môi trường như czapek, czapek yeast agar (CYA25), czapek yeast
agar with 20% sucrose (CY20S), malt extract agar (MEA), rất hiếm loài sinh hạch
nấm. Quan sát qua kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 thấy đặc điểm hình thái của A.
oryzae như: 1 hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá có hình quả lê, hình chùy hoặc hình
cầu , đường kính từ (8) 22-50 (90) µm; cuống sinh bào tử nhẵn hoặc sần sùi, kích
thước từ 500-2500 (5000) µm. Bào tử trần hình cầu đến hình trứng, nhẵn đến có gai
nhẹ, đường kính (3,5) 4-8,5 (10) µm.
A. oryzae là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có khả năng thu
nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá
trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào. A. oryzae là loài hiếu khí hoàn toàn
và có kiểu cacbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, có nghĩa là có khả năng phân giải
xác sinh vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng.
* Nguồn cacbon
A. oryzae có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và không có những

đòi hỏi nghiêm ngặt đối với một loại thức ăn cacbon. Nhiều loài nấm mốc còn có khả
năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều sinh vật
khác (các hợp chất n-alcal, ancaloid, phenol, nhiều chất kháng sinh ). Đối với nguồn
thức ăn hữu cơ phức tạp như: xilan, tinh bột, xenlulo, kitin trước hết A. oryzae phải
sinh ra các enzym để phân huỷ các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau
đó mới đồng hoá được chúng.
* Nguồn nitơ
Các loài A. oryzae khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn
nitơ. A. oryzae thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ.
* Các nguyên tố khoáng
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định được tất cả
các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố đại lượng, có thể kể đến:
S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm trọng
lượng khô. Các nguyên tố vi lượng có Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B. Hàm lượng các
nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay đổi tuỳ thuộc và điều kiện
nuôi cấy, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy.
I.5.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá lên men bề mặt
* Nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi nấm, nó cũng
tác động đến việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng. Mỗi loài nấm mốc có
khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định. Phần lớn nấm mốc phát triển
trong khoảng 15 - 32
0
C và sinh trưởng tốt nhất ở khoảng 25 - 30
0
C.
* Độ ẩm
Mọi quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật đều xảy ra trong môi trường
nước. Tuy nhiên nhu cầu về nước đối với từng loài, từng chủng và thời kỳ phát triển
khác nhau có khác nhau. Trong những nhân tố tác động vào sự phát triển của nấm mốc,

độ ẩm có vai trò rất lớn. Độ ẩm của môi trường cũng như độ ẩm tương đối của không
khí là yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào
tử.
* Độ thoáng khí
A. oryzae hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển được trong điều kiện thoáng khí.
Một lượng nhỏ khí cacbon là cần thiết cho bào tử Aspergillus nảy mầm nhưng nếu
nồng độ này quá cao lại kìm hãm sự phát triển của chúng. Khi nuôi cấy nấm mốc bằng
phương pháp bề mặt cần chú ý tới độ dày khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí
cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc.
* pH môi trường
pH của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của A. oryzae. Phần nhiều
A. oryzae phát triển trong phạm vi pH từ 4 - 8 nhưng một số nấm mốc có khả năng chịu
được những cơ chất có pH axit hơn hoặc kiềm hơn. Tuy nhiên khi dùng phương pháp
nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của nấm mốc vì môi trường rắn có tính đệm cao.
I.6. Tình hình nghiên cứu và thử nghiệm chất kìm hãm α – glucosidaza từ đậu
tương lên men ở ngoài nước
Kaisa và cộng sự đã nghiên cứu để tìm ra các loại thực phẩm ngăn chặn bệnh tiểu
đường. Họ đã kiểm tra hơn 100 loại chất chiết từ thực phẩm với mục đích kìm hãm các
enzym tiêu hoá và cuối cùng họ đã tìm thấy một loại chất chiết từ đậu tương lên men
bằng các chủng Aspergillus sp. có khả năng kìm hãm α - glucosidaza. Loại đậu tương
lên men này gọi là touchi và do vậy chất chiết đó còn được gọi là chất chiết touchi
(TE-touchi extract).
Touchi là một loại đậu tương lên men truyền thống bằng chủng nấm mốc A.
oryzae không sinh độc tố, an toàn với con người và động vật kinh tế - là thực phẩm
truyền thống rất được yêu thích của người Trung Quốc, sau đó được đưa vào Nhật Bản
và đã được sử dụng làm thực phẩm hơn 3000 năm ở hai nước này [13]. Công ty
Nippon của Nhật Bản - một Công ty nổi tiếng chuyên cung cấp các chất bổ sung cho
sản xuất thực phẩm chức năng đã sản xuất được AGIs từ đậu tương lên men. Trong
phần giới thiệu của mình, Nippon đã dẫn hàng loạt các nghiên cứu khoa học của Fujita

chứng minh về hiệu quả và tính an toàn của AGIs được chiết từ đậu tương lên men
[29]. Vào tháng 6 năm 2008, chất chiết touchi đã được cấp phép vào thị trường Châu
Âu, một thị trường nổi tiếng về sự quản lý nghiêm ngặt các loại sản phẩm thực phẩm.
Sản phẩm này đã nhận được sự đánh giá cao của Uỷ ban cố vấn Thực phẩm và Chế
biến Hội đồng chung châu Âu. Hiện nay, chất chiết touchi được sử dụng rộng rãi
không chỉ ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc mà cả ở các nước Châu Âu. Trung Quốc
có hàng trăm công ty sản xuất chất chiết đậu tương lên men để cung cấp cho ngành chế
biến thực phẩm chức năng. Và một điều quan trọng là hoạt tính kìm hãm enzym α –
glucosidaza chỉ được tìm thấy ở đậu tương lên men bởi các chủng nấm mốc
Aspergillus sp mà không có trong đậu tương lên men bằng chủng Bacillus subtilis
natto để tạo ra nato, một món ăn truyền thống nổi tiếng của Nhật Bản.
Jing Chen và cộng sự [23] đã nghiên cứu công nghệ sản xuất AGIs từ chủng nấm
mốc A. oryzae, Actinomucor elegans và Rhizopus arrhizus ở quy mô phòng thí nghiệm.
Nhóm tác giả cho rằng sự hình thành AGIs không phụ nhiều vào nguyên liệu đậu
tương mà lại bị ảnh hưởng bởi chủng vi sinh vật cũng như các yếu tố công nghệ. Khi
lên men trên các loại đậu tương khác nhau, hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza không có
sự khác biệt đáng kể. Đồng thời, nồng độ muối NaCl trong quá trình ủ chín đậu tương
lên men cũng quyết định đến sự hình thành AGIs nhiều hay ít. Nồng độ muối từ 10-
12,5% đã làm giảm khả năng hình thành AGIs một cách đáng kể (gần 50%). Tác giả
cho rằng điều này là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt về hoạt tính kìm hãm α -
glucosidaza ở 31 loại đậu tương lên men được thu thập có nguồn gốc khác nhau ở
Trung Quốc.
Khả năng kìm hãm α-glucosidaza trong quá trình lên men đậu tương không
những phụ thuộc vào chủng vi sinh vật lựa chọn mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu
tố như thời gian nuôi cấy, độ ẩm cơ chất, pH ban đầu Bởi vậy việc tối ưu hóa quá
trình nuôi cấy có ý nghĩa cho việc sản xuất AGIs.
Công nghệ chiết suất và thu hồi AGIs là một công nghệ quan trọng trong sản
xuất. Kawabata và cộng sự [24] đã nghiên cứu thăm dò một số dung môi để chiết AGIs
từ đậu tương lên men, tuy nhiên hiệu suất tách chiết còn phụ thuộc vào tỷ lệ dung môi/
cơ chất, nhiệt độ và thời gian, kết quả cho thấy rằng khi chiết bằng nước, cồn hoặc

hoặc hỗn hợp cồn:nước tỷ lệ 1:5 hoặc 5:1 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza cao,
nhiệt độ và thời gian chiết là 40
0
C - 60
0
C trong 12 - 20 giờ hoặc 100
0
C-140
0
C trong 1-3
giờ. Tác giả cũng đã nghiên cứu một số phương pháp để cô đặc và tinh sạch sản phẩm.
Để cô đặc sản phẩm tác giả đã sử dụng một số dung môi hữu cơ có cực như methanol,
ethanol, propanol, ethyl axetate, hexan…và sử dụng các phương pháp như sắc ký cột,
sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp…để tinh sạch sản phẩm.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chứng minh AGIs từ đậu tương lên men là
an toàn qua các thử nghiệm trên chuột và người. Nó được sử dụng trước bữa ăn để cản
trở quá trình thuỷ phân cacbonhydrat trong ruột non. Các kết quả nghiên cứu của
Hiroyuki Fujita và cộng sự [18] cho thấy chất chiết từ đậu tương lên men bởi A. oryzae
có tác dụng kìm hãm α-glucosidase nhưng lại không kìm hãm các enzym tiêu hóa khác
như amylase, protease, pepsin, trypsin, chymotrypsin hoặc lipase. Hiện nay người ta
chưa phát hiện ra một tác dụng phụ nào về tiêu hoá như: chướng bụng, đau bụng đầy
hơi, nôn mửa khi sử dụng sản phẩm này. Chất chiết touchi còn có tác dụng điều hoà sự
hoạt động của các enzym tiêu hóa trong ruột non nên nó là một sản phẩm an toàn và có
lợi cho tiêu hoá. Các chỉ số về cân nặng hay chiều cao không thay đổi. Chất chiết
touchi có hàm lượng đường thấp và có lượng lớn các chất béo không bão hòa như axit
alpha-linolenic (axit béo omega-3) có tác dụng hạ triglycerit máu và LDL–cholesterol,
đây là 2 chỉ số lipit có hại hay tăng ở những bệnh nhân đái đường. Vì thế, đây là một
tác dụng có lợi cho bệnh nhân tiểu đường. Ngoài ra chất xơ chứa trong sản phẩm đậu
tương lên men sẽ hình thành một lớp màng mỏng giúp hấp thu glucoza chậm hơn do đó
làm chậm tốc độ tiêu hóa tại dạ dày và việc gắn glucoza tại ruột non. Lên men đậu

tương bằng chủng A. oryzae đã cải thiện chất lượng dinh dưỡng thực phẩm từ đậu
tương. Sau 48 giờ lên men đậu tương bằng chủng A. oryzae đã loại được phần lớn chất
kìm hãm tripsin, hàm lượng protein thô tăng và lượng axit amin tự nhiên không thay
đổi so với đậu tương sống và các loại thức ăn từ đậu tương thông thường khác. Hàm
lượng các mạch peptit cỡ nhỏ (< 20 kDa) tăng, không chứa các mạch peptit lớn (>
60kDa) thay vì 22,1% ở đậu tương thông thường.
Hiroyuki Fujita và cộng sự [17] đã thử nghiệm chất chiết touchi trên chuột ở liều
100 mg/kg và 500 mg/kg. Kết quả cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm so với
nhóm đối chứng (n=10) sau 15 - 60 phút nạp sucrose. Hàm lượng glucose trong máu
giảm tương ứng là 17.96 ± 0,42 và 16,76 ± 0,39 mmol/l khi so sánh với nhóm chuột
đối chứng là 19,91 ± 0,58 mmol/l. Nhóm tác giả này cũng đã thử nghiệm trên người
bệnh tiểu đường [19]. Để xác nhận sự an toàn, 9 người khỏe mạnh đã được uống
3g/ngày trong 12 tuần. Kết quả là không có sự thay đổi về đường huyết và các chỉ số
hóa sinh máu, cân nặng…Để đánh giá hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza trong chế
phẩm, 18 bệnh nhân tiểu đường typ 2 đã được thử nghiệm với liều 0,9 g/ngày
(0,3g/bữa ăn) trong 6 tháng. Kết quả cho thấy hàm lượng đường máu ban đầu là 9,31 ±
0,71 mmol/l và HbA
1c
: 10,24 ± 0,58%. Sau 6 tháng thử nghiệm, hàm lượng đường máu
giảm còn 8,61 ± 0,66 mmol/l, HbA
1c
: 8,96 ± 0,3%, chỉ số mỡ máu và tổng cholesterol,
triglycerit cũng giảm, những chỉ tiêu hóa sinh khác như GOT, GPT, urea, calcium. Hơn
nữa, enzym tiêu hóa không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình thử nghiệm.
Trong một công bố khác, Hiroyuki Fujita và cộng sự [18] đã thử nghiệm trên 8
bệnh nhân có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường và 4 bệnh nhân tiểu đường. Những đối
tượng có nguy cơ mắc tiểu đường được cho uống chất chiết touchi với liều lượng từ 0,1
đến 10,0 g trước khi ăn 75g sacarose. Kết quả cho thấy sự kìm hãm hàm lượng glucose
trong máu sau bữa ăn được quan sát thấy sau 60 và 90 phút tiêu thụ sacarose. Ở nhóm
bệnh nhân tiểu đường được dùng 0,3g chất chiết touchi trước khi ăn 200g cơm, chất

chiết touchi thể hiện tác dụng giảm đường huyết có ý nghĩa với liều sử dụng thấp nhất
là 0,3 g, đường huyết sau bữa ăn giảm có ý nghĩa tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau
khi ăn, so sánh với đối chứng không uống chất chiết touchi. Cả các đối tượng có nguy
cơ mắc tiểu đường và các bệnh nhân tiểu đường đều không có bất cứ tác dụng phụ nào
như đau bụng, buồn nôn, phù hoặc đầy hơi sau khi ăn chất chiết touchi, không quan sát
thấy sự bất thường trong máu hay các chỉ số sinh hóa. Do đó, tác giả khuyến cáo chất
chiết touchi có thể được sử dụng để ổn định đường huyết ở người bệnh tiểu đường
trong thời gian dài. Chính vì những lý do trên mà Cơ quan Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm của Mỹ và Hội Bảo vệ sức khoẻ của Nhật Bản đã khuyến cáo sử dụng sản
phẩm có chứa chất AGIs từ đậu tương lên men như một thực phẩm chức năng để
phòng chống bệnh tiểu đường.
I.7. Tình hình nghiên cứu và thử nghiệm chất kìm hãm α – glucosidaza từ đậu
tương lên men ở Việt Nam
Ở Việt Nam có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường trong đó có tới 65%
người phát hiện bệnh muộn. Dự tính đến năm 2025 có khoảng 7 triệu người mắc bệnh
tiểu đường, trong đó đái tháo đường type 2 chiếm trên 90s Những năm gần đây, trên thị
trường có rất nhiều loại thực phẩm chức năng, trong đó loại thực phẩm chức năng dùng
cho người bệnh tiểu đường có giá từ hơn trăm nghìn đến vài triệu như: viên giáp xác
Tianshi, tảo xoắn Tianshi, oyster Plus, tinh dầu hoa anh thảo, đông trùng hạ thảo …
được bày bán và quảng cáo có khả năng chữa khỏi bệnh. Tuy nhiên, do mới phổ biến ở
Việt Nam nên việc quản lý loại sản phẩm này còn nhiều bất cập. Thêm vào đó, lợi
dụng sự thiếu hiểu biết của người tiêu dùng, một số nhà phân phối đã quảng cáo quá
tác dụng khiến nhiều người hiểu sai và dùng sai thực phẩm chức năng.
Hiện nay để chữa bệnh tiểu đường người ta thường dùng các nhóm thuốc là
sulphonylurea và biguanidses với mục đích làm tăng hiệu lực tác dụng của insulin, tăng
tính thấm màng tế bào với glucose. Ngoài ra, các thuốc dùng để kìm hãm α –
glucosidaza cũng được sử dụng nhiều, nhưng các thuốc này chủ yếu thường được chỉ
định cho những người đã mắc bệnh, trong khi đó xu hướng chung là tìm cách phòng
bệnh.
Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và sản xuất thực

phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường như rau má tan, chanh leo hòa tan có chứa
xylooligosaccharide (XOS) [9]; trà dâu uống liền, trà dâu túi lọc chứa 1-
deoxynojirimicin (DNJ) [2], đường chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ thịt quả
chuối [7]. Công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng chứa protein giàu crom hữu cơ từ
nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng phòng chống bệnh tiểu đường typ 2
cũng đã và đang được nghiên cứu [5]. Trương Hương Lan và cộng sự [3] đã xác định
được một số nguyên liệu giàu chất chức năng (đại mạch, vừng trắng, mướp đắng) sử
dụng cho sản xuất thức ăn có tác dụng làm giảm hàm lượng đường trong máu. Các
nghiên cứu về đậu tương lên men mới chỉ tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng natto
(Nguyễn Thùy Châu và cộng sự) hoặc tạo thực phẩm chức năng giàu nattokinaza
(Nguyễn La Anh) hay tạo sản phẩm chức năng chứa peptit chuyển hóa angiotensin
(ACEIP) [2]. Nguyễn Văn Nguyện đã nghiên cứu công nghệ chiết xuất touchi từ đậu
tương bằng phương pháp lên men vi sinh vật. Tuy nhiên, nghiên cứu này mới chỉ dừng
ở mức thăm dò công nghệ chiết xuất touchi mà chưa có điều kiện nghiên cứu sâu hơn
về các yếu tố khác của công nghệ lên men và các phương pháp tách, thu hồi chất kìm
hãm α - glucosidaza, chưa thử nghiệm trên động vật và trên người vì vậy chưa thể ứng
dụng vào thực tiễn.
II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm α-
glucosidaza và nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu
tương.
1.1. Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung và phương pháp nghiên cứu.
1.2. Phân lập các chủng nấm mốc để lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α-
glucosidaza.
1.3. Tuyển chọn 2-3 chủng nấm mốc có khả năng lên men tạo chất kìm hãm α-
glucosidaza và nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc tuyển chọn.
.
1.4. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử định tên chủng nấm mốc tuyển chọn bằng
phương pháp khuyếch đại đoạn ADN chứa vùng ITS1 - 5,8S- ITS2 (đến mức độ loài).
1.5. Nghiên cứu xác định một số yếu tố thích hợp (thành phần môi trường, độ ẩm môi

trường, tỷ lệ giống mốc, nhiệt độ, thời gian, phương pháp sấy ) cho quá trình nuôi cấy
tạo chế phẩm nấm mốc cho lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza.
Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình công nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm
α - glucosidaza.
2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đậu tương đến khả năng tạo chất kìm hãm α-
glucosidaza của chủng nấm mốc tuyển chọn.
2.2. Khảo sát khả năng lên men tạo chất kìm hãm α-glucosidaza của chủng nấm mốc
lựa chọn trên môi trường đậu tương.
2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ tới quá trình lên men bề mặt tạo
chất kìm hãm α – glucosidaza của nấm mốc.
- Qúa trình lên men sơ cấp: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian
nuôi cấy, tỷ lệ giống, độ thông khí đến sự phát triển của nấm mốc và khả năng tạo chất
kìm hãm α - glucosidaza.
- Quá trình lên men thứ cấp:
+ Khảo sát nồng độ muối bổ sung vào đậu tương lên men.
+ Khảo sát nhiệt độ lên men tạo sản phẩm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza.
+ Khảo sát thời gian ủ chín tạo sản phẩm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza.
2.4. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza bằng
phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Nội dung 3: Nghiên cứu quy trình tách chiết, thu nhận chất kìm hãm α-
glucosidaza từ đậu tương lên men
3.1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết xuất.
3.2. Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thu nhận chất kìm hãm
α-glucosidaza bằng phương pháp ly tâm (vận tốc, nhiệt độ, thời gian ly tâm).
3.3. Lựa chọn các phương pháp thu nhận chất kìm hãm α-glucosidaza: phương pháp
sắc ký, sử dụng một số dung môi hữu cơ phân cực
3.4. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sấy sản phẩm và xác định các điều kiện tối ưu
của quá trình sấy để chế phẩm tạo ra duy trì được hoạt tính kìm hãm α- glucosidaza.
3.5. Xác định tính ổn định của chất kìm hãm α-glucosidaza: bao bì đóng gói, nhiệt độ,
ánh sáng, thời gian bảo quản.

Nội dung 4: Sản xuất thử chất kìm hãm α – glucosidaza quy mô 50 kg nguyên
liệu/mẻ và ứng dụng cho sản xuất một số thực phẩm chức năng.
4.1. Hoàn thiện các thông số công nghệ của qui trình sản xuất và sản xuất thử chất kìm
hãm α- glucosidase qui mô 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng cho sản xuất thực phẩm
chức năng.
4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kìm hãm α-glucosidaza đến một số enzym tiêu
hóa như: trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipaza.
4.3. Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α- glucosidaza cho sản xuất viên thực phẩm
chức năng.
4.3.1. Nghiên cứu công thức phối chế để tạo chế phẩm viên nén chứa

chất kìm
hãm α - glucosidaza.
4.3.2. Xác định tính ổn định của sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng,
thời gian bảo quản.
4.3.3. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất viên thực phẩm chức năng chứa chất
kìm hãm α- glucosidaza.
4.4. Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α- glucosidaza cho sản xuất trà hoà tan.
4.4.1. Nghiên cứu công thức phối chế để tạo sản phẩm trà hòa tan chứa chất kìm
hãm α- glucosidaza.
4.4.2. Xác định tính ổn định của sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng,
thời gian bảo quản.
4.4.3. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất trà hòa tan.
4.5. Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α - glucosidaza cho sản xuất bột dinh dưỡng
chức năng.
4.5.1. Nghiên cứu tỷ lệ phối hợp chất kìm hãm α - glucosidaza trong công thức
sản xuất bột chức năng.
4.5.2. Xác định tính ổn định của sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng,
thời gian bảo quản.
4.5.3. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất bột chức năng chứa chất kìm hãm α-

glucosidaza.
Nội dung 5: Nghiên cứu thử nghiệm chất kìm hãm α-glucosidaza. Xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở và công bố chất lượng sản phẩm tại Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm
- Bộ Y tế.
5.1. Đánh giá chất lượng sản phẩm: cảm quan, hoạt tính kìm hãm α – glucosidaza IC
50
,
hàm lượng protein, lipit, độ ẩm.
5.2. Đánh giá tính an toàn của sản phẩm: phân tích các chỉ tiêu lý, hóa, vi sinh vật, kim
loại nặng, độc chất của sản phẩm.
5.3. Xác định độc tính cấp của chất kìm hãm α – glucosidaza trên động vật.
5.4. Xác định độc tính bán trường diễn của chất kìm hãm α – glucosidaza trên động
vật.
5.5. Thử hiệu quả giảm đường huyết của chất kìm hãm α – glucosidaza trên động vật.
5.6. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của chất kìm hãm α – glucosidaza trên
các đối tượng tiểu đường:
- Sàng lọc đối tượng.
- Cho đối tượng dùng sản phẩm và theo dõi chế độ ăn, biểu hiện sức khỏe trong suốt
quá trình can thiệp.
- Đánh giá hiệu quả giảm đường máu trên bệnh nhân tiểu đường.
- Đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm đến các chỉ số chức năng gan, thận (GOT, GPT,
Ure ) trên bệnh nhân tiểu đường.
- Đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm đến các chỉ số chức năng mỡ máu (Cholesterol,
triglycerit, HDL- Cholesterol, LDL- Cholesterol).
5.7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho 03 sản phẩm thực phẩm chức năng.
5.8. Công bố chất lượng tại Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Bộ Y tế trên cơ sở các
số liệu phân tích về thành phần dinh dưỡng, các chất chức năng có hoạt tính sinh học
của sản phẩm, các kết quả khảo nghiệm trên động vật và kết quả nghiên cứu lâm sàng
trên người.
III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza sẽ được sử dụng trong tất
cả nội dung nghiên cứu của đề tài.
Lựa chọn nguồn α-glucosidaza: Các nguồn α-glucosidaza chính do hãng Sigma
cung cấp là: α-glucosidaza từ Bacillus stearothermophilus, từ gạo, từ Saccharomyces
cerevisiae và intestinal acetone powder từ chuột. Một số công trình nghiên cứu đã làm
sáng tỏ rằng hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza khác nhau khi sử dụng α-glucosidaza có
nguồn gốc khác nhau. Với mục tiêu của đề tài là tạo được chất kìm hãm α-glucosidaza
và ứng dụng cho bệnh nhân tiểu đường nên chúng tôi lựa chọn α-glucosidaza từ chuột
cho các thí nghiệm định tính và định lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza.
Có hai phương pháp định lượng thường được sử dụng để xác định hoạt tính kìm
hãm α-glucosidaza:
Phương pháp 1: tiến hành theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006). Nguyên lý:
4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside α-glucosidaza α-D-glucose + 4-nitrophenol
Hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza được xác định bằng đo sự hình thành 4-nitrophenol
bởi α-glucosidaza sau khi phản ứng với 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (4-PNP)
Phương pháp 2: tiến hành theo phương pháp của Miwa và cộng sự. Nguyên lý
Sucrose α-glucosidaza glucose + fructose
Hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza được xác định bằng lượng glucose giải phóng bằng
kit thương mại (glucose test wako) sử dụng nguồn cơ chất sucrose.
Đề tài đã lựa chọn phương pháp 1 do hóa chất dùng trong phương pháp này dễ đặt
mua hơn.
1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm
α-glucosidaza và nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu
tương.
- Đề tài sử dụng các phương pháp vi sinh truyền thống để phân lập các chủng nấm
mốc.
- Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza theo phương
pháp của Yamaki and Mori.
- Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định tên chủng nấm mốc tuyển chọn bằng
phương pháp khuyến đại đoạn ADN chứa vùng ITS1 - 5,8S- ITS2.

- Sử dụng phương pháp vi sinh để xác định thành phần, độ ẩm môi trường, tỷ lệ giống
mốc, nhiệt độ, thời gian thích hợp cho tạo chế phẩm giống mốc khởi động duy trì được
số lượng bào tử và hoạt lực cao, ổn định.
2. Phương pháp nghiên cứu công nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α -
glucosidaza.
- Sử dụng phương pháp xử lý nguyên liệu và lên men bề mặt chủng nấm mốc theo
phương pháp của Jing Chen và cộng sự.
- Xử lý số liệu theo phương pháp toán học thống kê bằng phần mềm ANOVA.
- Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình sinh tổng hợp chất kìm hãm α-glucosidaza.
3. Phương pháp nghiên cứu tách chiết, thu nhận chất kìm hãm α-glucosidaza từ
đậu tương lên men
- Phương pháp tách chiết sử dụng các dung môi phân cực thông dụng.
- Phương pháp thu nhận sử dụng các phương pháp hiện đại như: phương pháp sắc ký,
sử dụng một số dung môi hữu cơ phân cực.
- Thăm dò một số phương pháp sấy cho tạo chất kìm hãm α-glucosidaza dạng bột.
- Đánh giá chất kìm hãm α-glucosidaza sau bảo quản.
4. Phương pháp nghiên cứu công nghệ sản xuất thử chất kìm hãm α – glucosidaza
quy mô 50 kg nguyên liệu/mẻ và ứng dụng cho sản xuất một số thực phẩm chức
năng.
- Sản xuất thử chất kìm hãm α- glucosidaza qui mô 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng
cho sản xuất thực phẩm chức năng dựa trên các kết quả nghiên cứu ở nội dung 2 và 3.
- Sản xuất 20 kg chất kìm hãm α – glucosidaza dựa trên quy trình công nghệ đạt được.
- Đánh giá ảnh hưởng của chất kìm hãm α-glucosidaza đến một số enzym tiêu hóa như:
trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipaza bằng phương pháp thử kìm hãm enzym.
- Lựa chọn các phụ gia thích hợp được sử dụng trong thực phẩm chức năng để tạo các
sản phẩm chứa chất kìm hãm α - glucosidaza.
- Đánh giá tính ổn định của sản phẩm sau bảo quản.
5. Phương pháp thử hoạt tính của chất kìm hãm α-glucosidaza. Xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở và công bố chất lượng sản phẩm tại Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm

- Bộ Y tế.
- Đánh giá chất lượng và tính an toàn của sản phẩm: sử dụng các phương pháp vi sinh,
hóa sinh để đánh giá sản phẩm, cụ thể là:
o Xác định đạm toàn phần bằng phương pháp Kjelhdan.
o Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Sochlex.
o Xác định hàm lượng hydratcacbon theo phương pháp Betrand.
o Phương pháp xác định giá trị IC
50
theo Rammohan S., 2008.
o Phương pháp đánh giá cảm quan: theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79.
o Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884:2005, tổng số nấm
men, nấm mốc theo TCVN 5166-90, E. Coli theo TCVN 6846-2001,
Coliforms theo TCVN 4882:2001, B. cereus theo TCVN 4992:2005, C.
perfringens theo TCVN 4991-2005.
o Xác định độc tố aflatoxin theo TCVN 6685 : 2000 (ISO 14501 : 1998) hoặc
AOAC.
o Xác định độc tính cấp của sản phẩm theo phương pháp của Đỗ Trung Đàm
(theo quyết định 371 BYT/QĐ của Bộ Y tế): đánh giá chỉ số LD trên động
vật.
o Xác định độc tính bán trường diễn của sản phẩm theo hướng dẫn khảo sát
độc tính của thuốc (quyết định 371 BYT/QĐ của Bộ Y tế).