Nghiên cứu xác định hàm lượng Vitamin B1, B6 trong một số loại nấm lớn lấy từ vườn quốc gia Pù Mát Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................... 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN ............................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu về nấm ........................................................................ 4
1.1.2. Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi ........................... 6
1.1.3. Nấm lớn ....................................................................................... 8
1.1.4. Nấm Linh chi ............................................................................... 9
1.1.5. Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài ................................ 10
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6 .................................................. 11
1.2.1. Vitamin B1 ................................................................................. 11
1.2.2. Vitamin B6 ................................................................................. 13
1.2.3. Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể................. 14
1.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 .............................. 16
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp ............................................... 16
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng ..................................................... 17
1.3.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ ....................................... 19
1.3.4. Hệ thống HPLC .......................................................................... 22
1.3.5. Chọn điều kiện sắc ký ................................................................ 25
1.3.6. Tiến hành đo sắc ký.................................................................... 28
1.3.7. Định lượng bằng phương pháp HPLC ........................................ 29
CHƯƠNG 2. KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM .............................................. 37
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ........................................................................ 37
2.2. CHUẨN BỊ HÓA CHẤT.................................................................... 37
2.2.1. Yêu cầu chung ............................................................................ 37


2.2.2. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B1 ....................... 37
2.2.3. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B6 ....................... 38
2.3. LẤY MẪU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH ......... 39

2.3.1. Lấy mẫu và baỏ quản mẫu .......................................................... 39
2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích .............................................................. 39
2.4. CÁCH TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM .............................................. 40
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitami B1 ..... 40
2.4.2. Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B1 ....... 40
2.4.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitamin B6 .... 40
2..4.4. Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B6 ....... 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 42
3.1. KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO PHÉP ĐO HPLC
XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 ................................................................. 42
3.1.1. Khảo sát bước sóng ..................................................................... 42
3.1.2. Khảo sát pha động ...................................................................... 43
3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng .................................................................. 45
3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH
CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 .......................................................... 47
3.2.1. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 ..... 47
3.2.2. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 ..... 48
3.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN, XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT
HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA
VITAMIN B1, VITAMIN B6 ................................................................... 49
3.3.1. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD)
và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B1 .......................... 49
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD)
và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B6 .......................... 51


3.4. ĐÁNH GIÁ SAI SỐ VÀ ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHÉP ĐO DÃY
CHUẨN VITAMIN B1, VITAMIN B6..................................................... 54
3.5. ĐỘ LẶP LẠI TRÊN MẪU NẤM LINH CHI ..................................... 57
3.6. HIỆU SUẤT THU HỒI VITAMIN TRONG CÁC MẪU NẤM ......... 57

3.6.1. Hiệu suất thu hồi Vitamin B1 trong các mẫu nấm ...................... 58
3.6.2. Hiệu suất thu hồi vitamin B6 trong các mẫu nấm ....................... 59
3.7. TỔNG HỢP CÁC ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG PHÂN TÍCH .................. 59
3.8. ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM............... 61
3.8.1. Xác định hàm lượng Viatamin B1 .............................................. 61
3.8.2. Xác định hàm lượng Viatamin B6 .............................................. 63
KẾT LUẬN .................................................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 66
PHỤ LỤC..................................................................................................... 68


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

HPLC

High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

ppm

Part per million

Một phần triệu

ppb

Part per billion

Một phần tỉ

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH
Trang
Bảng:
Bảng 3.1.

Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B1 ............................. 42

Bảng 3.2.

Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B6 ............................. 43

Bảng 3.3.

Kết quả khảo sát pha động của Vitamin B1 ............................... 44

Bảng 3.4.

Kết quả khảo sát pha động của Vitamin B6 ............................... 45

Bảng 3.5.

Kết quả khảo sát tốc độ dòng của Vitamin B1 ........................... 46

Bảng 3.6.

Kết quả khảo tốc độ dòng của Vitamin B6 ................................ 46

Bảng 3.7.

Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 ................. 47

Bảng 3.8.

Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 ................. 48

Bảng 3.9.

Số liệu xây dựng đường chuẩn của vitamin B1 .......................... 49

Bảng 3.10. Số liệu xây dựng đường chuẩn của vitamin B6 .......................... 52
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B1 ....... 55
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B6 ..... 56
Bảng 3.13. Kết quả phân tích các mẫu thử song song .................................. 57
Bảng 3.14. Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B1 ..... 58
Bảng 3.15. Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B6 ..... 59
Bảng 3.16. Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B1 phương pháp HPLC ...... 60
Bảng 3.17. Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B6 phương pháp HPLC ...... 60
Bảng 3.18. Kết quả xác định hàm lượng Vitamin B1 trong nấm linh chi ..... 62
Bảng 3.19. Kết quả xác định hàm lượng Vitamin B6 trong nấm linh chi ..... 64
Hình:
Hình 3.1.

Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 ....... 47

Hình 3.2.

Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 ....... 48

Hình 3.3.

Đồ thị đường chuẩn của vitamin B1 .......................................... 50

Hình 3.4.

Đồ thị đường chuẩn của vitamin B6 .......................................... 52


1
MỞ ĐẦU
Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ có phân tử bé, có cấu tạo hóa
học rất khác nhau do đó các tính chất hóa học cũng như lí học cũng khác
nhau, nhưng chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống
của bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên
30 loại vitamin khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo
và tác dụng sinh lý của chúng.
Vitamin được cung cấp vào cơ thể con người để đáp ứng nhu cầu dinh
dưỡng giúp cơ thể khỏe mạnh. Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin
gây nên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1),
bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gây
khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi. Người thiếu vitamin khi hàm lượng
vitamin trong cơ thể ở mức thấp (bệnh giảm vitamin). Trạng thái giảm
vitamin rất phổ biến ở ngay trong những người mới thoạt nhìn là hoàn toàn
khoẻ mạnh. Có thể gây ra những rối loạn của hệ thần kinh. Họ dễ bị kích
thích, dễ bị mất bình tĩnh do những nguyên nhân rất nhỏ nhặt, họ rất dễ mẫn
cảm với âm thanh của radio, đối với tiếng ồn ào của trẻ con, bị bệnh mất ngủ,
giảm khả năng lao động.
Việc cung cấp không đầy đủ vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hưởng xấu
khơng những với hệ thần kinh mà còn với một loạt cơ quan khác ở trong cơ
thể. Vì thế điều rất quan trọng là khẩu phần ăn của người khoẻ mạnh, và đặc

biệt là người ốm cần phải có giá trị hồn chỉnh khơng những về phương diện
calo, về phương diện chất đạm mà còn về phương diện vitamin nữa . Nhiều
người còn cho rằng vitamin là thần dược chữa ung thư và kéo dài tuổi thọ.
Khoa học hiện nay đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trên
quy mô rộng lớn về vitamin, trong đó vitamin B1 và B6 là một trong những
đối tượng được nghiên cứu.


2
Vitamin B1 còn gọi là thiamine (dưỡng chất năng lượng) có vai trị vơ
cùng quan trọng trong việc duy trì các hoạt động tương tác của tế bào trong cơ
thể, nhất là việc sản xuất năng lượng. Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng
ơxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đường thành năng lượng. Bởi
vậy, nếu khơng có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dưỡng chất này thì hiệu
quả sản xuất năng lượng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vơ hiệu hóa. Ngồi ra,
vitamin B1 cịn có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trước nguy cơ
bị tổn thương và thối hóa.
Vitamin B6 là một loại vitamin hịa tan trong nước và là một phần của
nhóm vitamin B. Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa
tryptophan thành niacin. Nó cịn đóng vai trị quan trọng trong việc chuyển
hóa chất đạm, chất béo,carbohydrate. Sự thiếu hụt vitamin B6 có thể gây ra
nhiều triệu chứng: mệt mỏi, mất ngủ, khó chịu, rối loạn tâm thần, môi nứt nẻ,
da khô, rụng tóc. Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thường chậm lớn và có thể có
những cơn co giật.
Với vai trị và tầm quan trọng đó, vitamin B1 và B6 đã được nghiên
cứu và phát hiện có trong nhiều loại thực phẩm nói chung và trong các loại
nấm Linh chi.
Xuất phát từ chức năng của vitamin nói chung và vitamin B1, B6 nói
riêng trong cơ thể, đồng thời góp phần vào cơng tác đảm bảo chất lượng nấm
dùng để làm dược liệu, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm

lượng vitamin B1, B6 trong một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù
Mát - Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao" làm luận văn
tốt nghiệp của mình.
1. Nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn:
- Xác định các điều kiện tối ưu để đo sắc đồ HPLC của B1, B6.
- Xác định hàm lượng vitamin B1, B6 theo phương pháp ngoại chuẩn.


3
- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
phương pháp phân tích.
- Khảo sát độ lặp.
- Xác định hiệu suất thu hồi.
- Phân tích, xử lý số liệu
- Tính toán kết quả thực nghiệm
2. Đối tượng nghiên cứu: một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù
Mát - Nghệ An
3. Phương pháp nghiên cứu: Các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành
bằng thực nghiệm. Phương pháp thực nghiệm được sử dụng là phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HLC (High Performance Liquid Chromatography).
4. Những đóng góp của đề tài: đã góp phần xác định thành phần dinh
dưỡng của một số loại nấm lớn.


4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN
1.1.1. Giới thiệu về nấm
Nấm là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu lồi (chỉ đứng
sau cơn trùng: 10 triệu lồi về số lượng lồi) trong đó mơ tả được 69.000 loài

sống khắp nơi trên trái đất, bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn.
Sở dĩ nấm được xếp vào giới riêng mà không được xếp vào giới thực
vật hay động vật vì Nấm có nhiều đặc điểm khác thực vật như:
- Khơng có lục lạp, khơng có sắc tố quang hợp nên khơng thể tự động
tạo các chất hữu cơ cho cơ thể khác như thực vật.
- Khơng có sự phân hóa cơ quan thành thân, rễ, lá, hoa.
- Phần lớn nấm không chứa xenlulozo trong vách tế bào mà chủ yếu
bằng Chitin và glucan. Chitin là chất gặp ở động vật nhiều hơn thực vật, chủ
yếu ở nhóm giáp xác và cơn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các
loài này.
- Nấm dự trữ đường dưới dạng glycozen, thay vì tinh bột như thực vật.
Nấm cũng không được xếp vào giới động vật vì:
- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu tính hay vô tính) giống hạt
phấn của thực vật.
- Sự dinh dưỡng của Nấm liên quan đến hệ sợi nấm. Nấm lấy các
chất dinh dưỡng thông qua màng tế bào của sợi nấm (tương tự như cơ chế
ở rễ thực vật)
1.1.2. Phân loại Nấm
Giới Nấm được chia làm 4 giới phụ:
- Giới phụ nấm nhầy - Gymnomycetoida
- Giới phụ nấm tảo - phycomycetoida


5
- Giới phụ estomycetoida
- Giới phụ nấm thật - Eumycetoida
1.1.3. Nấm lớn
Tới thời điểm hiện nay, có khoảng 2500 lồi nấm đã được ghi nhận cho
lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 lồi thuộc 120 chi là những loài
nấm lớn (Macro fungi). Các loài nấm Đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế rõ

rệt với hơn 90% tổng số loài; sau đó là nấm Nang (Ascomycota) chiếm
khoảng 8%; nấm Nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5% và nấm Nội cộng sinh
(Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5%. Trong ngành nấm Đảm thì tuyệt đại
đa số nấm lớn thuộc ngành phụ Agaricomycotina Doweld (2001); chỉ có một
số rất ít loài thuộc 2 ngành phụ Pucciniomycotina R. Baeuer, Beregow…(với
12

loài

thuộc

chi

Septobasidium

thuộc

bộ

Septobasidioles)

và

Ustilagomycotina Doweld (2001) với các lớp thuộc Ustilagomycetes (với 2
đại diện thuộc lớp nấm Than là Ustilago maydis trên ngô và Ustilago
esculenta trên củ niễng đều ăn được) và Exobasidiomycetes (với một vài loài
thuộc chi nấm Đảm ngoài Exobasidium gây bệnh phồng lá). Trong ngành phụ
Agaricomycotina, đại đa số nấm lớn thuộc về lớp Agaricomycetes. Hai lớp
cịn lại chỉ có số lượng loài rất khiêm tốn là Tremellomycetes (17 loài thuộc
bộ Tremellales) và lớp Dacrymycetes ( với 5 loài thuộc bộ Dacrymycetales).

Trong lớp Agaricomycetes, các bộ có số lượng lồi nhiều nhất là
Aphyllophorales sensu lato (hơn 300 loài), Agaricales sensu lato (gần 300
loài), Boletales (gần 60 loài), Russulales (gần 40 loài). Các bộ có ít lồi nhất
là Hymenogastrales (1 lồi), Ceratiomycetales (1 loài).
1.1.4. Nấm linh chi
Nấm linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim
(Ganodermataceae). Nấm linh chi cịn có những tên khác như Tiên
thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung.


6
Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó. Tên
gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay tiếng Nhật là Reishi hoặc
Mannentake, tên gọi Latinh: Ganoderma lucidum.

Linh chi có tới 2000 loại và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum và
Ganoderma zaponicum.
Ở Việt Nam, lồi nấm Linh chi Ganoderma lucidum mới được ni
trồng thành cơng trong phịng thí nghiệm (1978). Năm 1994 lồi nấm lim một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng Lim Bắc Việt đã được Phạm
Quang Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động. Đến hiện nay, việc nuôi trồng nấm
Linh chi đỏ đã được phổ biến tại các trang trại, đặc biệt là các vùng ven thành
phố Huế.
1.1.4.1. Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi
Nấm Linh chi là một dược liệu mà con người từ xa xưa đã biết dùng
làm thuốc. Trong "Thần nông bản thảo" xếp Linh chi vào loại siêu thượng
phẩm hơn cả nhân sâm; trong "Bản thảo cương mục" coi Linh chi là loại
thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện nảo
(bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày); gần đây các nhà khoa học

7
Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi còn có tác dụng phịng và chống
ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ.
Theo y học cổ truyền, nấm linh chi có vị nhạt, tính ấm, có tác dụng tư
bổ cường tráng, bổ can chí, an thần, tăng trí nhớ.
Ở các nước Đông Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài
Loan…) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang được cơng
nghiệp hóa với quy mơ lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào
chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược
lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị nấm
học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New Yord. Qua
phân tích về các mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta
thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch, hô hấp,
tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thư, khả
năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả
năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay do nhiễm
xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ
nào cho cơ thể.
Nấm Linh Chi cơ bản có các loại như sau:


Hồng Chi (cịn gọi là Kim Chi). Nấm có màu vàng, vị ngọt, không

độc, tính bình, an thần, ích tì khí.


Bạch Chi (còn gọi là Ngọc Chi). Đây là loại nấm Linh Chi màu

trắng, có vị cay, tính bình, khơng độc, ích phổi, thông mũi, an thần, trị ho

nghịch hơi.


Thanh chi (cịn gọi là Long Chi). Nấm này có màu xanh, tính bình, vị

chua.Tác dụng làm sáng mắt, ăn thần, tăng trí nhớ, bổ gan khí.


8


Hắc chi (cịn gọi là Huyền Chi). Nấm có màu đen, vị mặn, tính bình,

không độc. Tác dụng trị chứng bí tiểu, ích thận khí.


Tử chi (còn gọi là Mộc Chi). Nấm này có màu tím, vị ngọt, tính bình,

khơng độc. Trị các chứng đau nhức xương khớp và gân cốt.


Linh Chi đỏ (còn gọi là Xích Chi, Đơn Chi, Hồng Chi). Nấm có màu

đỏ tươi khi cịn non, trưởng thành có lớp bào tử màu nâu trên bề mặt. Nấm có
vị đắng, khơng độc, tính bình, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ gan, chữa bệnh tiểu
đường, huyết áp và tim mạch.
Mặc dù có tới 6 loại nấm Linh Chi khác nhau, nhưng tất cả được phân
loại theo màu sắc, y học coi nấm Linh Chi đỏ là loại có dược tính đa dạng và
mạnh nhất, do đó nó là loại Linh Chi được dùng phổ biến nhất trên thế giới.
Vô số các tài liệu, trang web khi đề cập đến nấm Linh chi nói chung, là mặc

định nói về nấm Linh chi đỏ. Nấm Linh chi trồng phổ biến ở Việt nam là nấm
Linh chi đỏ. Loại nấm Linh chi trồng tại Hàn Quốc, Nhật Bản, hay Trung
Quốc, cũng là nấm Linh chi đỏ.Tuy nhiên, chất lượng nấm Linh chi (đỏ) mỗi
nơi mỗi khác nhau do ảnh hưởng bởi các yếu tố về giống, điều kiện môi
trường, phương pháp gieo trồng, cách chăm sóc, thu hoạch...
1.1.4.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của nấm Linh chi
- Nhiệt độ: giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng và phát triển
tốt ở nhiệt độ 2030oC, giai đoạn hình thành quả thể nhiệt độ thích hợp
2228oC.
- Độ ẩm: độ ẩm cơ chất khoảng 6065%. Độ ẩm khơng khí của nhà
ni 8095%.
- Ánh sáng: Giai đoạn ni sợi cần kín gió, độ sáng vừa phải. Giai đoạn
quả thể phát triển: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng đọc sách được), ánh sáng
được cân đối từ mọi phía.


9
- Độ pH: Linh Chi thích nghi trong môi trường trung tính đến axit yếu
(pH 5,5-7).
- Độ thoáng: trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm Linh chi cần
độ thơng thống tốt.
1.1.4.3. Thành phần hóa học Nấm Linh Chi
Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các
hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của nấm linh chi như: Germanium,
acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans,
adenosin, beta-D-glucan, (đặc biệt trong nấm Linh chi, có hàm lượng
germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 - 8 lần). Các nhà khoa học Việt
Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho
sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium, magnesium,

natrium, calcium.
Sau đây là những thành phần hóa học chính của nấm Linh chi:
- Hợp chất đa đường (45% số lượng): arabinogalactane, beta-Dglucane; ganoderane A, B, C.
- Triterpene: axit ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S, và Y.
- Ganodermadiol phân sinh của loại axit lanostaoic.
- Esteroides: Ganodosterone.
- Axit béo chưa bão hòa
- Chất đạm protide: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine).
- Khoáng chất: Ca, Ge, Co, Mg, Fe, Mn, Zn, Be, Cu, Ag, Al, Na…
- Những chất khác: manitole, adenine, trechalose, uracine, lysine…
Qua phân tích về các mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,
người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch,
hô hấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung
thư, khả năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh
chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể


10
hay do nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây
hiệu ứng phụ nào cho cơ thể.
1.1.5. Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài

MN 206: Ganoderma triangulatum

MN 205: Phellinus melanodermus

MN202: Ganoderma applanatum

MN 203: Ganoderma lucidum

MN 210: Phellinus setulosus

MN 201: Hexagonia apiaria


11
MN 207: Nigrofomes melanporus

MN 204: Ganoderma philippii

MN 209: Ganoderma fulvellum

MN 211: Ganoderma lobatum

1.2. GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6
Tên gọi "vitamin" có từ năm 1912 do nhà khoa học Ba Lan Funk với ý
nghĩa đó là những "amin sống". Chúng được chia thành 2 nhóm lớn.
- Các vitamin tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C,
vitamin PP, vitamin P, chủ yếu tham gia vào các quá trình liên quan tới sự
giải phóng năng lượng như q trình oxi hố khử, quá trình phân giải các
hợp chất hữu cơ.
- Các vitamin tan trong dầu: Vitamin A, D, E, K tham gia vào các phản
ứng tạo nên các chất có chức năng cấu trúc các mơ, các cơ quan.
Vitamin nhóm B là hợp chất rất quan trọng trong tế bào sống như là
thành phần cần thiết cho sự phát triển.
1.2.1. Vitamin B1
• Tên gọi khác: Thiamin, aneurine hydrochloride
• Tên IUPAC: 2-[3-[(4-amino- 2-methyl- pyrimidin- 5-yl) methyl]- 4methyl- thiazol- 5-yl] ethanol
• Cơng thức phân tử: C12H17N4OS+Cl-.HCl
• Khối lượng phân tử: 337.27

• pKa1 =4.8, pKa2 =9.0
• Cơng thức cấu tạo:


12

Ngồi ra thiamin cịn tồn tại dưới dạng photphat este gồm
thiaminmonophotphat

(TMP),

thiamin

triphotphat

(TTP),

thiamin

pyrophotphat (TPP) là dạng mà vị trí OH sẽ được đính vào hoặc 1, 2 hoặc 3
gốc photphat (R).
1.2.1.1. Tính chất vật lý
Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, có mùi
đặc trưng. Khi tiếp xúc với khơng khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm
(khoảng 4% nước).
Vitamin B1 có tính axit, hồ tan tốt trong mơi trường nước, axit axetic,
nhưng khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen
hay chloroform và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng.
Vitamin B1 nóng chảy ở 2330C-2520C. Vitamin B1 bền trong mơi trường
axit, cịn trong mơi trường kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng. Trong

mơi trường khơng phân cực vitamin B1 hấp thụ tại 2 bước sóng λmax1=246.9
nm và λmax2 =264.5 nm.
1.2.1.2. Tính chất hóa học
Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe (CN)6] trong mơi trường kiềm tạo
thành thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời, tính chất này
được dùng để xác định B1 bằng phương pháp đo huỳnh quang.
CH2CH2OH

S
N

H3C
N

NH2
CH2

CH2CH2OH
N


N

CH3

N
H3C

Thiamin

N

N

Thiocrom

CH3


13

Thiamin tạo kết tủa khi phản ứng với tannin, thủy ngân (II) clorua,
axit picric.Trong cơ thể, vitamin B1 tham gia vào nhiều phản ứng chuyển
hóa, đặc biệt là chuyển hóa glucid.
1.2.2. Vitamin B6
• Tên IUPAC: 4,5-di (hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol
• Cơng thức phân tử: C8H11NO3.HCl
• Khối lượng phân tử: 169,18 đvC
• pKa1 =2.7, pKa2 = 4.8
• Cơng thức cấu tạo: Vitamin B6 tồn tại trong cơ thể ở 3 dạng khác
nhau: Piridoxol, Pyridoxal, Pyridoxamin. Ba dạng này có thể chuyển hố
lẫn nhau.

1.2.2.1. Tính chất vật lý
Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước
và trong rượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ
nóng chảy ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204 -2060C, bền
vững khi đun nóng. Bền khi đun sơi trong axit hay kiềm, khơng bền trong mơi
trường có tính oxy hóa.
Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu

sáng ở mơi trường kiềm hay trung tính, cịn trong mơi trường axit thì
pyridoxin, pyridoxan và pyridoxamin bền hơn. Tính chất vật lý của vitamin
B6 được tóm tắt ở bảng dưới.


14
Bảng 1.1: Tính chất của 3 dạng vitamin B6
Tên hoạt chất

Pyridoxin.HCl Pyridoxan.HCl Pyridoxamin.HCl

KLPT

205,64

303,63

241,12

CTPT

C8H12ClNO3

C8H9NO3.HCl

C8H12N2O2.HCl

Nhiệt độ nóng chảy (0C)

204 - 206

160

226 - 227

λmax (nm)

292; 290; 253

390; 318

328; 253

1.2.2.2. Tính chất hóa học của vitamin B6
Tất cả 3 chất trên đều có tính bazơ do nhân pyridin gây ra tác dụng với
các axit tạo thành muối. Chế phẩm dược dùng là pyridoxin hydroclohidrat dễ tan
trong nước, tạo muối, kết tủa với axit silicovonframic, axitphotphovonframic, dễ
hòa tan trong các dung dịch kiềm.
Vitamin B6 dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác q trình này là ánh sáng
tia tử ngoại, vitamin B6 tác dụng với Fe (III) cho muối phức màu đỏ. Vitamin
B6 ở dạng dẫn xuất photphat như pyridoxan photphat tham gia nhóm ngoại
(coenzyme) của nhiều men như: transaminase, decacboxylase, dehydro
desylfuarase… tham gia trong các quá trình chuyển hóa axit amin, lipid,
glucid, chuyển protein sang glucid.
Vitamin B6 giữ vai trò đặc biệt trong chuyển hóa acid amin:
COOH
CHNH2

CH3

+

CH2

CO
COOH

COOH

acid aspartic

enzym chứa

COOH
CO

vitamin B6

CH3

+

CH2

CHNH2
COOH

COOH

acid pyruvic

acid oxalacetic

alanin

1.2.3. Vai trị và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể
 Vitamin B1
- Vitamin B1 còn gọi là thiamine (dưỡng chất năng lượng) có vai trị vơ
cùng quan trọng trong việc duy trì các hoạt động tương tác của tế bào trong cơ


15
thể, nhất là việc sản xuất năng lượng. Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng
ôxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đường thành năng lượng.
Bởi vậy, nếu khơng có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dưỡng chất này
thì hiệu quả sản xuất năng lượng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vơ hiệu hóa.
- Vitamin B1 cịn có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trước
nguy cơ bị tổn thương và thối hóa.
- Ngồi ra vitamin B1 cịn hỗ trợ các bộ phận trong cơ thể và hệ thần
kinh ngắt các thông báo truyền gửi cho nhau
- Vitamin B1 chữa một số biểu hiện thần kinh, viêm dây thần kinh (do
rượu, rối loạn tiêu hoá, nhiễm độc do nhiễm khuẩn…) do đau thấp khớp, zona.
Những bệnh về tim và tiêu hoá, gan, đi lỏng, xơ gan, thoái hoá mỡ, trong những
trường hợp nhiễm khuẩn được điều trị bằng kháng sinh, salicylat, sulfamid….
- Nhu cầu về vitamin B1 phụ thuộc vào các điều kiện khác nhau như
trạng thái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn, làm việc… Trung bình cơ thể
người cần từ 200mcg -1,3 mg vitamin B1/ngày.
 Vitamin B6
- Vitamin B6 là một loại vitamin hòa tan trong nước và là một phần của
nhóm vitamin B. Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa

tryptophan thành niacin.
- Nó cịn đóng vai trị quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất
béo, carbohydrate. Vitamin B6 tham gia vào quá trình tổng hợp hemoglobin
và sự bài tiết của tuyến thượng thận.
- Vitamin này còn cần thiết cho phản ứng lên men tạo glucose từ
glycogen, góp phần duy trì lượng đường huyết trong máu ổn định; giúp
bảo vệ tim mạch, tăng cường hệ miễn dịch và duy trì chức năng não
khỏe mạnh.


16
- Thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm
dây thần kinh ngoại vi, viêm da, tăng bã nhờn, khô nứt môi. Vitamin B6 dùng
điều trị nhiễm độc isoniazid hoặc cycloserin.
-

Lượng vitamin khuyến cáo dùng mỗi ngày khác nhau tùy theo giới

tính và độ tuổi và sẽ ngày càng tăng khi già đi. Trung bình cơ thể người cần từ
100mcg -2,0 mg vitamin B6/ngày.
1.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6
Hiện nay có nhiều phương pháp để nghiên cứu xác định hàm lượng
vitamin như: Phương pháp cực phổ, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao, phương pháp phổ đạo hàm bậc, phương pháp trắc quang… Tuy
nhiên, để chọn phương pháp vừa đảm bảo độ chính xác, tính kinh tế và
tính khả thi phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm, thì trong luận văn này
chúng tơi đã chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì nó
có nhiều ưu điểm như: phân tích đồng thời nhiều hợp chất, không cần làm
bay hơi mẫu, độ nhạy, độ phân giải cao, nhanh chóng, dễ dàng kết nối với
khối phổ…

1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),
trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải
tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày
càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành
chế tạo máy phân tích. Hiện nay đây là phương pháp áp dụng rất lớn trong
nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm


17
thuốc, là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép
định tính và định lượng.
Ưu điểm của HPLC:
- Điều kiện phân tích khá dễ dàng.
- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao.
- Độ lặp lại cao.
- Thường không phân hủy mẫu trong quá trình phân tích.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia
dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân
loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Hệ thống sắc ký Alliance với
bơm 2690, detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, Mỹ)
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha
thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi
ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. Nếu
pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa
giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động. Như vậy, nếu
chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C.. Vào cột
phân tích, kết quả các chất A, B, C.. sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua
cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác
F1, F2 và F3.
Chất phân tích A + B + C


18

F1

F2

Pha tĩnh

Pha động
F3

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi
cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong
đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở
đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với
chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là
khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ

khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.Theo cơ chế chia tách một hỗn
hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ của sắc ký, người ta
phân ra các loại sau đây:
- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC).
- Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết (LLC).
- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC).
- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC).
Nhưng thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ
vào phân tích mẫu. Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ
mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp
phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc
vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động
không phân cực.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha
động phân cực.


19
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành cơng để tách các hỗn
hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,
phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau.
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
1.3.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành
sắc ký đồ. Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết
được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng
thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá
trình phân tích sắc ký.
1.3.3.1. Thời gian lưu: Retention time (tR)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất
là hằng định và các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau trên cùng một
điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định
tính các chất.Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì
peak bị dãn và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời
kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung mơi, hố chất, độ chính xác của
phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên.
1.3.3.2. Hệ số dung lượng K’
- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.Thường được


20
tính theo công thức sau:
K’ = t R  t R  t o  t R  1
to

to

to

- Hệ số dung lượng K’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc
tính của pha tĩnh và pha động.

- Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. K’ lớn thì pic bị loãng, độ
nhạy kém. Trong thực tế K’ từ 1 đến 5 là tối ưu.
1.3.3.3. Độ chọn lọc 
Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí. Khi hai chất
A, B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị
ở độ chọn lọc 
α = K’A/K’ B (K’A > K’B)
với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng
1.3.3.4. Số đĩa lý thuyết N
- Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều
kiện sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp
pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một
khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập
giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Vì vậy với
một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất
phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định. Số đĩa lý thuyết N được
tính theo công thức:
 t
t
N =  R   5,54 R
 
w
 
 0,5
2

Trong đó:

2


t
  16 R
w

 b







2

tR là thời gian lưu của chất phân tích
W0,5 là độ rộng tại điểm ½ của peak

1.3.3.5. Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên