Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin b bằng phương pháp tiêm ethanol

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


VŨ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG
PHÁP TIÊM ETHANOL


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


VŨ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG
PHÁP TIÊM ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Văn Lâm
2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Bào chế - ĐH Dược HN
2. Học viện Quân y




HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Trong những dòng đầu tiên, tôi xin phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
ThS. Nguyễn Văn Lâm
ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và hết lòng giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ cùng toàn
thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược
Hà Nội, Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân Y đã giúp đỡ và
tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận.
Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các phòng
ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những
người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã giúp
đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Vũ Thị Quỳnh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Công thức hóa học 2
1.1.2. Đặc tính lý - hóa 2
1.1.3. Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng 2
1.1.4. Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 3
1.2. Liposome 3
1.2.1. Khái niệm 3
1.2.2. Ưu, nhược điểm của liposome 4
1.2.3. Phương pháp bào chế liposome 5
1.2.3.1. Các phương pháp bào chế liposome 5
1.2.3.2. Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol 5
1.3. Liposome Amphoterin B 9
1.3.1. Cấu trúc liposome Amphotericin B 9
1.3.2. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B 12
1.3.2.1. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B trên thế giới 12
1.3.2.2. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B tại Việt Nam 12
1.4. Đông khô liposome 13
1.4.1. Độ ổn định của liposome 13
1.4.2. Quá trình đông khô 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp bào chế liposome Amphotericin B 17

2.3.2. Phương pháp đánh giá liposome Amphotericin B tạo ra 18
2.3.2.1. Phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome
Amphotericin B 18
2.3.2.2. Hiệu suất quy trình (H%) 19

2.3.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome Amphotericin B 19
2.3.3. Đông khô liposome 20
2.3.3.1. Quy trình đông khô liposome Amphotericin B 20
2.3.3.2. Đánh giá liposome Amphotericin B sau đông khô 20
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 20
2.3.5. Điều kiện thí nghiệm 20
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21
3.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Amphotericin B trong
hỗn dịch liposome bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).21
3.1.1. Độ đặc hiệu 21
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 21
3.1.3. Tính tuyến tính 22
3.1.4. Độ chính xác 23
3.1.5. Độ đúng 23
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình
bào chế đến đặc tính của liposome Amphotericin B 24
3.2.1. Ảnh hưởng của yếu tố công thức đến đặc tính của liposome
Amphotericin B 25
3.2.1.1. Vai trò của DSPG trong liposome Amphotericin B 25
3.2.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của liposome Amphotericin
B. 26
3.2.1.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB đến đặc tính của liposome
Amphotericin B 29
3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính
của liposome Amphotericin B. 31

3.2.2.1. Ảnh hưởng của đường kính kim đến đặc tính của liposome
Amphotericin B 31
3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn pha nước. 33
3.3. Bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B. 34
3.3.1. Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome
Amphotericin B trước đông khô. 34

3.3.2. Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome
Amphotericin B sau đông khô. 34
3.3.3. Đề xuất quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin
B 37
3.4. Bàn luận 39
3.4.1. Về phương pháp định lượng Amphotericin B 39
3.4.2. Về phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome Amphotericin B 39
3.4.3. Về công thức bào chế liposome Amphotericin B 40
3.4.4. Về đông khô liposome Amphotericin B 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
STT
Viết tắt
Từ/cụm từ viết tắt
1
AmB
Amphotericin B
2
BP

Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)
3
Chol
Cholesterol
4
DC
Dược chất
5
DĐVN
Dược điển Việt Nam
6
DMA
N,N-dimethylacetamid
7
DMPC
α-Dimyristoylphosphatidylcholin
8
DMPG
l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol
9
DSPG
Distearoylphosphatidylglycerol
10
ĐK
Đông khô
11
HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance
liquid chromatography)
12

HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
(Hydrogennated soy phosphatidylcholine)
13
IC50
Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử
14
KTTP
Kích thước tiểu phân
15
kl/kl
Khối lượng/khối lượng
16
L-AmB
Liposome amphotericin B
17
LTT
Lọc tiếp tuyến
18
NSX
Nhà xản xuất
19
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
20
PL
Phospholipid
21
TB
Trung bình

22
TKHH
Tinh khiết hóa học
23
USP
Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia)
24
SPC
Phosphatidylcholin đậu nành
25
SUV
Liposome đơn lớp nhỏ (small unilamellar vesicle)
26
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc liposome
4
Hình 1.2
Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm
ethanol
6
Hình 1.3

Sơ đồ phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome
7
Hình 1.4
Sơ đồ hệ thống kim phun
9
Hình 1.5
Cấu trúc liposome Amphotericin B
10
Hình 3.1
Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ AmB và
diện tích pic
22
Hình 3.2
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và PDI (B)
trước và sau khi LTT
27
Hình 3.3
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến
hiệu suất quy trình
28
Hình 3.4
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB
đến hiệu suất quy trình.
30
Hình 3.5
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của đường kính kim đến
đặc tính của L-AmB
32
Hình 3.6
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của KTTP trước và sau

đông khô
36
Hình 3.7
Sơ đồ quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô
liposome Amphotericin B
38

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 2.1
Nguyên liệu
16
Bảng 2.2
Chương trình gradient dung môi pha động
18
Bảng 3.1
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí
21
Bảng 3.2
Tương quan giữa nồng độ AmB và diện tích pic
22
Bảng 3.3
Kết quả khảo sát độ chính xác của hệ thống sắc kí
23
Bảng 3.4
Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí
24
Bảng 3.5

Thành phần công thức bào chế và các đặc tính của L-
AmB thu được
25
Bảng 3.6
Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ
lệ Chol/lipid
26
Bảng 3.7
Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của L-
AmB
27
Bảng 3.8
Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ
lệ DSPG/AmB
29
Bảng 3.9
Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB lên các đặc tính của
L-AmB
30
Bảng 3.10
Công thức bào chế hỗn dịch L-AmB
31
Bảng 3.11
Ảnh hưởng của đường kính kim đến các đặc tính của
L-AmB
32
Bảng 3.12
Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn đến đặc tính của
L-AmB
33

Bảng 3.13
Thành phần tá dược tạo khung và đặc tính của L-AmB
trước đông khô
34
Bảng 3.14
Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của
L-AmB sau đông khô
36
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình trạng nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và đau
ốm lâu dài ở những bệnh nhân ung thư và suy giảm miễn dịch. Amphotericin B là
kháng sinh chống nấm phổ rộng, hoạt tính mạnh, được sử dụng phổ biến trong điều
trị hơn 40 năm nay. Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan
trong nước nên sinh khả dụng thấp, đồng thời thuốc có nhiều tác dụng không mong
muốn nhất là trên thận gây khó khăn cho việc sử dụng trong lâm sàng. Vì vậy, bào
chế hệ mang thuốc chứa Amphotericin B giúp giảm độc tính và tăng sinh khả dụng
của thuốc là yêu cầu có ý nghĩa khoa học và tính cấp thiết.
Nhiều hệ mang thuốc chứa Amphotericin B đã được nghiên cứu phát triển và
ứng dụng trong lâm sàng như: phức hợp với cholesteryl sulfate (Amphotec), phức
hợp lipid (Abelcel)… Trong đó, sử dụng liposome làm hệ vận chuyển thuốc cho
thấy có nhiều ưu điểm nổi bật: tăng thời gian lưu thông thuốc trong tuần hoàn, khu
trú tác dụng của thuốc tại cơ quan đích… Đây là một hướng nghiên cứu đầy triển
vọng được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm.
Hiện nay, Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu bào
chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp hydrat hóa film, bốc hơi pha đảo
và bước đầu bào chế bằng phương pháp tiêm ethanol. Để tiếp tục góp phần nghiên
cứu về liposome nói chung và liposome Amphotericin B nói riêng, đề tài “Nghiên
cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphoterin B bằng phƣơng pháp

tiêm ethanol” được tiến hành nhằm mục tiêu:
1. Bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol.
2. Bước đầu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B.
2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học

1.1.2. Đặc tính lý - hóa
* Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [3], [14], [26].
- Độ tan: thực tế không tan trong nước, tan trong dimethyl sulphoxide (30-40
mg/ml) và trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid (2-4 mg/ml), rất
ít tan trong methanol [14]. AmB hầu như không tan trong nước (< 0,1 mg/ml ở
21
0
C), không tan trong cồn và trong chloroform. Dung dịch chế phẩm loãng nhạy
cảm với ánh sáng và bị mất hoạt tính ở pH thấp [3].
* Hóa tính:
Hóa tính chính của AmB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và
nhóm carboxylic tự do, do đó AmB có tính chất sau: tính lưỡng thân và lưỡng tính.
Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch
kiềm. Dung dịch AmB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm.
Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57-0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so
với 405 nm là 0,87-0,93 [3].
1.1.3. Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng
Trên mặt lâm sàng, AmB có thể chống lại Absidia spp., Aspergillus spp.,
Basidiobolus spp., Blastomyces dermatitidis, Candida spp., Coccidioides immitis,
Công thức phân

tử: C
47
H
73
NO
17
.
Khối lượng phân
tử: 924 [14].
pK
a
: 5,5; 10 [3].



3

Conidiobolus spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Mucor
spp., Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus spp., Rhodotorula spp. và Sporothrix
schenckii [29]. Mức độ nhạy cảm của nấm với AmB liên quan đến nồng độ
ergosterol có trong màng tế bào nấm [4].
* Cơ chế tác dụng:
AmB gắn vào phần ergosterol - sterol của màng tế bào nấm tạo nên các kênh
ion làm rò rỉ các ion K
+
, Na
+
, Ca
2+
và các phân tử nhỏ từ trong tế bào nấm ra ngoài,

gây chết tế bào. Ái lực của AmB với ergosterol - sterol của màng tế bào nấm và
cholesterol - sterol của màng tế bào động vật có vú thể hiện ở hệ số ái lực (The
affinity constant - Kaff). Kaff của ergosterol và cholesterol lần lượt là: 1,7 x 10
6

M
-1
; 0,2 x 10
6
M
-1
. Vì vậy, AmB có ái lực với ergosterol cao hơn rất nhiều so với
cholesterol nên nó tác dụng mạnh lên tế bào nấm [19]. Tuy nhiên, AmB vẫn gắn với
sterol màng tế bào của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được một phần
độc tính của thuốc đối với người [4].
Bởi hạn chế hấp thu qua đường tiêu hoá, AmB được dùng chủ yếu qua
đường tiêm tĩnh mạch. Liều dùng cho AmB thông thường: bắt đầu với liều 0,25
mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày. Trường hợp nặng, liều có thể cần tới
1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày. Các tác dụng phụ có dấu hiệu gia tăng khi
liều vượt quá 35 mg/ngày [4].
1.1.4. Tác dụng không mong muốn (thường gặp)
- Phản ứng chung: rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp.
- Máu: thiếu máu đẳng sắc.
- Tiêu hóa: rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn.
- Chuyển hóa: rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết.
- Tiết niệu: giảm chức năng thận kèm tăng creatinin và urê huyết [4], [29].
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, cấu tạo gồm một nhân
nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng

4

tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1], [2],
[11], [34].

Hình 1.1. Cấu trúc liposome [19]
1.2.2. Ưu, nhược điểm của liposome
* Ưu điểm
- Liposome được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao
nhất do PL được phân giải sinh học, không độc với cơ thể… [9], [40].
- Liposome có thể mang đồng thời cả DC thân nước và thân dầu [40].
- Cấu tạo tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm
tăng sinh khả dụng của DC, có thể mang DC tới nội bào để chữa bệnh nội bào.
Hoặc đưa DC tới đích nhờ gắn các ligand (ví dụ các mảnh kháng thể) trên màng
liposome [2], [9], [40].
- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số DC có độc tính cao, dùng liều
thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn… Làm giảm phân bố thuốc tại cơ
quan lành, tăng phân bố tại đích so với DC tự do, làm giảm độc tính và tác dụng
không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị… [2], [9], [40].
- Liposome bảo vệ DC tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình
bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác
nhân oxy hóa…, tăng độ tan của DC ít tan hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [2], [9].
* Nhược điểm
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay chưa có nhiều chế phẩm ứng dụng
5

hệ vận chuyển thuốc liposome trên thị trường do một số nhược điểm sau:
- PL không bền về mặt hóa học nên độ ổn định của liposome ngắn. Liposome
dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài. Tỷ lệ liposome
hóa của nhiều DC còn thấp đặc biệt với DC có phân tử lượng lớn [9].

- Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong
quá trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự đồng nhất giữa các lô mẻ, bên cạnh đó
chi phí thực hiện khá cao nên khó triển khai sản xuất lớn [9], [39].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ
để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi
trường [30].
1.2.3. Phương pháp bào chế liposome
1.2.3.1. Các phương pháp bào chế liposome
Có nhiều phương pháp bào chế liposome được sử dụng:
- Phương pháp hydrat hóa film (phương pháp Bangham).
- Phương pháp bốc hơi pha đảo.
- Phương pháp pha loãng ether.
- Phương pháp sử dụng kênh vi lỏng.
- Phương pháp đông khô
Trong đó phương pháp tiêm ethanol ngày càng được sử dụng rộng rãi trong
bào chế liposome do có nhiều ưu điểm nổi bật.
1.2.3.2. Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol
a) Ưu, nhược điểm của phương pháp
* Ưu điểm
- Quy trình bào chế đơn giản, thực hiện dễ dàng và nhanh chóng hơn các
phương pháp khác, tính lặp lại cao, dễ đồng nhất lô mẻ [9], [16], [17].
- Thu được liposome kích thước nhỏ (SUV) mà không cần trải qua quá trình
làm giảm kích thước tiểu phân như đùn qua màng hay siêu âm, tránh sự oxy hóa
hay phân hủy PL, dược chất [13], [22], [23].
- Thích hợp nạp các dược chất khác nhau: các phân tử protein, cả DC thân dầu
và thân nước, vitamin DC được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất
6

đa dạng như kanamycin, enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolone
[32], beclomethason với hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [21]. DC có thể gắn

theo cơ chế thụ động: DC thân nước được hòa tan vào pha nước, DC thân dầu được
hòa tan trong ethanol. Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động ví dụ doxorubicin dựa
trên sự chênh lệch pH giữa hai bên màng liposome. Theo cơ chế thụ động, DC thân
dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~ 100%), hiệu suất gắn của DC thân
nước rất thấp (~ 16%). Từ đó cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn
với việc liposome hóa DC thân dầu [9], [22].
- Tránh sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại cho sức khỏe con người như
methanol, chloroform Đồng thời chế phẩm chứa một lượng nhỏ ethanol trong giới
hạn cho phép có thể bảo quản chế phẩm tránh sự phát triển của vi khuẩn nấm mốc
[17], [22], [28].
- Phương pháp này thích hợp cho sản xuất quy mô lớn [23], [36].
* Nhược điểm
- Hạn chế độ tan của PL trong ethanol (40 mM với phosphatidylcholin) [32].
- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng liposome tạo ra.
Liposome thu được có nồng độ thấp do bị pha loãng, hiệu suất mang DC còn thấp
nhất là với những DC tan trong nước [21], [22], [28].
b) Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol.

Hình 1.2. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol
Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol đến nay vẫn
chưa thực sự được hiểu rõ ràng. Có thể giải thích sự hình thành liposome theo các
giai đoạn sau [9], [18], [23], [25]:
7

- Giai đoạn 1: Các phân tử PL hòa tan trong ethanol, tồn tại ở trạng thái tự do.
- Giai đoạn 2: Khi pha ethanol được tiêm nhanh vào pha nước, ethanol bị pha
loãng ngay lập tức và có một phần bay hơi. Kết quả, do thay đổi dung môi làm cho
các phân tử PL giảm độ tan và tập hợp thành các mảng lipid kép. Các phân tử PL có
đầu không phân cực hướng vào nhau còn đầu phân cực hướng ra ngoài tương tác
với môi trường nước.

- Giai đoạn 3: Dưới điều kiện có sự phân tán năng lượng đồng nhất trong môi
trường bằng khuấy trộn hoặc siêu âm, các mảng lipid kép có xu hướng giảm diện
tích tiếp xúc với môi trường nước nhằm bảo toàn năng lượng tự do bề mặt, các
mảng lipid kép lớn dần lên và co lại thành cấu trúc hình cầu khép kín - liposome.
c) Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol
Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol được bố trí rất đơn
giản: lipid và các thành phần tạo màng được hòa tan trong ethanol với nồng độ phù
hợp, được tiêm nhanh vào pha nước thích hợp kết hợp khuấy trộn hoặc siêu âm ở tốc
độ phù hợp. DC được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường nước phụ thuộc
vào độ tan của nó. Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25 nm được
tạo thành. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [2], [9], [16], [21].

Hình 1.3. Sơ đồ phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome
Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỷ lệ
pha ethanol/pha nước; nồng độ PL trong dung dịch ethanol và trong pha nước; loại
8

pha nước được sử dụng (nước tinh khiết, đệm phosphat, đệm Hepes ), nhiệt độ của
pha nước, đường kính bơm kim tiêm, tốc độ khuấy trộn… [17], [18].
Dựa trên nguyên lý phương pháp tiêm ethanol được mô tả bởi Batzri và Korn
năm 1973 ngày càng có nhiều cải tiến để hạn chế các nhược điểm của phương pháp
tiêm ethanol truyền thống, tối ưu hóa quá trình tạo liposome, nạp thuốc và thích hợp
cho áp dụng quy mô lớn với chi phí thấp nhất.
Gentine Philippe và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu một số dung
môi thân nước thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp tiêm ethanol như
propanol, butanol, isopropanol, ethyl acetat… Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol
tạo liposome có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và không
phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ PL, thể tích dung môi, tốc độ
bơm, tốc độ khuấy trộn. Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol để thay thế cho
ethanol trong sản xuất liposome [18].

Gentine Philippe và cộng sự (2013) đã phát triển một phương pháp tiêm
ethanol thay đổi với quy trình bào chế như sau: các thành phần lipid được hòa tan
trong hỗn hợp chloroform và methanol (9:1 v/v), dung môi được bay hơi ở áp suất
giảm tạo lớp film lipid khô. Lớp film này được hòa tan với thể tích thích hợp
ethanol tuyệt đối ở 60
0
C, sau đó được tiêm vào pha nước ở 70
0
C, khuấy từ tiên tục
trong khoảng 10 phút. Cô quay dưới áp suất giảm để loại ethanol, thu hỗn dịch
liposome. Với phương pháp này tỷ lệ ethanol/pha nước - ethanol có thể đạt tới 60%
(v/v) mà không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome, với phương pháp truyền
thống cần hạn chế dưới 10%. Đồng thời, nồng độ hỗn dịch liposome thu được gấp
10 đến 30 lần. Khi thực hiện ở tỷ lệ 33% thì yếu tố nồng độ lipid, điện tích lipid,
loại pha nước sử dụng ít ảnh hưởng đến KTTP (91,3 ± 3,7 nm), PDI nhỏ (0,218 ±
0,011) và quy trình có độ lặp lại lớn [17].
Phương pháp tiêm ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống
kim phun (crossflow injection technique) nhằm nâng cao quy mô bào chế với sự lặp
lại lớn giữa các lô mẻ. Pha nước, pha ethanol được làm nóng tới 55
o
C. Pha nước
được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang (3), quay trở lại (2), trong quá
9

trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol có hòa tan PL được
bơm dưới áp lực nén của (5) qua thiết bị đầu kim phun (1) để tạo liposome. Hệ
thống có nhiều ưu điểm: KTTP không phụ thuộc vào đường kính kim và nồng độ
lipid sử dụng cao hơn gấp 5-10 lần phương pháp truyền thống mà không ảnh hưởng
đến KTTP tạo ra [41], [42].

Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống kim phun [42].
Phương pháp tiêm ethanol còn được cải tiến bằng cách dùng màng tiếp
xúc: pha nước được bơm vào lòng màng tiếp xúc còn pha ethanol được nén thành
các tia nhỏ qua lỗ xốp của màng, liposome được tạo ra ngay lập tức khi lipid hòa tan
trong pha ethanol tiếp xúc với pha nước trong lòng màng. Hỗn dịch liposome tạo
thành được hứng vào bình hứng và khuấy trộn trong khoảng 15 phút (phụ lục 1).
Thiết bị này tạo ra liposome nhỏ kích thước dưới 100 nm và tương đối đồng nhất,
dễ triển khai ở quy mô lớn [9], [21]. Tác giả Chiraz Jaafar-Maalei đã dùng phương
pháp này để bào chế liposome indomethacin (hiệu suất liposome hóa đạt 63%) và
liposome beclomethason (hiệu suất liposome hóa đạt 93%) [21].
1.3. Liposome Amphoterin B
1.3.1. Cấu trúc liposome Amphotericin B
Thành phần của liposome Amphotericin B:

1. Hệ thống kim phun
2,3. Pha nước
4. Pha ethanol
5. Thiết bị nén khí nito
6. Bơm nhu động


10

Hình 1.5. Cấu trúc liposome Amphotericin B [12].
* Vỏ liposome
Vỏ L-AmB gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol:
Phospholipid
PL sử dụng trong L-AmB bao gồm phosphatidylcholin đậu nành hydrogen
hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG) [12]:
HSPC (khối lượng phân tử: 783,774) có các ưu điểm sau: bền về hóa học
hơn so với phosphatidylcholin đậu nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các
quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn,
hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất [7].
DSPG (khối lượng phân tử: 801,06) ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid
kép, còn đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của L-AmB: DSPG ở
dạng muối Natri khi được hòa tan trong môi trường pH trung tính không proton,
muối này phân ly, nhóm phosphat mang điện tích âm hay phân tử DSPG tích điện
âm. Khi acid hóa môi trường ở pH 1-3, DSPG nhận một proton và tạo thành một
phân tử trung hòa về điện tích. AmB thêm vào dung dịch acid hóa trên, proton của
nhóm phosphate sẽ được chuyển cho nhóm amin của AmB. Kết quả là các phân tử
AmB tích điện dương. Đồng thời, nhóm phosphate của PL mang điện tích âm do từ
bỏ một proton. Do đó sự tích điện trái dấu, các phân tử thu hút nhau, tạo thành phức
giữa AmB và DSPG [33]. Liên kết của AmB với lớp lipid kép còn được tăng cường
bởi tương tác kỵ nước giữa chuỗi hydrocarbon béo của PL và chuỗi polyen của
11

AmB [19].
Cả hai loại PL này có nhiệt độ chuyển pha cao T
c
> 37
0

C (HSPC và DSPG
lần lượt là 48
0
C, 54
0
C) đảm bảo liposome ổn định trong điều kiện sinh lý [12].
Cholesterol
Chol không tham gia tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều
chỉnh thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome, làm tăng độ
vững chắc cho màng liposome, tăng độ ổn định của liposome, giảm khả năng rò rỉ
DC mang. Nếu không Chol thì lớp PL của liposome dễ tương tác với protein huyết
tương như albumin, transferrin, macroglobulin dẫn tới giảm độ ổn định của
liposome [9].
Trong thành phần của liposome chứa PL có nhiệt độ chuyển pha cao, Chol
giúp tiểu phân giảm được sự phá hủy của lipoprotein tỉ trọng cao (HDL). HDL sẽ
loại bỏ PL ra khỏi tiểu phân liposome, hậu quả làm phá vỡ cấu trúc màng lipid và rò
rỉ DC mang trong qua trình lưu thông của liposome trong tuần hoàn [19]. Ngoài ra,
trong L-AmB, Chol có ái lực tốt với AmB nên tạo liên kết với AmB góp phần đưa
DC vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ DC
và giúp liposome vận chuyển AmB tới đích tác dụng. Chỉ khi nào tiếp xúc với sterol
của tế bào nấm - ergosterol thì AmB trong liposome mới được giải phóng do có ái
lực cao hơn với sterol này [33], [35].
* Dược chất
Bởi sự hình thành phức với DSPG và ái lực với Chol nên AmB được gắn vào
màng liposome trong quá trình bào chế liposome.
* Cơ chế giảm độc tính và tăng khả năng chấp nhận liều cao của L-AmB trên
bệnh nhân cho đến nay vẫn chưa thực sự được rõ ràng. Anya M. Hillery cho rằng do
liên kết chặt chẽ giữa DC với liposome, sự ổn định của tiểu phân, ái lực AmB với
cholesterol - màng tế bào người thấp hơn ergosterol và thời gian tuần hoàn L-AmB
trong máu kéo dài nên sự tương tác của AmB với tế bào người giảm, làm giảm độc

tính với cơ thể [19].
Vì những lý do trên mà đề tài đã lựa chọn dạng bào chế liposome để nghiên
12

cứu hệ vận chuyển thuốc AmB.
1.3.2. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B
1.3.2.1. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B trên thế giới
Deepak Singodia và cộng sự (2012) nghiên cứu bào chế L-AmB sử dụng
Phosphatidylglycerol, Chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) bằng phương pháp
tiêm ethanol như sau: AmB hòa tan trong DMA được acid hóa bằng dung dịch HCl
0,1%, trộn lẫn với dung dịch lipid hòa tan trong ethanol rồi tiêm nhanh vào một thể
tích lớn dung dịch dextrose 5% để thu được L-AmB. Kết quả cho thấy các liposome
bào chế bằng phương pháp này có KTTP khoảng 100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV
và hiệu suất mang thuốc trên 95% đối với tất cả các mẫu, khả năng giải phóng dược
chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công thức hầu như không có sự khác
biệt so với chế phẩm AmBisome [36].
Malika Skiba-Lahiani và cộng sự (2015) đã nghiên cứu bào chế L-AmB có
thành phần DSPC, Chol và ceramid (CER) bằng phương pháp tiêm dung môi dùng
cho đường uống như sau: lipid và AmB hòa tan trong methanol sau đó được tiêm
với tốc độ 1 ml/phút vào pha nước là dung dịch NaCl 0.9% ở 25
0
C. Methanol được
loại đi bằng đồng nhất hóa tốc độ cao (ultra-turrax) ở 24000 vòng/phút trong 10
phút. Kết quả cho thấy thêm thành phần CER không ảnh hưởng đến KTTP (200 ± 4
nm) và khả năng mang thuốc (75 ± 2%) so với công thức không sử dụng. Đồng
thời, ưu điểm khi sử dụng CER giúp cho KTTP liposome ổn định và giảm khả năng
giải phóng thuốc trong đường tiêu hóa dưới tác dụng của muối mật và các enzym
phân giải lipid, tiểu phân được hấp thu vào máu và cho tác dụng. Vì vậy, công thức
L-AmB chứa CER thích hợp dùng cho đường uống [37].
1.3.2.2. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B tại Việt Nam

Tại bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội, đã thực hiện các nghiên cứu bào
chế L-AmB bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Ths. Đào Thị Thùy Dung (2013) đã nghiên cứu bào chế L-AmB bằng 2
phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hóa film đồng thời đánh giá được các yếu
tố thuộc về công thức, quy trình bào chế, môi trường phân tán và nồng độ lipid ảnh
13

hưởng đến các đặc tính của liposome. Với phương pháp bốc hơi pha đảo đã lựa
chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid là 3%; tỷ lệ
SPC:Chol là 5:5; môi trường phân tán là đệm phosphate pH 7,4; có hiệu suất
liposome hóa là 89,5%; KTTP 288 nm; PDI 0,262. Còn với phương pháp hydrat
hóa film đã lựa chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lipid là 3%; tỷ
lệ SPC:chol là 6:4; môi trường hydrat hóa là glucose 5%; hiệu suất liposome hóa
đạt 98,18%; liposome có KTTP 160,8 nm và PDI 0,288 [5].
Phạm Thúy Ngọc (2014) đã bước đầu nghiên cứu bào chế liposome AmB
bằng phương pháp tiêm ethanol và xác định được một số yếu tố thuộc về quy trình
bào chế: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 8%, nhiệt độ pha nước khi phối hợp
60
0
C, tốc độ khuấy trộn 3900 vòng/phút. Tác giả đã lựa chọn công thức bào chế cho
10ml hỗn dịch: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, Chol 52 mg đạt hiệu suất quy trình
khoảng 65,59%, KTTP 177,8-204,3 nm, PDI 0,2-0,15. Đồng thời đánh giá L-AmB
về hình thái cấu trúc: hình ảnh chụp TEM cho thấy số lớp liposome ít hơn 3 [10].
Mai Thị Thùy Linh (2014) tiến hành nghiên cứu bào chế L-AmB sử dụng tá
dược DSPG và HSPC bằng phương pháp hydrat hóa màng film, xây dựng công
thức bào chế và bước đầu tiến hành đông khô L-AmB. Tác giả đã lựa chọn công
thức bào chế: tỷ lệ 9% mol dược chất/tổng lượng lipid, tỷ lệ 40% mol Chol/tổng
lượng lipid, tỷ lệ HSPC/DSPG= 2/0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 kết
hợp với tá dược đông khô là mannitol cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích
thước hẹp (PDI < 0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng gần 90%). Sử dụng

mannitol là tá dược tạo khung cho bánh đông khô khi phân tán lại liposome cho hỗn
dịch màu vàng nhạt, không có tiểu phân kích thước lớn có thể quan sát được bằng
mắt thường, không lắng cặn, KTTP nhỏ (205 nm), hỗn dịch đồng nhất ( PDI 0,157)
và hiệu suất liposome hóa khá cao (75,24%) [7].
1.4. Đông khô liposome
1.4.1. Độ ổn định của liposome
Liposome là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt hóa học, vật lý, sinh học.
Sự thay đổi đặc tính lý hóa có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như
14

trong quá trình bảo quản. Liposme được gắn thêm các phân tử PEG trên bề mặt có
thể hạn chế sự kết tụ tiểu phân tuy nhiên hiệu quả không cao [38]. Để khắc phục
vấn đề này có nhiều phương pháp được áp dụng như đông lạnh, phun sấy… trong
đó kỹ thuật đông khô ngày càng được sử dụng phổ biển để tăng độ ổn định cho
liposome [15]. Một mặt, quá trình này giúp loại nước khỏi hỗn dịch liposome làm
giảm quá trình thủy phân PL, mặt khác nó làm chậm quá trình biến đổi vật lý và hóa
học của dạng bào chế do sản phẩm ở trạng thái rắn bền vững hơn [15], [38]. Các
nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến hiệu quả điều
trị của thuốc [30].
1.4.2. Quá trình đông khô
Quá trình đông khô gồm ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp và làm khô
thứ cấp [8]:
* Giai đoạn đông lạnh:
Giai đoạn này phần lớn nước được tách ra khỏi dược chất và tá dược và đóng
băng thành đá, hệ tách thành nhiều pha.
* Giai đoạn làm khô sơ cấp:
Nước ở trạng thái đá sẽ thăng hoa trực tiếp sang dạng hơi ở điều kiện áp suất
của buồng đông khô dưới áp suất hơi của nước đá. Kết quả của quá trình này thể
hiện ở độ dày của lớp băng giảm xuống còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên do
nước bay hơi tạo nhiều lỗ xốp trong sản phẩm.

* Giai đoạn làm khô thứ cấp:
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, lượng nước hấp phụ trong
khối bột sẽ được loại ra khỏi sản phẩm.
Yêu cầu sản phẩm sau đông khô phải có các đặc tính: ở dạng bánh thuốc, ổn
định trong thời gian dài, thời gian hoà tan lại ngắn, duy trì được những đặc tính gốc
của dạng ban đầu (tính chất của dung dịch, cấu trúc của protein hay kích thước tiểu
phân của hỗn dịch) [8].
Cả quá trình ĐK và quá trình phân tán trở lại để tạo hỗn dịch liposome đều
gây những tác động có thể ảnh hưởng cấu trúc và tính nguyên vẹn của lớp màng kép
15

của liposome. Quá trình ĐK sẽ phá vỡ liên kết hydro hình thành giữa phân tử nước
và đầu phân cực của phân tử PL làm phá vỡ cấu trúc liposome, tạo thành các mảnh
lipid kép. Khi được phân tán lại trong môi trường nước, các mảnh lipid kép này sẽ
kết tập với nhau tạo tiểu phân có kích thước tăng lên đáng kể, đồng thời gây rò rỉ
DC mang. Để hạn chế hiện tượng này, người ta thường cho vào công thức đông khô
các loại đường như glucose, lactose, sucrose, trehalose… Chúng có 2 vai trò chính:
vừa là tá dược tạo khung cho bánh đông khô vừa có tác dụng bảo vệ cấu trúc
liposome (lyoprotectant) do tạo liên kết hydro với phospholipid thay thế nước, hạn
chế sự tá động của tinh thể đá lên lớp màng kép trong quá trình đông lạnh, đồng
thời bao bọc liposome ngăn cách chúng tương tác với nhau khi ở trạng thái rắn. Tỷ
lệ đường/lipid có thể là 5; 8 hay 10 tùy thuộc vào nồng độ lipid trong công thức
đông khô [38]. Quá nhiều các đường này có thể sẽ làm chậm hay gây nứt lọ trong
quá trình đông khô và làm chậm thời gian phân tán lại tạo hỗn dịch liposome [6],
[8]. Ngoài ra, trong công thức ĐK thường sử dụng thêm một lượng nhỏ mannitol
hay glycerol giúp duy trì sự đồng nhất của hỗn dịch sau ĐK [38].
Brigitte Stark và cộng sự (2010) tiến hành đánh giá khả năng bảo vệ của các
loại đường lên tính toàn vẹn của tiểu phân liposome - PEG hóa sau đông khô. Kết
quả cho thấy, nếu không sử dụng tá dược bảo vệ thì KTTP tăng lên đáng kể, ngược
lại KTTP thay đổi không có ý nghĩa trước và sau đông khô khi sử dụng đường với

tỷ lệ mol đường/lipid là 5. Bên cạnh đó, sử dụng đường đôi trehalose và lactose đạt
PDI nhỏ (< 0,15) so sánh với đường đơn glucose (PDI ≈ 0,3), điều này cho thấy sử
dụng đường đôi có hiệu quả bảo vệ tốt hơn đường đơn [38].
Vinayagam Kannan và cộng sự (2014) đã đánh giá sự rò rỉ DC paclitaxel
khỏi liposome - PEG hóa sau đông khô khi có và không sử dụng tá dược bảo vệ
sucrose. Kết quả cho thấy, khi không sử dụng sucrose, hiệu suất liposome hóa giảm
5 lần, ngược lại sử dụng sucrose ở tỷ lệ mol đường/lipid = 5 sự rò rỉ DC là không có
ý nghĩa, đồng thời KTTP thay đổi không đáng kể (tăng từ 87,5±2,5 nm lên 119,2 ±
2,2 nm và PDI đạt 0,250 ± 0,011). Mẫu đông khô ổn định trong 3 tháng khi được
bảo quản ở 5
0
C [24].
16

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu.
- Đối tượng nghiên cứu: Liposome Amphotericin B.
Thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B.
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
TT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Acid acetic băng
Merck - Đức
NSX
2
Acid hydrochloric

Trung Quốc
NSX
3
Acetonitril dùng cho HPLC
Merck - Đức
NSX
4
Amphotericin B chuẩn
Dr.Ehrenstorfer - Đức
NSX
5
Amphotericin B
Trung Quốc
USP
6
Cholesterol
Sigma-Aldrich
NSX
7
Dinatrisuccinat hexahydrat
Trung Quốc
TKHH
8
Distearoyl phosphatidylglycerol
Lipoid- Mỹ
NSX
9
Đường sucrose
Fisher – Anh
BP

10
Ethanol tuyệt đối
Trung Quốc
TKHH
11
Hydrogenated soybean
phosphatidylcholine
Lipoid– Mỹ
NSX
12
Methanol dùng cho HPLC
Merck - Đức
NSX
13
Mannitol
Trung Quốc
TKHH
14
N,N-dimethylacetamid
Trung Quốc
NSX
15
Natri acetate trihydrat
Trung Quốc
NSX
16
Nước tinh khiết
Việt Nam
DĐVN
- Phương tiện nghiên cứu:

+ Bơm tiêm 10 ml/cc, 5 ml/cc với các đầu kim 20G×3
1/2
”, 22G×3
1/2
”,
25G×3
1/2
”, 27G×3
1/2
” (Vinahankook – Việt Nam).