Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin b

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



LÊ NHO ĐÁN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC
TIÊM ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ NHO ĐÁN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC
TIÊM ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B

Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Thị Hải Yến
2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Nơi thực hiện:

Bộ môn bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội






HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Thị Hải Yến đã tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận. Dưới sự hướng
dẫn của cô, em đã học hỏi được rất nhiều điều bổ ích.
Em cũng chân thành cám ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ, ThS. Nguyễn
Tuấn Quang, ThS. Nguyễn Văn Lâm. Sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của các
thầy cô đã giúp em có điều kiện hoàn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất.
Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng nhận được sự giúp
đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào
Chế. Em xin cám ơn những sự giúp đỡ quý báu này.
Cuối cùng em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã động viên, luôn bên cạnh em
trong suốt quá trình nghiên cứu và học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên


Lê Nho Đán
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2

1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 3
1.1.6. Chỉ định 3
1.1.7. Liều dùng 3
1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4
1.2. Liposome 4
1.2.1. Khái niệm 4
1.2.2. Thành phần của liposome 4
1.2.2.1. Vỏ liposome 4
1.2.2.2. Dược chất 5
1.2.3. Ưu, nhược điểm 6
1.2.3.1. Ưu điểm 6
1.2.3.2. Nhược điểm 6
1.2.4. Độ ổn định 6
1.2.5. Bào chế liposome 7
1.2.5.1. Các phương pháp bào chế liposome 7
1.2.5.2. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa film 7
1.2.5.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 7
1.3. Kỹ thuật đông khô 9
1.3.1. Khái niệm và ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 9
1.3.2. Một số khái niệm khác 10
1.3.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô. 10
1.3.3.1. Giai đoạn đông lạnh 10
1.3.3.1. Giai đoạn làm khô sơ cấp 12
1.3.3.2. Giai đoạn làm khô thứ cấp 12
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome đông khô 13
1.3.4.1. Yếu tố thuộc về công thức 13

1.3.4.2. Yếu tố thuộc về kỹ thuật: 14
1.4. Các nghiên cứu về L-AMB và đông khô L-AMB 15
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới 15
1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Phương pháp bào chế L-AMB 18
2.3.1.1. Công thức bào chế 18
2.3.1.2. Qui trình bào chế 18
2.3.1.3. Khảo sát phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP 19
2.3.2. Phương pháp đông khô L-AMB 20
2.3.2.1. Quy trình bào chế L-AMB đông khô: 20
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và qui
trình đông khô L-AMB 20
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của L-AMB và L-AMB đông
khô …………………………………………………………………… 21
2.3.3.1. Đánh giá L-AMB 21
2.3.3.2. Đánh giá L-AMB đông khô 21
2.4. Điều kiện thí nghiệm 23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Kết quả bào chế L-AMB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát các
phương pháp làm giảm KTTP 24
3.1.1. Kết quả liposome thu được sau khi hydrat hóa 24
3.1.2. Khảo sát các phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP 25
3.1.2.1. Phương pháp đùn qua màng 25
3.1.2.2. Phương pháp siêu âm 26
3.1.2.3. Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng 28
3.2. Kết quả bào chế L-AMB đông khô. 32

3.2.1. Khảo sát tác dụng của tá dược bảo vệ trong quá trình đông lạnh 32
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược saccarose trong quá trình đông
khô …………………………………………………………………… 34
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố kỹ thuật 35
3.2.3. Quy trình bào chế L-AMB đông khô 37
3.2.4. Đánh giá lại một số đặc tính của L- AMB đông khô. 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
AMB
Amphotericin B
2
BP
Dược điển Anh
3
Chol
Cholesterol
4
DC
Dược chất
5
DĐVN
Dược điển Việt Nam
6

DSPG
Distearoylphosphatidylglycerol
7
ĐK
Đông khô
8
HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogennated
soy phosphatidylcholine)
9
kl/tt
Khối lượng/ thể tích
10
KTTP
Kích thước tiểu phân
11
L-AMB
Liposome amphotericin B
12
NSX
Nhà sản xuất
13
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
14
TDBV
Tá dược bảo vệ
15
TKHH
Tinh khiết hóa học

16
USP
Dược điển Mỹ


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 1.1.
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
4
Bảng 2.1.
Nguyên liệu
17
Bảng 3.1.
KTTP và phân bố KTTP của các mẫu L-AMB sau khi hydrat
hóa
24
Bảng 3.2.
KTTP và phân bố KTTP trước và sau khi đùn tay.
25
Bảng 3.3.
KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 30
giây, nghỉ 30 giây
26
Bảng 3.4.
KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 1
phút, nghỉ 1 phút

27
Bảng 3.5.
KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 2
phút, nghỉ 2 phút
27
Bảng 3.6.
KTTP, phân bố KTTP dưới áp suất đồng nhất hóa khác nhau
28
Bảng 3.7.
KTTP, phân bố KTTP sau các chu kì đồng nhất hóa
29
Bảng 3.8.
KTTP, phân bố KTTP sau các lần đùn qua màng 400 nm
dưới áp suất cao
30
Bảng 3.9.
KTTP và phân bố KTTP của mẫu chứa saccarose sau khi rã
đông
32
Bảng 3.10.
KTTP và phân bố KTTP của mẫu chứa mannitol sau khi rã
đông
32
Bảng 3.11.
Ảnh hưởng của tỷ lệ saccarose đến đặc tính của L-AMB
đông khô
34
Bảng 3.12.
Kết quả khảo sát nhiệt độ quá trình làm khô sơ cấp
36

Bảng 3.13.
Đặc tính của L- AMB đông khô
38



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1.
Thiết bị đồng nhất hóa và đùn áp suất cao
9
Hình 1.2.
Giản đồ pha trong quá trình đông khô
10
Hình 3.1.
Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm
KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp
với đùn qua màng (b)
31
Hình 3.2.
Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP thu được từ các
phương pháp làm giảm KTTP
31
Hình 3.3.
Mẫu sau đông khô và phân tán lại
34
Hình 3.4.
Bánh đông khô có mặt 1% (a) và 2% (b) glycerin (kl/tt)

35
Hình 3.5.
Hình ảnh chụp TEM sau đông khô
38





1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ những năm 60 của thế kỉ trước, A. D. Bangham và cộng sự đã phát hiện
và bào chế ra liposome. Cho đến nay liposome được nghiên cứu rất nhiều như một
hệ mang thuốc trong công nghệ dược phẩm do nó có rất nhiều ưu điểm như: tương
thích sinh học; có thể mang dược chất thân nước trong khoang nước, dược chất thân
dầu trong vỏ; có thể mang dược chất đến tế bào đích, thậm chí là nội bào; kích
thước, điện tích bề mặt có thể thay đổi dễ dàng bằng cách thêm một số thành phần
vào trong vỏ…Mục tiêu của các nghiên cứu này là nhằm tìm ra những dạng
liposome mang đặc tính mới phù hợp với từng loại dược chất mà nó vận chuyển.
Kết quả là ngày nay trên thế giới nhiều chế phẩm liposome đã được ứng dụng trong
lâm sàng như Daunosome
®
, Lipodox
®
, Lipoplatin
®
, Ambisome
®
.

Amphotericin B là một dược chất thân dầu được chỉ định trong trường hợp
nhiễm nấm nặng toàn thân (đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch) do hoạt tính
kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên thuốc rất kém tan trong nước nên
sinh khả dụng đường uống rất thấp, thải trừ rất chậm qua thận, gây tích lũy thuốc do
đó AMB gây độc cao với thận. Hiện nay, việc sử dụng liposome làm chất mang làm
tăng sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu của AMB do đó mang lại
nhiều lợi ích trong việc hạn chế độc tính và tăng hiệu quả điều trị. Một số nghiên
cứu trước đây tại trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật
bào chế liposome AMB bằng các phương pháp khác nhau như: hydrat hóa film,
tiêm ethanol. Tuy nhiên độ ổn định của liposome vẫn là mối quan tâm lớn do sự
thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kết tụ có thể xảy ra khi bảo
quản trong thời gian dài. Chính vì vậy trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế
trước đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô
liposome Amphotericin B” nhằm mục tiêu:
1. Bào chế và làm giảm KTTP liposome AMB.
2. Xây dựng công thức và quy trình đông khô liposome AMB.
3. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB đông khô.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Nguồn gốc
Amphotericin B là một hỗn hợp của polyenes kháng nấm sản xuất bởi sự tăng
trưởng của một số chủng Streptomyces nodosus, bao gồm chủ yếu là
(1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,27E,29E,
31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl) oxy] -1,3,
5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,18-trimethyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo [33.3.1]
nonatriaconta-19,21,23,25,27,29,31 - heptaene-36-carboxylic acid. Hàm lượng
không nhỏ hơn 750 IU/mg, tính theo chất khô [10].
1.1.2. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17
.
Khối lượng phân tử: 924 [10].



1.1.3. Đặc tính lý hóa
* Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [2], [10].
- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong dimethyl sulphoxide và trong
propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế
không tan trong cồn [10].
* Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin
và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Dung dịch AMB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ
độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với
405 nm là 0,87-0,93 [2].
3

1.1.4. Tác dụng dược lý
Amphotericin B là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là
ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng. AMB cũng gắn
với sterol ở màng tế bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được
một phần độc tính của thuốc đối với người [3].

1.1.5. Dược động học
Dược động học của AMB thay đổi đáng kể phụ thuộc vào dạng dùng như AMB
quy ước (micell), phức amphotericin sulfate cholesteryl, phức AMB lipid hoặc
liposome AMB.
- Hấp thu: AMB không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được dùng đường
tiêm.
- Phân bố: Hơn 90% thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein.
Thông tin về phân bố của AMB còn hạn chế. Để đạt được nồng độ trong dịch não
tủy có tác dụng kìm nấm, AMB phải được tiêm thường xuyên vào trong vỏ não.
Thuốc qua được nhau thai.
- Chuyển hóa: Chưa được làm rõ.
- Thải trừ: AMB được thải trừ rất chậm qua thận. Thời gian bán thải của liposome
AMB là 100-153 giờ [9].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans
ở miệng và đường tiêu hóa.
- Thuốc tiêm tĩnh mạch AMB thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn nấm toàn
thân do nấm Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioidesimmitis,
Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid: chỉ định cho những trường hợp đã điều trị
bằng AMB thông thường mà bị thất bại hoặc những trường hợp mà AMB thông
thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [3].
1.1.7. Liều dùng
* Đường tiêm tĩnh mạch:
4

- AMB thông thường: từ liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày,
trường hợp nặng, liều có thể tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cách 1 ngày.
- AMB dạng liposome: từ liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày [3].

1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường.
TT
Tên chế
phẩm
Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
Dạng bào
chế
1
Fungizone
50 mg
AMB với natri
deoxycholat
Micell
Bột đông
khô
2
Abelcet
100 mg/
20 ml
DMPC:DMPG:AMB
(tỷ lệ mol 7:3:10)
Phức hợp
lipid
Hỗn dịch
3

Amphotec
50 mg,
100 mg
Phức hợp AMB với
cholesteryl sulfate
(tỷ lệ mol 1:1)
Phức hợp
lipid
Bột đông
khô
4
Ambisome
50 mg
HSPC:DSPG:Chol:AMB
(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)
Liposome
Bột đông
khô
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở
giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có
kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1], [8].
1.2.2. Thành phần của liposome
1.2.2.1. Vỏ liposome
Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol:
* Phospholipid: Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm
phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC) và
distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).
5

HSPC có các ưu điểm sau: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu
nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo
chưa no, giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ DC [8].
DSPG ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid kép, còn đóng vai trò quan
trọng trong cơ chế hình thành của liposome AMB theo cơ chế sau: Trong khoảng
pH trung tính, AMB tồn tại ở dạng lưỡng cực còn DSPG có một nhóm phosphate bị
ion hóa nên phân tử tích điện âm. Khi hòa tan trong một dung môi pH khoảng từ 1,0
đến 3,0 các phân tử DSPG nhận thêm một proton và tạo thành một phân tử trung
hòa về điện tích. Khi AMB thêm vào dung dịch acid hóa trên, các proton của nhóm
phosphate sẽ được chuyển cho các nhóm amin của AMB. Kết quả là AMB sẽ tích
điện dương còn DSPG mang điện tích âm. Do sự tích điện trái dấu, các phân tử hút
nhau tạo thành một cặp ion. Như vậy, sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và DSPG được
tăng lên rất nhiều [21].
* Cholesterol
Cholesterol lấp vào các khoang của phospholipid kép làm tăng độ vững chắc
cho màng liposome [7]. Ngoài ra, trong liposome AMB, cholesterol có ái lực tốt với
AMB nên tạo liên kết với AMB góp phần đưa DC vào pha dầu của cấu trúc
liposome, giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ DC và giúp liposome vận chuyển
AMB tới đích tác dụng [21].
1.2.2.2. Dược chất
- DC được dùng trong bào chế các dạng thuốc liposome khá đa dạng, thường là
các DC cần tập trung tại đích, các DC khó thấm như DC điều trị ung thư, một số
kháng sinh, enzyme,… DC có thể được gắn vào liposome theo một trong hai
cách là gắn thụ động (thực hiện trong quá trình tạo liposome) hoặc gắn chủ động
(thực hiện sau khi đã hình thành liposome) [7].
- Một số liposome còn sử dụng các chất khác làm thay đổi đặc tính của vỏ
liposome như các polyme thân nước (kéo dài thời gian tuần hoàn), các chất diện
hoạt (để tăng tính thấm qua da),…
6

- AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình tạo thành liposome bởi sự
hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với cholesterol trong thành
phần vỏ phospholipid.
1.2.3. Ưu, nhược điểm
1.2.3.1. Ưu điểm
- Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học. Do đó
được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [32].
- Có thể mang được cả DC thân dầu và thân nước [8], [32].
- Có tác dụng bảo vệ DC; kéo dài tác dụng của thuốc [7].
- Giảm độc tính của thuốc [25].
- Có thể vận chuyển thuốc tới tế bào đích, thậm chí là nội bào [7], [8], [32].
1.2.3.2. Nhược điểm
- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về vật lí, hóa học và sinh học [28].
- Nguyên liệu phải có độ tinh khiết cao, đắt nên giá thành chế phẩm cao [1].
- Các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid
gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [28].
- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí
nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [28].
1.2.4. Độ ổn định
Trong quá trình bảo quản, liposome không bền cả về vật lý và hóa học.
- Về hóa học: Sự kém ổn định là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của
phân tử phospholipid và quá trình thủy phân liên kết ester của phospholipid tạo ra
các lysophospholipid [16].
- Về vật lý: Sự kém ổn định là do quá trình thấm thuốc qua màng và sự có mặt của
các thành phần tích điện trên bề mặt gây hiện tượng kết tụ tiểu phân [16]. Sự ổn
định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích điện bề
mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự rò rỉ của DC qua màng
Vì vậy, bào chế liposome ở dạng bột đông khô là hướng nghiên cứu để kéo dài
tuổi thọ của chế phẩm.

7

1.2.5. Bào chế liposome
1.2.5.1. Các phương pháp bào chế liposome
Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của phospholipid và mục đích sử dụng liposome
có thể được bào chế theo một số phương pháp sau:
- Phương pháp hydrat hóa film.
- Phương pháp thay đổi dung môi (tiêm ethanol).
- Phương pháp bốc hơi pha đảo.
- Phương pháp dùng chất diện hoạt.
- Phương pháp đông khô.
1.2.5.2. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa film
Phospholipid tạo vỏ và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung
môi hữu cơ thích hợp. Sau đó, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách
bốc hơi trong một bình cầu để tạo một lớp film khô. Hydrat hóa film đã tráng để tạo
liposome [21].
Liposome được tạo ra bởi phương pháp này có thể có KTTP lớn và không
đồng nhất. Để đạt mục đích điều trị, việc đồng nhất và giảm KTTP liposome là cần
thiết.
1.2.5.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch [31].
Các phương pháp được sử dụng để làm giảm kích thước của liposome là đùn
ép; siêu âm; đồng nhất; đóng băng và tan băng
* Đùn ép
Đùn ép là một biện pháp làm giảm KTTP, sử dụng áp lực vừa phải để đẩy các
liposome trong hỗn dịch qua các màng lọc polycarbonat tiêu chuẩn với kích thước
màng xác định [18].

8

Cơ chế: Thường ép hỗn dịch liposome nhiều lớp qua màng để thu liposome
nhỏ một lớp. Liposome sẽ bị “bóc từng lớp một” cho đến kích thước mong muốn.
Khi bị nén qua lỗ lọc hình trụ, liposome có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc dễ dàng đi
qua màng lọc. Liposome có kích thước lớn hơn đường kính lỗ lọc, một số sẽ bị biến
dạng để đi qua lỗ lọc và bị một số tác động của lực trượt sẽ bị “bóc” lớp vỏ ngoài
sau khi đi qua lỗ lọc [7].
Kỹ thuật đùn ép có nhiều ưu điểm: có thể được áp dụng cho nhiều loại lipid và
hỗn hợp, nhanh, chi phí thấp, có thể đùn trực tiếp liposome đa lớp thành đơn lớp
[18].
Đùn ép có 2 loại: đùn tay hoặc đùn ép dưới áp suất cao.
- Đùn tay
Đùn ép được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay trang
bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ lọc
200 nm, hỗn dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với kích
thước lỗ lọc lớn hơn [18].
- Đùn ép dưới áp suất cao
Với thiết bị có quy mô lớn hơn, liposome có thể được nén qua màng với áp
suất cao hơn, sử dụng khí nén là Nitơ (Hình 1.1).
* Siêu âm
Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm nhỏ kích thước tiểu
phân của liposome. Có thể sử dụng siêu ẩm bể hoặc siêu âm que, tuy nhiên dùng
que dễ đưa tạp vào chế phẩm [7].
Nhược điểm: Có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm, hiệu
suất nạp thuốc giảm do rò rỉ dược chất trong quá trình siêu âm. So với phương pháp
đùn ép, phương pháp siêu âm không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [18].
* Đồng nhất hóa áp suất cao
Nguyên tắc hoạt động: Nén hỗn dịch qua khe hẹp có kích thước xác định
trong thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất cao. Thường nén tuần hoàn nhiều vòng cho

đến lúc thu được liposome khoảng 50- 100 nm [7].
9


Hình 1.1. Thiết bị đồng nhất hóa và đùn áp suất cao.
Đây là phương pháp dễ áp dụng trong sản xuất, ít ảnh hưởng đến độ ổn định
của liposome.
1.3. Kỹ thuật đông khô
1.3.1. Khái niệm và ưu nhược điểm của phương pháp đông khô
* Khái niệm:
Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm trong các điều kiện đặc biệt, trong đó
chế phẩm được đông lạnh, sau đó dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp (giai đoạn
làm khô sơ cấp) rồi giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn chặn phản ứng
hóa học và sự phát triển của vi sinh vật [30].
* Ưu điểm:
- Quá trình loại nước ở nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ phản ứng phân hủy DC đáng
kể so với việc loại nước bằng các phương pháp khác.
- Sản phẩm đông khô hòa tan rất nhanh khi cần hòa tan trở lại.
- Thuốc được phân liều vào lọ trước khi đông khô ở dạng dung dịch nên dễ dàng đạt
được yêu cầu đồng nhất về hàm lượng DC.
- Hạn chế phản ứng oxy hóa – khử DC.
* Nhược điểm:
- Thời gian tiến hành kéo dài, giá thành sản phẩm cao, thiết bị phức tạp.
- Nhiều loại thuốc mới có bản chất protein dễ bị mất hoạt tính hoặc phá hủy trong
quá trình đông lạnh.
- Nếu quá trình đông khô tạo ra chất rắn vô định hình và dạng này không ổn định thì
sản phẩm sẽ không đạt được chất lượng như mong muốn [6].
10

1.3.2. Một số khái niệm khác

* Nhiệt độ kết tinh (Eutectic temparature, Te): là nhiệt độ thấp nhất mà ở đó dung
dịch vẫn tồn tại ở dạng lỏng. Hay chính là điểm giao nhau giữa đường cong đóng
băng và đường cong độ tan [30].

Hình 1.2. Giản đồ pha trong quá trình đông khô.
* Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Collapse Temparature, Tc): được định nghĩa là nhiệt độ
mà trên nhiệt độ đó các sản phẩm đông khô mất cấu trúc vĩ mô và sụp đổ trong
đông khô. Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thường được xác định là điểm băng bắt đầu tan
chảy được quan sát trên kính hiển vi đông khô [30].
* Nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Glass transition temperature, Tg’): Quá trình
chuyển hóa thủy tinh xảy ra khi nguyên liệu trải qua một sự thay đổi đáng kể về độ
nhớt khi qua một khoảng thay đổi nhỏ về nhiệt độ. Tg’ là giao điểm giữa đường
cong chuyển hóa thủy tinh và đường cong đông lạnh.
1.3.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô.
Quá trình ĐK có thể được chia thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp,
làm khô thứ cấp [11].
1.3.3.1. Giai đoạn đông lạnh
Trong quá trình đông lạnh chế phẩm, có thể xảy ra một trong các hiện tượng sau:
- Cách 1: Đơn giản nhất là trong quá trình làm lạnh, băng được hình thành. Khi đến
Te (nhiệt độ eutectic) một lượng chất tan đạt đến giới hạn độ tan và kết tinh khỏi
dung dịch. Sự kết tinh này gây loãng phần dung dịch còn lại làm hình thành nhiều
11

băng hơn, dẫn đến kết tinh nhiều chất tan hơn. Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp của
băng và chất tan kết tinh. Cách này chỉ xảy ở vài phần trăm các trường hợp.
- Cách 2: Trong hầu hết các trường hợp chất tan không kết tinh ở giới hạn độ tan,
băng tiếp tục được hình thành trong khi nhiệt độ giảm và dung dịch tiếp tục được cô
đặc cho đến khi nó nhớt đến mức chuyển hóa thành thủy tinh. Điều này xảy ra ở
một nhiệt độ đặc trưng gọi là nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (nhiệt độ chuyển kính)
Tg’. Đối với các sản phẩm xảy ra theo cách này, Tg’ là nhiệt độ mà băng bắt đầu

tan chảy trở lại và sản phẩm bất đầu bị phá vỡ cấu trúc (Tc = Tg’).
- Cách 3: Mặc dù hiếm nhưng có thể xuất hiện trường hợp sản phẩm có một thành
phần kết tinh còn các thành phần còn lại chuyển thành thủy tinh. Nhìn chung công
thức xảy ra theo cách này nên tránh vì có thể gây ra sự kết tinh không đồng nhất của
các hoạt chất [29].
* Nguyên nhân liposome bị tăng kích thước trong quá trình đông lạnh có thể do:
- Trong quá trình đông lạnh làm hình thành các tinh thể băng bên trong liposome
gây sự giãn nở của pha nước. Từ đó tạo áp lực gây nứt vỡ lớp màng lipid của
liposome thành các mảnh nhỏ. Các mảnh vỡ này sẽ tái lắp ráp thành các liposome
mới do hiện tượng kỵ nước và hình thành các liposome mới với kích thước khác. Sự
tái hợp này có thể gây hợp nhất các liposome với nhau [14].
- Việc sử dụng đệm cũng làm tăng KTTP hơn so với sử dụng nước cất. Các ion sẽ
làm ức chế các lực đẩy giữa các liposome (lực hydrat hóa hoặc lực điện) dẫn đến
tăng việc kết tụ của các mảnh vỡ do quá trình đông lạnh. Ngoài ra, đệm có thể tạo ra
1 gradien thẩm thấu qua lớp màng lipid của liposome dẫn đến sự bất ổn định của
một số khu vực trên màng do sự co rút thẩm thẩu. Những khu vực này dễ bị phá vỡ
khi đông lạnh [14]. Vì vậy người ta thường sử dụng các chất bảo vệ (lyoprotectant)
như: đường , glycerol, DMSO, PVP… để bảo vệ liposome trong quá trình đông
lạnh. Việc sử dụng glycerol ở nồng độ thấp kết hợp với mannitol có tác dụng làm
tăng sự đông nhất của mẫu trong quá trình đông lạnh [27].
12

1.3.3.1. Giai đoạn làm khô sơ cấp
Trong giai đoạn này, dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha
hơi bằng cách hạ áp suất của buồng ĐK xuống thấp hơn áp suất hơi bão hòa của
dung môi. Bằng cách đó, phần dung môi không liên kết sẽ được tách ra khỏi sản
phẩm. Tốc độ thăng hoa của nước đá được tính theo công thức:


 

  
  

Trong đó:
dm/dt: Tốc độ thăng hoa nước đá (g/cm2/giờ).
Pice: Áp suất hơi bão hòa của nước đá tại nhiệt độ của buồng ĐK (mmHg).
Pc: Áp suất của buồng ĐK (mmHg).
Rp : Hệ số cản trở thăng hoa của sản phẩm.
Rs: Hệ số cản trở thăng hoa của nắp [30].
Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt tính của liposome trong quá trình này:
- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh
nhưng áp suất quá thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào
chế phẩm. Áp suất buồng ĐK càng cao, hiệu suất quá trình làm khô sơ cấp càng
giảm.
- Nhiệt độ làm khô càng cao thì Pice càng tăng, hiệu suất quá trình sấy sơ cấp càng
tăng. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg’ (hệ vô định
hình) hoặc nhiệt độ eutectic Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của
hệ. Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm.
- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới
phá vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp.
1.3.3.2. Giai đoạn làm khô thứ cấp
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, hấp phụ trong khối bột sẽ được
loại bỏ bằng cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện áp suất
thấp để làm giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối ưu, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm
trong quá trình bảo quản. Nhiệt độ làm khô phải đảm bảo loại bỏ được phần nước
13

liên kết nhưng không làm ảnh hưởng đến đặc tính của liposome, thường từ 25-30
o
C

để đạt được tốc độ phản hấp thụ thích hợp [6], [12].
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome đông khô
Liposome ĐK cần có các đặc tính mong muốn nhất định:
- Duy trì được các đặc tính vật lý và hóa học gốc của sản phẩm ban đầu (bánh hình
thức đẹp, thời gian phân tán lại ngắn, kích thước và phân bố kích thước, hiệu suất
liposome hóa thay đổi không đáng kể).
- Độ ẩm tương đối chấp nhận được.
- Sự ổn định lâu dài [11].
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome ĐK, bao gồm:
1.3.4.1. Yếu tố thuộc về công thức
- Dược chất: Do cấu trúc lưỡng thân của các phospholipid, thuốc thân nước nằm
trong pha nước, còn thuốc thân dầu chủ yếu nằm trên màng lipid. Thuốc thân dầu
khó rò rỉ khỏi liposome so với những thuốc thân nước do độ tan kém trong nước sau
khi hydrat hóa lại [15].
- Dung môi: Thường dùng nhất là nước tinh khiết (nếu dùng cho chế phẩm vô
khuẩn, dùng nước để pha tiêm), bởi nhiều ưu điểm như: không độc, an toàn, dễ hóa
hơi, rẻ tiền, do đó tiết kiệm trong sản xuất [6].
- Hệ đệm: Hệ đệm được yêu cầu trong công thức để ổn định pH. Nên sử dụng hệ
đệm mà pH thay đổi ít nhất trong đông lạnh như citrate, tris [12].
- Tá dược tạo khung: Mục đích của nhóm tá dược này là tạo khuôn cho chế phẩm.
Các tá dược độn kết tinh (manitol, lactose, glycin…) tạo ra bánh ĐK có hình thức
đẹp, độ bền cơ học tốt, tuy nhiên không hiệu quả trong việc ổn định một số chế
phẩm như nhũ tương, protein, liposome…[12].
- Tá dược bảo vệ: Ngoài việc là tá dược tạo khung, disaccharides tạo thành dạng
thủy tinh vô định hình đã được chứng minh là có hiệu quả nhất trong việc ổn định
các sản phẩm như liposome và protein trong quá ĐK. Saccarose và trehalose được
sử dụng nhiều trong việc ổn định công thức liposome, protein và virut [12], [15].
14

Cơ chế bảo vệ: Hai giả thuyết đã được đưa ra để giải thích là Giả thuyết thay

thế nước và thủy tinh hóa.
+ Giả thuyết thay thế nước: Các tá dược bảo vệ thay thế nước tương tác với
phospholipid thông qua liên kết hydro để giúp liposome không bị nứt vỡ trong quá
trình đông lạnh và hydrat hóa trở lại. Tá dược bảo vệ tương tác với đầu phân cực
của phospholipid giúp duy trì khoảng cách giữa các đầu phân cực và giảm lực Van
der Waals giữa các chuỗi acyl của phospholipid. Nhờ đó tá dược bảo vệ làm giảm
sự tương tác giữa nước và phospholipid rồi sau đó thay thế nước. Các liên kết hydro
giữa tá dược bảo vệ và lipid được hình thành trên bề mặt của lớp màng kép. Việc bổ
sung các disaccharide không làm thay đổi lớp cấu trúc kép và các disaccharide là
một sự thay thế tốt cho nước dưới điều kiện khan. Một phân tử đường có thể tương
tác với tối đa ba lipid khác nhau cùng lúc. Thứ tự ưu tiên các nhóm của lipid tạo
liên kết hydro với nhóm OH của đường là: phosphate, methyl choline, cacbonyl. Vì
vậy, nhóm phosphate trên lớp màng kép là vị trí có khả năng nhất mà đường tương
tác. Tóm lại, tương tác trực tiếp giữa phospholipid và tá dược bảo vệ qua liên kết
hydro đóng vai trò quan trọng trong quá trình ĐK liposome [15].
+ Giả thuyết thủy tinh hóa: Tá dược bảo vệ hình thành dạng thủy tinh hóa ổn
định giữ cố định liposome khi nước đóng băng trong quá trình đông lạnh. Cấu trúc
thủy tinh hóa có độ nhớt cao và tính di động thấp, cần năng lượng kích hoạt rất cao
để bất kỳ tương tác nào xảy ra do đó ngăn ngừa liposome kết tụ và bảo vệ màng
lipid kép khỏi bị hư hại bởi các tinh thể băng. Cấu trúc này cũng ức chế sự thay đổi
liên quan tới giai đoạn chuyển pha của lipid. Chính vì vậy nó có thể giảm bớt thiệt
hại do tinh thể nước đá, ngăn ngừa hiện tượng hợp nhất, kết tụ và tránh quá trình
chuyển pha [15].
1.3.4.2. Yếu tố thuộc về kỹ thuật:
- Tốc độ làm lạnh chậm (0,5
o
C/phút) cho hàm lượng DC được giữ lại cao hơn [31].
- Trong quá trình làm khô sơ cấp, nhiệt độ sản phẩm phải được điều chỉnh xuống
dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Tc) của hệ [11].
15

- Thông số của quá trình sẽ được xác định bởi công thức. Ví dụ: Nếu sử dụng các
disaccharides có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thấp thì quá trình làm khô sơ cấp sẽ phải
thực hiện ở nhiệt độ thấp và kéo dài. ĐK với thể tích lớn sẽ cản trở quá trình thăng
hoa do đó kéo dài quá trình hơn [12].
1.4. Các nghiên cứu về L-AMB và đông khô L-AMB
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
A. Manosroi cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB với nguyên
liệu là HSPC, Chol và các phospholipid tích điện: dicetyl phosphate (-),
stearylamine (+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), nồng độ 0,05 mg
AMB/ mg lipid bằng phương pháp hydrat hóa film, sử dụng kĩ thuật siêu âm để
đồng nhất hóa và giảm kích thước tiểu phân, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh
giá mức độ ổn định của liposome. Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương
pháp li tâm ở tốc độ 50 000 g (ở 4ºC), trong 1h. Kết quả thu được các liposome có
kích thước từ 115 – 364 nm, hiệu suất liposome hóa trên 85% với tất cả các mẫu,
trong đó mẫu 7:2:1 (+) AMB cho hiệu suất nạp thuốc và ổn định nhất được lựa chọn
cho các nghiên cứu tiếp theo [20].
S.P. Shah và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB dạng bột xông hít
dùng điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở phổi, bằng phương pháp bốc hơi pha đảo sử
dụng hỗn hợp ethyl acetat và ethanol làm pha dung môi hữu cơ, pha nước là dung
dịch đệm Tris 0,01 M pH 6,5 chứa 1 mM EDTA. Liposome tạo ra được đùn ép qua
màng polycarbonat 2 µm, ở nhiệt độ 60ºC, loại dược chất không được gắn vào
liposome bằng li tâm ở tốc độ 4,38 × 10
3
trong 90 giây. Sử dụng HSPC, Chol và
phosphatidylglycerol đậu nành (7:3:0,5) hoặc stearylamin (1:1:0,1) để tạo liposome
AMB tích điện âm (AMB 1) hoặc dương (AMB 2), đông khô liposome bằng các tá
dược bảo vệ khác nhau, sau đó sử dụng sorbolac 400 và pharmatose 325M đã rây
qua rây 500 để làm chất mang tạo dạng liposome bột xông hít. Kết quả khảo sát các
điều kiện thí nghiệm cho thấy với tỷ lệ ethyl acetat: ethanol là 1:1, tỷ lệ pha nước:

pha dung môi hữu cơ là 1:5 tạo ra các liposome có đặc tính tốt nhất với kích thước
1,8 ± 0,2 µm (AMB 1) và 2,0 ± 0,3 µm (AMB 2), hiệu suất nạp thuốc 95,8 ± 1,5 %
16

(AMB 1) và 87,9 ± 1,3 (AMB 2). Trong các chất bảo vệ đã khảo sát, saccarose
được lựa chọn cho các nghiên cứu sau với tỷ lệ tối ưu lipid: saccarose là 1:5, sản
phẩm sau khi tạo dạng bột xông hít thì hiệu suất nang hóa là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1)
và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2). Liposome AMB tạo ra có tuổi thọ trên 1 năm, bảo quản ở
2-8 ºC [24].
1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Ngô Thị Bích Phượng đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương
pháp bốc hơi pha đảo với các tá dược là SPC và Chol theo tỉ lệ mol 5:5, môi trường
hydrat hóa là đệm phosphate pH 7,4, tỷ lệ % dược chất/tổng lượng lipid là 3mol%
cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI< 0,3) và hiệu suất
liposome hóa cao (khoảng 90%) [5].
Mai Thị Thùy Linh đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp
hydrat hóa film với các tá dược theo tỷ lệ mol HSPC: DSPG: Chol = 2:0,8:1,9, tỷ lệ
dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, môi trường hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5
cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI<0,2) và hiệu suất
liposome hóa cao (khoảng gần 90%) [4].
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về ĐK L-AMB ở Việt Nam được công bố.