Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro in vivo của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





AN PHƯƠNG HÀ


NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ
TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO
CỦA NHŨ TƯƠNG NANO
DICLOFENAC
DÙNG TRONG NHÃN KHOA



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





AN PHƯƠNG HÀ



NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ
TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO
CỦA NHŨ TƯƠNG NANO
DICLOFENAC
DÙNG TRONG NHÃN KHOA


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Trần Linh
2. DS. Đặng Thị Hiền
Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Trần Linh
DS. Đặng Thị Hiền
là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học
và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Bào chế, bộ môn Vật lý – Hóa lý và bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ
nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em
đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên


An Phương Hà

MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1
1.1. Thông tin về dược chất diclofenac 2
1.1.1. Công thức hóa học 2
1.1.2. Đặc tính lý hóa 2
1.1.3. Tác dụng dược lí 3
1.2. Thuốc nhỏ mắt Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Định nghĩa Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp tăng sinh khả dụng của thuốc nhãn
khoa 3
1.3. Nhũ tương nano 4
1.3.1. Định nghĩa 4
1.3.2. Một số ưu điểm của nhũ tương nano 4
1.3.4. Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện 5
1.4. Sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo 6

1.4.1. Định nghĩa 6
1.4.2. Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho
thuốc dùng trong nhãn khoa 6
1.4.2.1. Định nghĩa 6
1.4.2.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn
khoa 7
1.4.3. Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho
thuốc dùng trong nhãn khoa 8
1.4.3.1. Định nghĩa 8
1.4.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn
khoa 8
1.4.3.3. Tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích chập10
1.5. Tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.1
1.5.1. Định nghĩa Error! Bookmark not defined.1
1.5.2. Phân loại mức tương quan in vitro – in vivo . Error! Bookmark not defined.1
1.5.4. Thiết lập mối tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.2
1.5.4.1. Yêu cầu chung Error! Bookmark not defined.2
1.5.4.2. Thiết lập tương quan mức A Error! Bookmark not defined.4
1.5.5. Ứng dụng của tương quan in vitro – in vivo . Error! Bookmark not defined.4
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm 15
2.1.1. Hóa chất và nguyên liệu sử dụng 15
2.1.2. Thiết bị 15
2.1.3. Động vật thí nghiệm 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 16
2.3.2. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh 17
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ 18
2.3.3.1. Xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 18

2.3.3.2. Đo thế zeta 18
2.3.4. Phương pháp định lượng dược chất 18
2.3.5. Đánh giá sinh khả dụng 19
2.3.5.1. Các bước tiến hành thí nghiệm 19
2.3.5.2. Tính toán các thông số dược động học 22
2.3.5.3. Mức độ giải phóng dược chất in vivo 22
2.3.6. Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo 22
2.3.6.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 22
2.3.6.2. Xác định các điều kiện thử giải phóng dược chất in vitro (phương pháp mô
hình hóa đồ thị giải phóng) 24
2.3.6.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp 25
2.3.7. Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bao chế thích hợp 25
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học của nhũ tương nano
diclofenac trên mắt thỏ 26
3.1.1. So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và
dạng dung dịch 27
3.1.2. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so
với dung dịch 27
3.1.3. Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ 27
3.2. Xây dựng tương quan in vitro – in vivo 28
3.2.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 28
3.2.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng 30
3.2.3. Thiết lập tương quan 32
3.3. Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bào chế thích hợp 33
3.3.1. Thiết kế công thức 33
3.3.1.1. Lựa chọn thành phần 33
3.3.1.2. Xác định tỷ lệ các thành phần 34
3.3.2. Thiết kế thí nghiệm và kết quả 34
3.3.2.1. Các biến đầu ra 34

3.3.2.2. Các biến độc lập 35
3.3.2.3. Bố trí thí nghiệm và kết quả 35
3.3.2.4. Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ giải phóng in vivo của NTN so
với mức độ giải phóng in vivo tối đa của dung dịch (F
vivo
) 36
3.3.3. Lựa chọn công thức 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC












DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD Diclofenac
AIC
Tiêu chuẩn thông tin Akaike
(Akaike information criterion)
AUC

Diện tích dưới đường cong
(Area under curve)
CDH Chất diện hoạt
CTTƯ Công thức bào chế thích hợp
DAD
Detector mảng diod
(Diode Array Detector)
DC Dược chất
ĐDH Chất đồng diện hoạt
ĐNH Đồng nhất hóa
FDA
Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ
(Food and Drug Administration)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography)
IPM Isopropyl myristat
IVIVC Tương quan in vitro – in vivo
KLPT Khối lượng phân tử
kl/tt Khối lượng/thể tích
KTTP Kích thước tiểu phân
MRT
Thời gian lưu trung bình
(Mean residence time)
NSAIDs
Nhóm thuốc chống viêm không steroid
(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs)
NTN Nhũ tương nano
PdI
Chỉ số đa phân tán

(Polydispersity index)
PE Phần trăm sai số dự đoán
PG Propylen glycol
PL Phụ lục
PT Phương trình
SD
Độ lệch chuẩn
(Standard deviation)
SKD Sinh khả dụng
USP
Dược điển Mỹ
(The United States Pharmacopeia)










DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất và nguyên liệu sử dụng 15
Bảng 2.2. Các mô hình giải phóng khác nhau phù hợp với mô hình phân tích dữ liệu
in vitro 24
Bảng 3.1. Mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 27
Bảng 3.2. Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ
28
Bảng 3.3. Kết quả AIC của các môi trường giải phóng với các mô hình giải phóng

khác nhau 30
Bảng 3.4. Giá trị AIC theo tương quan giữa mức độ giải phóng in vitro trong các
điều kiện thử giải phóng và mức độ giải phóng in vivo của dược chất 32
Bảng 3.5. Các thành phần trong công thức NTN AD 34
Bảng 3.6. Các biến định tính 35
Bảng 3.7. Các biến định lượng 35
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc 36
Bảng 3.9. Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo 37
Bảng 3.10. Thành phần công thức NTN AD lựa chọn 39
Bảng 3.11. Kết quả F
vivo
– tỷ lệ giải phóng in vivo của CTTƯ so với dung dịch 39
Bảng P1. Kết quả thí nghiệm và tính toán trung bình 6 lô (n=6) PL1
Bảng P2. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường
đệm phosphat pH khác nhau PL2
Bảng P3. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường
đệm phosphat pH 7,4 có chứa Tween 80 và ethanol hàm lượng khác nhau PL2
Bảng P4. Các biến phụ thuộc PL3
Bảng P5. Thiết kế thí nghiệm cho NTN AD PL3
Bảng P6. Một số đặc tính của 20 công thức thiết kế PL3
Bảng P7. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm của 20 công thức thiết
kế PL3
Bảng P8. Tỷ lệ F
vivo
của mức độ giải phóng in vivo của dạng NTN với dạng dung
dịch của 20 công thức NTN thiết kế (n = 20) PL3
Bảng P9. Kết quả thử giải phóng in vitro của CTTƯ PL3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo acid diclofenac [36] 2
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian trung bình 6 lô 26
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 27
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số
môi trường đệm phosphat pH khác nhau 29

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số
môi trường đệm phosphat pH 7,4 khác nhau 29
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự giải phóng dược chất theo mô hình Weibull trong môi
trường phosphat pH 5,8 31
Hình 3.6. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại CDH thân nước và hàm lượng
CDH thân nước đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ở thời
điểm 75 phút 37
Hình 3.7. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại dung môi pha dầu (IPM và
Miglyol) và hàm lượng Transcutol HP đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so
với dung dịch ở thời điểm 180 phút 38
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn F
vivo
tại các thời điểm dự đoán và thực tế 40
Hình P1. Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CTTƯ PL4
Hình P2. Kết quả thế zeta mẫu NTN CTTƯ PL5
Hình P3. Sắc đồ của dung dịch acid diclofenac chuẩn PL6
Hình P4. Sắc đồ của NTN AD CTTƯ PL6
Hình P5. Mô hình thử nghiệm kỹ thuật thẩm tách micro [39] PL7


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các thuốc chống viêm không steroid - NSAIDs là một nhóm dược
chất quan trọng dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh về mắt.
Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này, là một dẫn chất acid phenyl
acetic có ưu điểm chính không gây ra các tác dụng phụ như thuốc chống viêm
không steroid khác như giảm đáp ứng miễn dịch, tăng nhãn áp và ức chế sự tái tạo
của lớp biểu mô giác mạc. Tuy nhiên sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất
thấp (chỉ khoảng 1 – 3%) do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nước

mắt và bản chất cấu tạo của các lớp giác mạc.
Do vậy, một số dạng bào chế đã được áp dụng như hỗn dịch, thuốc mỡ, nhũ
tương với mục đích làm tăng thời gian lưu thuốc. Với sự phát triển của công nghệ
nano, những ưu điểm của dạng bào chế nhũ tương, và thị trường Việt nam chưa có
chế phẩm thuốc nhỏ mắt NTN nào, bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào
chế nhũ tương nhỏ mắt diclofenac nhằm tăng tính thấm của dược chất, duy trì tác
dụng kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng. Hiện tại, công thức cơ bản
cho chế phẩm cũng như phương pháp bào chế đã được xác định [8], [9], [11], [12]
và bước đầu đã đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac
[10].
Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo của nhũ tương
nano diclofenac dùng trong nhãn khoa” với các mục tiêu:
1. Đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa.
2. Xây dựng tương quan in vitro – in vivo và ứng dụng tương quan để tối ưu hóa
công thức nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Thông tin về dược chất diclofenac
1.1.1. Công thức hóa học

Hình 1.1. Công thức cấu tạo acid diclofenac [36]
1.1.2. Đặc tính lý hóa
 Tính chất vật lý
 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng, hơi hút ẩm [7].
 Độ tan: Rất ít tan trong nước, độ tan trong nước ở 25
o
C thay đổi tùy theo giá

trị pH từ 17,8 – 1771 μg/mL [32]. Tan tốt trong dầu thực vật (dầu thầu dầu,
dầu oliu…) [13]; không tan/hexan, toluen; ít tan/cloroform; tan tốt/methanol;
tan rất tốt/dimethyl sulfoxyd, dimethyl formamid, dioxan… [44].
 Hấp thụ UV: λ
max
(methanol) = 285 nm; λ
max
(acetonitril) = 278 nm [44].
 Tính chất hóa học:
 Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hóa.
 Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu [5], [7].
 Dung dịch trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kali fericyanid, sắt
(III) clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa [5], [7].
 Định tính:
 Dựa trên các phản ứng đặc trưng trình bày ở mục tính chất hóa học [7].
 Đo phổ hồng ngoại và sắc kí lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn [7].
 Định lượng:
3

 Chuẩn độ trong môi trường khan: acid diclofenac có thể định lượng bằng
dung dịch kali hydroxyd trong methanol trong môi trường cloroform [5].
 Đo mật độ quang [7].
 Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [7].
1.1.3. Tác dụng dược lí
Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid – NSAIDs, có tác dụng ức
chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh. Các
thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh, diclofenac có khả năng ngăn chặn co đồng tử
xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm và đau mắt trong tổn thương
biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Không có dấu hiệu nào cho
thấy diclofenac có tác dụng phụ làm ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương [6].

1.2. Thuốc nhỏ mắt
1.2.1. Định nghĩa
Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nước, dung dịch dầu hoặc hỗn dịch vô khuẩn của
một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt. Chế phẩm cũng có thể được bào chế
dưới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, được hòa tan hoặc phân tán
vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng [2].
Tuy nhiên, trên thực tế thuốc nhỏ mắt cũng có thể là dạng nhũ tương. Ví dụ
như chế phẩm Restasis
TM
(Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt chứa cyclosporin A
0,05%; chế phẩm Refresh Dry Eye Therapy
®
(Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt
không có DC; chế phẩm Durezol™ (Sirion therapeutics, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt
chứa difluprednat 0,05% [20].
1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp làm tăng sinh khả dụng của
thuốc nhỏ mắt
Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt thường rất thấp. Chỉ có khoảng 1% - 3% lượng
DC có trong liều thuốc đã đưa vào mắt là thấm được qua giác mạc và phân bố đến
nơi tác dụng tại các khoang ở trong mắt. Đó là do tác động của cơ chế bảo vệ sinh
lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc [2].
4

Một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước [2], [27]:
 Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: hạn chế gây kích ứng mắt,
chất làm tăng độ nhớt, bào chế hỗn dịch, thuốc mỡ, gel, hệ cài đặt ở mắt,…
 Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: sử dụng các chất làm tăng tính
thấm của biểu mô giác mạc với dược chất: CDH (Tween 80, Brij…), thay
đổi tính thấm của dược chất với biểu mô giác mạc (tiền thuốc).
 Hiện nay các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương,

liposome, niosome, dendrime, tiểu phân chứa trong kính tiếp xúc…có kích
thước nm đến µm sử dụng cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu
nhiều, trong đó NTN với đặc điểm riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng
minh là có khả năng kéo dài thời gian tác dụng của thuốc, tăng sinh khả dụng
và hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh [27], [38].
1.3. Nhũ tương nano
1.3.1. Định nghĩa
Nhũ tương là một hệ phân tán cơ học vi dị thể, được tạo bởi hai chất lỏng
không đồng tan, trong đó một chất lỏng được phân tán đồng đều vào chất lỏng thứ
hai (môi trường phân tán) dưới dạng các tiểu phân có đường kính từ 0,1 đến hàng
chục micromet [2].
NTN (còn được gọi là nhũ tương siêu mịn, nhũ tương dưới micro), thường có
KTTP từ 50-200 nm, và có chỉ số đa phân tán thấp [23], [38], [43].
1.3.2. Một số ưu điểm của nhũ tương nano
 Sử dụng đơn giản và tiện lợi [38].
 Giảm kích ứng mắt với các dược chất dễ gây kích ứng [38].
 Giảm số lần dùng thuốc trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt, hạn chế tác
dụng phụ và tổn thương tế bào biểu mô mắt. Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ
làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân tán rộng và tăng thời gian tiếp xúc của
thuốc với giác mạc [38].
 Độ ổn định cao, ít bị lên bông, kết tụ, sa lắng như các nhũ tương micro [38].
5

1.3.3. Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện
Cùng với xu hướng chung của thế giới, tại Việt nam các hệ siêu vi tiểu phân
cũng đã được triển khai nghiên cứu rất nhiều. Tuy nhiên, dạng nano nhũ tương nhỏ
mắt chứa diclofenac chỉ mới lần đầu tiên được nghiên cứu bắt đầu ở bộ môn Bào
chế - trường Đại học Dược Hà nội từ năm 2011.
Đầu tiên, Vũ Ngọc Mai (2011) sử dụng phương pháp siêu âm đã bào chế
thành công NTN diclofenac (cả dạng acid và dạng muối) với ba loại pha dầu là

isopropyl myristat, Labrafac PG và Miglyol cùng với CDH Tween 80, Cremophor
EL, Span 80, ĐDH Transcutol HP. Đồng thời, tác giả cũng đánh giá được ảnh
hưởng của các loại hệ đệm, lượng pha dầu, nồng độ CDH và ĐDH đến độ ổn định
vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro [8].
Trên cơ sở đó, Nguyễn Thị Phượng (2012) lựa chọn dạng acid của
diclofenac, pha dầu isopropyl myristat với tỉ lệ các CDH và ĐDH thích hợp để so
sánh phương pháp bào chế siêu âm và siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao.
Kết quả cho thấy, tuy không có sự khác biệt về độ ổn định và tỉ lệ dược chất được
nhũ hóa nhưng phương pháp siêu âm kết hợp đồng nhất hóa có KTTP nhỏ hơn,
lượng dược chất giải phóng in vitro trong 2 giờ đầu là tương tự nhưng các giờ tiếp
theo siêu âm kết hợp đồng nhất hóa giải phóng nhiều hơn [9].
Nguyễn Hồng Vân (2012) tiếp tục thay đổi công thức bằng cách kết hợp cả
hai pha dầu Miglyol và isopropyl myristat, thay đổi các tỉ lệ CDH và ĐDH, bổ sung
thêm PG và bào chế bằng phương pháp phân cắt tốc độ cao. Sau đó tương tự các
nghiên cứu trên đánh giá độ ổn định vật lý, các đặc tính vật lý (KTTP, PdI, thế zeta,
độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro, qua đó đã lựa chọn ra 3 công
thức tối ưu để nghiên cứu độ ổn định trong 6 tháng. Sau 6 tháng KTTP, thế zeta, tỉ
lệ dược chất trong pha dầu, hàm lượng dược chất và phần trăm dược chất giải phóng
tại các thời điểm có thay đổi, nhưng vẫn có khả năng tác dụng kéo dài. Tác giả đã đi
đến kết luận NTN nhỏ mắt diclofenac bảo quản tốt nhất ở 2 – 8
o
C [12].
6

Nguyễn Thị Thúy (2013) lựa chọn ra 4 công thức, sử dụng phương pháp siêu
âm kết hợp phân cắt tốc độ cao hoặc đồng nhất hóa áp suất cao để khảo sát nâng
quy mô bào chế từ 100 mL lên 1000 mL. Tác giả đã tìm được thời gian siêu âm
cũng như đồng nhất hóa thích hợp thông qua đánh giá các đặc tính vật lý (KTTP,
PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro [11].
Tiếp tục, Quản Duy Quang (2014) đã tiến hành thẩm định phương pháp định

lượng và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của NTN diclofenac, lựa chọn phương
pháp bào chế siêu âm. Tác giả đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định
lượng diclofenac trong dịch tiền phòng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
kết hợp thêm chuẩn với tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đạt tiêu chuẩn của
FDA. Nghiên cứu đã bước đầu đánh giá sinh khả dụng trên mắt thỏ (thực hiện trên
3 lô mẫu) và cho kết quả dạng NTN có nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng
cao hơn so với dạng dung dịch ở đa số các thời điểm lấy mẫu, NTN có mức độ giải
phóng in vivo gấp khoảng 1,34 lần so với dạng dung dịch [10].
Với những kết quả đã đạt được, nghiên cứu hoàn thiện đánh giá sinh khả
dụng in vivo ở giai đoạn tiếp theo là cần thiết để có những đánh giá, lựa chọn giá trị
hơn trong việc xây dựng tương quan in vivo – in vitro để ứng dụng tìm ra công thức
bào chế thích hợp.
1.4. Sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo
1.4.1. Định nghĩa
Sinh khả dụng là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một
chế phẩm bào chế vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính và đưa
đến nơi tác dụng. Tùy thuộc phương pháp đánh giá, sinh khả dụng được phân thành
hai loại là sinh khả dụng in vitro và sinh khả dụng in vivo [4].
1.4.2. Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro
cho thuốc dùng trong nhãn khoa
1.4.2.1. Định nghĩa
7

Sinh khả dụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ
dạng thuốc [4].
1.4.2.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong
nhãn khoa
Các thiết bị sử dụng:
 Bình Franz: mẫu NTN được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường
khuếch tán ở ngăn nhận phía dưới (receptor), màng thử giải phóng được đặt giữa hai

phần. Sau thời gian nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán để định lượng, và
bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [22], [28].
 Màng giải phóng: thường sử dụng màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có
giới hạn KLPT thường 12 – 14 kDa [28]. Các màng này thường được xử
lý bằng môi trường khuếch tán trước khi tiến hành thí nghiệm.
 Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 [14] hoặc dung
dịch nước mắt nhân tạo [24], được điều nhiệt để duy trì nhiệt độ thích hợp
và khuấy trộn với tốc độ nhất định.
 Nhiệt độ: 34±0,5
o
C (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) [14], [24] hoặc 37±0,5
o
C
[17].
 Qi Li (2014) sử dụng bình Franz để nghiên cứu giải phóng in vitro của
Tacrolimus dùng cho nhãn khoa. Mẫu Tacrolimus được chứa ở ngăn cho phía trên
(donor), môi trường khuếch tán là hỗn hợp ethanol: nước mắt nhân tạo tỷ lệ thể tích
25:75, màng thử giải phóng là giác mạc của thỏ được sử dụng trong nghiên cứu
được đặt giữa hai phần. Sau các khoảng thời gian nhất định, 1 mL mẫu từ môi
trường khuếch tán được lấy ra định lượng bằng phương pháp HPLC với detector
UV (G1314A VWD) tại bước sóng 220 nm; và bổ sung lại thể tích môi trường
khuếch tán mới tương ứng [30].
 Thiết bị thẩm tách micro (hình P5 – PL 7) [39].
 Naseem A. Charoo và cộng sự (2003) nghiên cứu giải phóng in vitro từ hệ
phân phối thuốc Ciprofloxacin hydroclorid dùng cho nhãn khoa bằng phương pháp
thẩm tách. Sử dụng thiết bị thẩm tách, màng giải phóng là màng mắt nhân tạo, môi
8

trường khuếch tán là nước mắt nhân tạ o pH 7,4 được khuấy liên tục bằng máy
khuất từ, nhiệt độ được duy trì ở mức 37±0,5

o
C, tại các thời điểm lấy 3 mL mẫu và
bổ sung 3 mL môi trường khuếch tán, lọc mẫu và đem đo quang tại bước sóng 274
nm, sử dụng dung dịch nước mắt nhân tạo pH 7,4 làm mẫu trắng [18].
 Thiết bị thử hòa tan [14], [15], [17], [42], [50].
 H. O. Ammar (2009) đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nano
dorzolamid dùng cho nhãn khoa, nghiên cứu giải phóng in vitro được tiến hành:
thiết bị sử dụng là thiết bị thử hòa tan (SR8 PLUS, máy thử hòa tan Handson, Mỹ),
900 mL môi trường giải phóng là đệm phosphat (pH 7,4), nhiệt độ môi trường được
cài đặt là 34±0,5
o
C, tốc độ khuấy là 50 vòng/phút, tiến hành thử nghiệm trong 6 giờ,
NTN được chứa trong túi thẩm tích với 2 đầu được kẹp chặt. Tại những thời điểm
nhất định, lấy 5 mL mẫu từ môi trường khuếch tán (bổ sung thế tích môi trường
tương ứng) và định lượng DC bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 252,6 nm
[14].
1.4.3. Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo
cho thuốc dùng trong nhãn khoa
1.4.3.1. Định nghĩa
Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào
chế [4].
1.4.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong
nhãn khoa
Để đánh giá sinh khả dụng, dược động học hay tác dụng dược lý của một
thuốc bất kì trước hết tiến hành thử nghiệm đánh giá trên động vật. Với thuốc nhỏ
mắt thỏ được lựa chọn bởi sự giống nhau tương đối giữa cấu tạo giải phẫu và các
thông số sinh lý cơ bản giữa mắt người và mắt thỏ [33].
Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ
mắt trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời
điểm rất ít và khó lấy mẫu. Mặt khác với những thuốc mà đích tác dụng là trong

9

nhãn cầu thì định lượng dược chất trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là
khu vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt [37]. Vì
vậy phương pháp này đã được dược sĩ Quản Duy Quang sử dụng trong nghiên cứu
để đánh giá sinh khả dụng nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac. Nghiên cứu đã xây
dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt
thỏ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp thêm chuẩn với giới hạn
định lượng dưới khoảng 500 ng/mL, khoảng tuyến tính: từ khoảng 500 đến 8200
ng/mL và tính đặc hiệu độ đúng độ chính xác đạt tiêu chuẩn của FDA [10].
 Nguyễn Thị Mai Anh (2014) đã tiến hành đánh giá sinh khả dụng in vivo của
hỗn dịch nhỏ mắt chứa piroxicam nano bằng phương pháp định lượng dược chất
trong thủy dịch. Nghiên cứu thực hiện lấy thủy dịch mắt thỏ sau khi đã nhỏ hỗn dịch
chứa piroxicam nano vào mắt thỏ tại từng thời điểm thích hợp, loại bỏ protein trước
khi định lượng bằng cách trộn mẫu với đồng lượng methanol hoặc acetonitril sau đó
ly tâm tốc độ cao, hút lấy phần dịch trong, tiến hành phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao detector DAD tại bước sóng 254 nm và cho kết quả trong 30 phút đầu
C
max
của hỗn dịch nano cao gấp đôi so với hỗn dịch bào chế từ nguyên liệu đầu [1].
 Xiang – Gen Wu và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu sinh khả dụng in
vivo của hỗn dịch chứa mycophenolat mofetil nano bằng phương pháp định lượng
dược chất trong thủy dịch. Sau khi nhỏ 50 µL hỗn dịch chứa mycophenolat mofetil
vào cả hai mắt thỏ, mí mắt của thỏ được đậy lại trong 30 giây và sau đó tại các thời
điểm nhất định sau khi tiêm, thủy dịch được thu thập và xử lý bằng cách trộn thủy
dịch với hỗn hợp acid hydrocloric 1M và methanol (tỷ lệ 4:14), đem ly tâm lấy dịch
trong đem định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [51].
 Evren H. Gökçe và cộng sự (2009) tiến hành nghiên cứu giải phóng in vivo
của nano lipid rắn cyclosporin – A dùng cho nhãn khoa. Tiến hành nghiên cứu trên
thỏ đực cân nặng khoảng 2,5 – 3,5 kg, nhỏ 50 µL nano lipid rắn cyclosporin – A (đã

tiệt khuẩn) vào mắt phải của thỏ, và bên mắt trái của thỏ nhỏ cùng một lượng thể
tích 50 µL nhũ tương nhỏ mắt cyclosporin – A trên thị trường (Restasis
®
) để so
sánh mức độ giải phóng in vivo của hai dạng bào chế. Sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, và 24
10

giờ lấy thủy dịch ở mỗi mắt thỏ bằng kim tiêm cẩn thận không làm hỏng màng giác
mạc (trước khi dùng kim tiêm hút dịch tiền phòng, mắt thỏ được gây tê bằng thuốc
nhỏ mắt chứa 0,5% proparacain hydroclorid). Xử lý dịch tiền phòng bằng 10 µL của
6% acid percloric trong methanol trước khi đem định lượng bằng HPLC với
detector UV tại bước sóng 210 nm. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng dạng bào chế
nano lipid rắn có thời gian lưu giữ trên bề mặt giác mạc lâu hơn, sinh khả dụng cao
hơn so với dạng bào chế nhũ tương trên thị trường (Restasis
®
) [25].
1.4.3.3. Tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích
chập.
Đánh giá mức độ và tốc độ hấp thu thuốc là một trong những nội dung quan
trọng trong đánh giá sinh khả dụng của thuốc và phương pháp không dựa trên mô
hình ngăn thường được lựa chọn để tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc. Theo
phương pháp không dựa trên mô hình ngăn, mức độ giải phóng dược chất in vivo
được tính toán bằng phương pháp giải tích chập (deconvolution) [40], [41].
Nếu gọi:
 C(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi
dùng đường ngoài tĩnh mạch.
 r
abs
(t) là hàm số biểu thị tốc độ hấp thu theo thời gian.
 C

δ
(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi
tiêm tĩnh mạch.
thì:
 Tại một thời điểm τ bất kì, có một lượng r
abs
(τ).dτ được hấp thu.
 Đến thời điểm t, một khoảng thời gian ứng với (t –τ) đã trôi qua. Lượng
thuốc hấp thu đó sẽ thải trừ tương ứng như với quá trình thuốc được tiêm
tĩnh mạch. Nghĩa là lượng thuốc còn lại trong cơ thể sẽ chỉ là C
δ
(t – τ).
r
abs
(τ).dτ.
 Nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm t sẽ bằng tổng cộng các vi phân C
δ
(t–
τ). r
abs
(τ).dτ trong khoảng từ 0→t
11


(

)
=






(
 − 
)
.

(

)

Nếu biết hai hàm C(t) và C
δ
(t) ta sẽ tính được r
abs
(t). Kết quả có thể được tối ưu hóa
thông qua tái tích chập (WLS Reconvolution). Tổng lượng dược chất được hấp thu
tới thời điểm t (A
t
) sẽ được tính theo công thức:


=



(

)





Phương trình trên có thể cho phép xác định phần trăm hấp thu A
t
/A
∞
theo thời gian
và cơ chế của động học hấp thu.
1.5. Tương quan in vitro – in vivo
1.5.1. Định nghĩa
Theo FDA: Mối tương quan in vitro – in vivo là một mô hình toán học mô tả
mối quan hệ giữa đặc tính in vitro của một dạng bào chế và đáp ứng in vivo tương
ứng. Thông thường, đặc tính in vitro chính là tốc độ hoặc, và mức độ giải phóng
dược chất và đáp ứng in vivo là nồng độ thuốc trong máu hay lượng thuốc được hấp
thu [46]. Dược điển Mỹ định nghĩa IVIVC là sự thiết lập một mối liên hệ hợp lý
giữa một đặc tính sinh học hoặc một thông số của nó với một đặc tính hóa lý của
dạng bào chế [48].
1.5.2. Phân loại mức tương quan in vitro – in vivo
Có bốn mức tương quan đã được mô tả trong FDA guideline, trong đó bao
gồm mức độ A, B, C và đa mức C [46]. Khái niệm các mức tương quan được dựa
trên khả năng của các mối tương quan để phản ánh nồng độ thuốc trong huyết tương
theo thời gian để quản lý các hình thức liều lượng nhất định [46].
Tương quan mức A
Là mức tương quan cao nhất, thể hiện quan hệ từng điểm giữa tốc độ hòa tan
in vitro và tốc độ hấp thu in vivo của thuốc từ dạng bào chế [26], [46]. Tỷ lệ %
thuốc hấp thu có thể được tính toán theo phương pháp phụ thuộc mô hình như của
Wagner – Nelson hoặc phương pháp không phụ thuộc mô hình (giải tích chập).
12

Mục đích của tương quan mức A là xác định một mối quan hệ trực tiếp giữa
dữ liệu in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro để xác định tỷ lệ sinh dược học của các
dạng bào chế [26], [46].
Tương quan mức B
Một IVIVC mức độ B sử dụng nguyên tắc phân tích thời điểm thống kê
(statistical moment analysis). Thời gian hòa tan in vitro trung bình của sản phẩm
được so sánh với thời gian lưu trú in vivo trung bình hoặc thời gian hấp thu in vivo
trung bình. Mối tương quan mức B cũng sử dụng tất cả các dữ liệu in vivo và in
vitro, mặc dù các dữ liệu không tương quan từng điểm như mức A. Mối tương quan
mức B không phản ánh chính xác đường cong nồng độ thuốc trong máu theo thời
gian vì một số đường cong in vivo khác nhau lại cho các giá trị thời gian lưu giữ
như nhau [26], [46].
Tương quan mức C
Tương quan mức C liên quan đến cùng một thời điểm giải phóng (T50%,
T90% ) để có một thông số dược động học trung bình như AUC, T
max
, hoặc C
max
.
Đây là mức tương quan thấp nhất, mối liên hệ giữa các thành phần hấp thu và giải
phóng được thành lập khi nó không phản ánh hình dạng hoàn chỉnh của đường cong
nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian (yếu tố quan trọng xác định hiệu
suất của một sản phẩm thuốc). Do những hạn chế rõ ràng của nó, ưu điểm của tương
quan mức C được giới hạn trong việc dự đoán dữ liệu in vivo của thuốc. Trong giai
đoạn đầu của phát triển công thức, tương quan mức C có thể có ích để lựa chọn
công thức khi mà nghiên cứu tương đương sinh học rất khó khăn [26], [46]
Tương quan đa mức C
Tương quan mức C là có sự liên quan giữa một vài thông số dược động học
(C

max
, AUC, hoặc các thông số thích hợp khác) với khối lượng thuốc được hòa tan
in vitro tại một vài thời điểm khác nhau [26], [46].
1.5.3. Thiết lập mối tương quan in vitro – in vivo
1.5.3.1. Yêu cầu chung [46]
13

Để thiết lập một IVIVC cần phải có đầy đủ các dữ liệu hòa tan in vitro và dữ
liệu hấp thu in vivo của cùng lô thuốc.
Dữ liệu hòa tan in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập tương
quan. Mục đích của nghiên cứu giải phóng in vitro trong giai đoạn đầu của nghiên
cứu phát triển thuốc là lựa chọn công thức tối ưu, đánh giá các thành phần hoạt chất
và tá dược, và đánh giá bất kì sự thay đổi nhỏ của sản phẩm thuốc. Trong giai đoạn
đầu của sự thiết lập tương quan, điều kiện giải phóng có thể được thay đổi để tạo
được tương quan điểm – điểm giữa dữ liệu hòa tan in vitro và dữ liệu hòa tan in
vivo. Đối với tương quan in vitro – in vivo, phép thử in vitro được đề xuất là một
thay thế cho sinh khả dụng của thuốc. Do vậy, điều kiện giải phóng in vitro nên
giống nhau cho tất cả các công thức thử nghiệm trong nghiên cứu tương đương sinh
học. Phép thử in vitro có thể được thay đổi cho đạt mối tương quan như thay đổi tốc
độ khuấy, thay đổi pH hay nhiệt độ môi trường. Một khi đã lựa chọn được phương
pháp thích hợp cho một thuốc, các điều kiện hòa tan sẽ được áp dụng cho tất cả các
công thức bào chế. Cũng có thể thử một công thức bào chế trong tất cả các môi
trường hòa tan độc lập, ngoài môi trường bắt buộc theo quy định, thử thêm ít nhất ba
môi trường (như đệm phosphat pH 4,5; 5,8; và 6,8…) mô phỏng môi trường hòa tan
thuốc [46]. Các chất diện hoạt (ví dụ: Tween 80, hay chất hoạt động bề mặt như
natri lauryl sulfat 1%) hay ethanol thường được thêm vào môi trường hòa tan đối
với những thuốc ít tan [21], [46]. Thể tích môi trường hòa tan phụ thuộc vào thiết bị
khuấy và công thức được thử. Với mục đích thiết lập IVIVC, dữ liệu hòa tan phải
lấy ít nhất 12 đơn vị liều lượng riêng từ mỗi lô. Hệ số biến thiên của các dữ liệu hòa
tan trung bình mỗi lô không được vượt quá 10%. Điều kiện thử hòa tan cần được

xây dựng để các dữ liệu thử hòa tan nằm trong hoặc tại giới hạn trên và giới hạn
dưới của dữ liệu thử tương đương sinh học. Cần lấy dữ liệu hòa tan tại ít nhất 3
điểm, thời điểm lấy cần bao hàm giai đoạn đầu, giữa và cuối của quá trình hòa tan, ít
nhất 80% dược chất được giải phóng tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng, nếu lượng
dược chất có khả năng hòa tan tối đa nhỏ hơn 80% thì thời điểm lấy mẫu cuối cùng
khi quá trình hòa tan đạt trạng thái ổn định [46].