Tiếp tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid amphotericin b

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ THÙY NGÂN

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC
HỢP LIPID AMPHOTERICIN B


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2015






BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY NGÂN


TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC
HỢP LIPID AMPHOTERICIN B


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1.TS. Trần Thị Hải Yến
2.DS. Dương Thị Thuấn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI - 2015







LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Trần Thị Hải Yến
DS. Dương Thị Thuấn
Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Đào Văn Nam đã cho em nhiều lời khuyên bổ
ích và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật
viên bộ môn Bào chế và bộ môn Vật lý - Hóa lý - Trường Đại học Dược Hà Nội đã
giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này.
Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy
bảo em suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
luôn bên cạnh cổ vũ, cho em chỗ dựa tinh thần vững chắc và là nguồn động lực lớn
lao cho em trong suốt quá trình 5 năm học.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Thùy Ngân




MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B. 2
1.1.1.Nguồn gốc. 2
1.1.2. Công thức hóa học. 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng. 3
1.1.5. Dược động học. 4
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn. 5
1.1.8. Liều dùng. 5
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường. 6
1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B. 7

1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B. 7
1.2.2. Cơ chế hình thành. 9
1.2.3. Thành phần phospholipid trong phức hợp. 10
1.2.4. Độ ổn định của phức hợp lipid AMB. 12
1.2.5. Ưu nhược điểm 12
1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B. 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu. 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu. 17
2.3.1. Phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B. 17
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức
hợp lipid Amphotericin B. 20
2.3.3. Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân của phức hợp lipid
Amphotericin B. 20



2.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid Amphotericin B. 21
2.3.5. Tính ổn định về KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ của phức hợp
lipid Amphotericin B. 22
2.3.6. Phương pháp chứng minh mẫu bào chế là phức hợp lipid. 22
2.4. Điều kiện thí nghiệm. 23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến các đặc tính của phức
hợp lipid. 24
3.1.1. Ảnh hưởng tỉ lệ dược chất/tổng số mol phospholipid (M/M). 24
3.1.2. Ảnh hưởng của pha nước. 26
3.1.3. Theo dõi độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 và B1. 28
3.1.4. Chứng minh mẫu A1 và B1 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét

nhiệt vi sai. 29
3.2. Bào chế phức hợp lipid Amphotericin B có tỉ lệ mol AMB bằng 100%/
tổng số mol lipid. 31
3.2.1. Ảnh hưởng của pha nước. 32
3.2.2. Phương pháp hydrat hóa màng film. 33
3.2.3. Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân. 35
3.2.4. Độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP của mẫu N2 sau siêu âm 3’. 36
3.2.5. Chứng minh công thức N2 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét
nhiệt vi sai. 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC





DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
AMB
Amphotericin B
2
Dd
Dung dịch
3
DĐVN
Dược điển Việt Nam

4
DMPC
α – Dimyristoylphosphatidylcholin
5
DMPG
1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol
6
DMSO
Dimethyl sufoxide
7
DSPG
Distearoylphosphatidylglycerol
8
HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated
soy phosphatidylcholine)
9
KTTP
Kích thước tiểu phân
10
LTT
Lọc tiếp tuyến
11
NSX
Nhà sản xuất
12
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
13
TKHH

Tinh khiết hóa học
14
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
15
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình





DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 6
Bảng 2.1. Nguyên liệu 16
Bảng 3.1. Thành phần các công thức nhóm thay đổi tỉ lệ dược chất 23
Bảng 3.2. KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB 24
Bảng 3.3. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 26
Bảng 3.4. KTTP, phân bố KTTP của nhóm thay đổi pha nước 26
Bảng 3.5. KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 sau bào chế và trong quá trình bảo quản
27
Bảng 3.6. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 31
Bảng 3.7. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu M2 33
Bảng 3.8. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu N2 33
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của siêu âm 30s nghỉ 30s đến việc giảm KTTP 34
Bảng 3.10. KTTP, phân bố KTTP mẫu N2 siêu âm 3 phút sau siêu âm và sau bảo
quản 1 tuần 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của AMB 3
Hình 1.2. Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị
trường 8
Hình 1.3. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB 10
Hình 1.4. Phân tử HSPC 11
Hình 1.5. Phân tử DSPG 11
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng
phương pháp thay đổi dung môi 18
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng
phương pháp hydrat hóa màng film 19
Hình 3.1. Mẫu CT3 và CT4 sau 1 tuần bào chế .24
Hình 3.2. Đồ thị KTTP, phân bố KTTP nhóm thay đổi tỉ lệ AMB 25
Hình 3.3. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu A1 28
Hình 3.4. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 29
Hình 3.5. Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 30
Hình 3.6. Mẫu N2 sau bào chế 33
Hình 3.7. Đồ thị quét nhiệt vi sai của mẫu N2 36
Hình 3.8. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 37
Hình 3.9. Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 37




1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân quan trọng gây bệnh tật và tỷ lệ tử vong ở
bệnh nhân suy giảm miễn dịch (ghép, hóa trị liệu, AIDS). Amphotericin B (AMB)
là một trong các kháng sinh polyen macrolide hiệu quả nhất cho việc điều trị nhiễm
nấm hệ thống và nội tạng trong cơ thể người. Tuy nhiên, do sinh khả dụng đường
uống thấp nên thuốc thường được sử dụng dưới dạng tiêm. Do dạng chế phẩm
Amphotericin B quy ước (chế phẩm Fungfizone) không bền trong hệ tuần hoàn và
nhanh chóng chuyển từ dạng micelle sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật
chủ, đặc biệt là độc tính trên thận, mà trong suốt những thập kỉ gần đây các nhà
khoa học đã không ngừng nghiên cứu nhằm phát triển dạng mang thuốc mới có thể
cải thiện các nhược điểm kể trên. Từ đó đã cho ra đời các dạng thuốc có tính ứng
dụng cao như vi nang, vi cầu, liposome, phức hợp lipid… Trong đó phức hợp lipid
là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các
phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn là hệ mang thuốc
có nhiều triển vọng trong giảm độc tính và tăng khả năng mang dược chất.
Trong đề tài nghiên cứu của Dược sĩ Nguyễn Thị Mỹ đã bào chế được phức
hợp lipid chứa AMB có tỷ lệ SPC: DSPG là 7:3 với tổng số mol lipid là 200 µmol;
môi trường phân tán đệm pH 7,4; và 25 mol % AMB/tổng lượng lipid cho hiệu suất
nạp dược chất cao (87,06 %), KTTP là 648,3 nm; phân bố KTTP tương đối đồng
đều (PDI = 0,363). Tuy nhiên nghiên cứu chưa đưa ra phương pháp chứng minh
mẫu sau bào chế là phức hợp lipid. Do đó, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid
làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài “ Tiếp
tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid Amphotericin
B” nhằm mục tiêu:
+ Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế phức hợp lipid
Amphotericin B.
+ Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu
phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid Amphotericin B.

2



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B.
1.1.1. Nguồn gốc.
Amphotericin B là một hỗn hợp các polyen chống nấm được sản xuất bằng
cách nuôi cấy một số giống Streptomyces nodosus hoặc bằng các phương pháp
khác, chứa chủ yếu là amphotericin B [2]. Đặc tính kháng khuẩn được ghi nhận lần
đầu tiên vào năm 1950 và được đưa vào thị trường vào năm 1958 [10].
1.1.2. Công thức hóa học.

- Công thức hóa học: acid ( 1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S,
19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S) -33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-
D-mannopyranosyl)oxy]-1, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 37-octa-hydroxy-15, 16, 18 trimethyl-
13 –oxo-14, 39-dioxa-bicyclo-[33.3.1] nonatriaconta-19, 21, 23, 25, 27, 29, 31-
heptaen-36 carboxylic [2].
-
Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17.
- Khối lượng phân tử: 924,08.
- pK
a1
= 5,5; pK

a2
= 10 [1].
1.1.3. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam.
3


- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid
(DMSO) 30- 40 mg/ml và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2- 4
mg/ml), rất khó tan trong methanol [1].
 Hóa tính:
- Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và
nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất như sau:
+ Tính lưỡng thân: phân tử AMB có một đầu thân dầu, một đầu thân nước.
+ Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các
dung dịch kiềm.
+ Dung dịch 0,0005% trong methanol ở vùng sóng từ 300- 450 nm có cực đại
hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57-
0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với ở 405 nm là 0,87- 0,93 [1].
1.1.4. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng.
 Phổ tác dụng: Amphotericin B là thuốc kháng nấm phổ rộng, có tác dụng
trên nhiều loại nấm bề mặt và nội tạng, như Candida, Cryptococcus, Neoformans,
Aspergillus, Histoplasma, Coccidioid, Blastomyces, Sporothrix. Nồng độ ức chế tối
thiểu với các loại nấm từ 0,03- 1µg/mL [3].
 Cơ chế tác dụng:


4

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của AMB
Amphotericin B gắn vào ergosterol trên màng tế bào nấm, làm thay đổi tính
thấm của màng tế bào với các ion, nhất là K
+
, Mg
2+
, nên tế bào nấm bị tiêu diệt.
Các vi khuẩn và virus không có ergosterol nên không nhạy cảm với
amphotericin B và các polyen khác. Trên người và động vật, amphotericin B gắn
được vào cholesterol, gây các tác dụng không mong muốn [3].
Ái lực của AMB với ergosterol màng tế bào nấm lớn hơn với cholesterol màng
tế bào người nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng
tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các biểu hiện: suy thận,
tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu… [3].
1.1.5. Dược động học.
- Hấp thu: AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, do vậy thuốc chủ yếu
được tiêm truyền tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân và chỉ dùng
đường uống để điều trị tại chỗ (nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng).
- Phân bố: Amphotericin B liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố
rộng rãi trong cơ thể nhưng chỉ một lượng nhỏ vào dịch não tủy. Nửa đời của thuốc
trong huyết tương khoảng 24h, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới
15 ngày. Chi tiết về sự phân bố trong các mô vẫn chưa được biết.
- Chuyển hóa: Chưa được làm rõ.
- Thải trừ: Amphotericin B bài tiết rất chậm qua thận, với 2 - 5% liều đã dùng
bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học. Sau khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy
thuốc trong nước tiểu ít nhất sau 7 tuần. Lượng thuốc tích lũy trong nước tiểu sau 7
ngày xấp xỉ 40% lượng thuốc đã truyền. Có thể do vậy mà amphotericin có nguy cơ
gây độc cao với thận. Không loại được amphotericin ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách

máu [4].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida
albicans ở miệng và ở đường tiêu hóa.
5


- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng để điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm
Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodesimmitis, Cryptococus,
Hitstoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã
điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc điều trị ung thư bằng hóa chất.
- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc
gây suy thận [4].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn.
- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K
+
và
Mg
2+
huyết, đau và viêm tắc tĩnh mạch nơi tiêm [3].
1.1.8. Liều dùng.
Đường tiêm, truyền tĩnh mạch: Thông thường amphotericin được truyền tĩnh
mạch. Trước khi bắt đầu điều trị với bất cứ dạng tiêm tĩnh mạch nào của
amphotericin, phải cho 1 liều test và phải theo dõi người bệnh cẩn thận trong
khoảng 30 phút.
AMB quy ước (Fungizone): Sau khi cho liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền

trong vòng 20 - 30 phút), điều trị thường bắt đầu với liều hàng ngày 250
microgam/kg, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày; nếu người bệnh rất nặng, liều có
thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày. Nếu điều trị phải ngừng lâu trên
7 ngày, khi bắt đầu tiêm lại, liều phải là 250 microgam/kg/ngày và tăng dần. Liều
hàng ngày được tiêm truyền trong vòng 2 - 4 giờ với nồng độ 100 microgam/ml
với dung dịch glucose 5%. Có thể tiêm truyền chậm hơn, tới 6 giờ, để giảm tỷ lệ
tác dụng độc cấp.
Amphotericin dạng liposom: Sau 1 liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền trong
10 phút), liều thông thường là 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3 mg/kg nếu cần. Liều
6


hàng ngày được tiêm truyền trong vòng 30 - 60 phút với nồng độ 200 đến 2000
microgam/ml trong dung dịch glucose 5%.
Phức hợp lipid amphotericin: Sau 1 liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền trong
15 phút), liều thông thường là 5 mg/kg/ngày. Liều hàng ngày được truyền với tốc
độ 2,5 mg/kg/giờ như 1 dịch treo pha loãng chứa 1 mg/ml trong dung dịch glucose
5%.
Đường uống:
Viên để tan trong miệng 10 mg: 4 viên/ngày, nếu cần có thể dùng tới 8
viên/ngày.
Hỗn dịch chứa 100mg/ml: liều 1 ml, 4 lần mỗi ngày, phải giữ dịch treo trong
miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt.
Amphotericin cũng còn được dùng tại chỗ hoặc dung dịch phun sương [3, 4].
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường.

Bảng 1.1: Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường [6,11].
TT
Tên chế
phẩm

Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
Kttp
(µm)
Dạng
bào
chế
Liều
dùng
1
Fungizone
50 mg
AMB và natri
deoxycholat
Micell
< 0,4
Bột
đông
khô
1 mg/kg/
ngày
2
Abelcet
100
mg/20
ml
DMPC:DMP

G:AMB
(tỷ lệ mol
7:3:10)
Phức hợp
lipid dạng
dải ruy
băng
1-10
Hỗn
dịch
5 mg/kg/
ngày
3
Amphotec
50
mg,
100
mg
Phức hợp
AMB với
cholesteryl
sulfat
Phức hợp
lipid dạng
đĩa
0,12
Bột
đông
khô
3 -4

mg/kg/
ngày
7


(tỷ lệ mol 1:1)
4
Ambisome
50 mg
HSPC:DSPG:
Chol:AMB
(tỷ lệ mol
2:0,8:1:0,4)
Liposome
0,08
Bột
đông
khô
3 – 5
mg/kg/
ngày

1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B.
1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B.
Ngày nay, có nhiều nghiên cứu tạo phức AMB trong các dạng bào chế kết hợp
với lipid (lipid-based formulations) nhằm giảm lượng AMB tự do, từ đó nâng cao
chỉ số điều trị của AMB [14].
Hiện có 3 chế phẩm thương mại khác nhau kết hợp với lipid của AMB trên thị
trường. Chúng khác nhau về hình thái, thành phần, hoạt tính sinh học: AmBisome
(nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome

một lớp, kích thước nhỏ. Các dạng cấu trúc khác có chứa hàm lượng AMB cao hơn:
Amphotec (nghiên cứu và sản xuất bởi Liposome Technology Inc.) phức hợp là các
phân tử dạng đĩa có chứa AMB, cholesterol sunlfat. Abelcet (nghiên cứu và sản
xuất bởi The Liposome Company Ltd) bao gồm AMB liên kết với hai phospholipid
tổng hợp (DMPC, DMPG) trong đó tỉ số mol AMB/phospholipid là 1:1 tạo một
phức hợp có cấu trúc dạng chuỗi có KTTP từ 1600nm đến 11µm [21, 12].
8



Hình 1.2. Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên
thị trường [27].

Những chế phẩm này được chứng minh là ít độc hơn và có sự thay đổi các đặc
tính dược động học so với AMB quy ước do chúng tập trung tại hệ thống lưới nội
mô của các cơ quan mà chỉ đạt nồng độ thấp tại thận và chúng giải phóng AMB
dạng monomer một cách từ từ [19, 24].
Tất cả ba công thức mới của AMB đều cải thiện chỉ số điều trị đáng kể so với
Fungizone [21].
Cấu trúc phức hợp lipid bắt đầu xuất hiện khi tăng dần hàm lượng AMB từ 5%
mol trong một lượng DMPC:DMPG (7:3). Phức hợp này có cấu trúc dạng dải ruy
băng [13].
Sự giảm độc tính tối đa trên chuột đã đạt được khi tỉ lệ mol AMB với lipid là
1:1 [13].
9


Tuy nhiên, hiện nay đang sử dụng các phospholipid tổng hợp đắt tiền. Có thể
thay thế DMPC và DMPG bởi các phospholipid tự nhiên như từ lòng đỏ trứng hoặc
đậu nành hoặc phospholipid tự nhiên đã được hydro hóa một phần [21].

1.2.2. Cơ chế hình thành.
Bản chất chính xác của quá trình tương tác giữa AMB với HSPC và DSPG tạo
liposom vẫn chưa được biết rõ ràng nhưng theo bằng chứng từ một báo cáo thí
nghiệm của Fujii và các cộng sự thì khi nồng độ AMB trong lớp kép lipid của
liposom tăng quá một nồng độ tới hạn, thuốc sẽ tồn tại ở trạng thái tập hợp [14]
Phân tử AMB có tính lưỡng thân: một đầu thân nước, một đầu thân dầu. Trong
môi trường nước, khi nồng độ AMB dưới nồng độ tạo micell tới hạn, sự phối hợp
giữa AMB với phospholipid tạo liposom, sự xâm nhập của các monomer AMB vào
lớp lipid của liposom dường như là khó khăn do phần chuỗi polyhydroxy thân nước
trong cấu tạo của phân tử. Do đó các phân tử AMB bị giới hạn ở mặt trung gian
giữa hai màng lipid.
Khi AMB ở nồng độ lớn hơn, AMB có thể chèn vào, gây phá vỡ cấu trúc
màng kép lipid của liposom. AMB sẽ tự kết tụ với nhau, các phân tử lipid được xen
kẽ vào
giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức hợp.
Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và lipid trong phức
hợp lipid chứa AMB như sau:

10



Hình 1.3. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB. [21]
Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã quan sát
được. Trong phức hợp, đuôi hydrocacrbon thân dầu của lipid gắn với chuỗi polyen
của AMB, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về phía gốc amin của phân tử
AMB, hình thành một hình trụ tròn. Các hình trụ nhỏ này xếp cạnh nhau kéo dài
cấu trúc chuỗi. Khó có thể nói chính xác khoảng kích thước độ dài chuỗi này. Độ
dày của phức hợp này bằng một nửa độ dày của màng kép lipid thông thường [13].
1.2.3. Thành phần phospholipid trong phức hợp.

Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân phức hợp lipid, là những phân tử
lưỡng thân, vừa thân dầu, vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với
các nhóm phân cực và các acid béo. Nhóm phân cực có thể tích điện âm, dương, có
thể không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no [6].
Các phospholipid được sử dụng trong phức hợp lipid Amphotericin B bao
gồm: Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristoylphosphatidylglycerol
(DMPG), phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC),
distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), [13, 18, 19].
11


Các phospholipid tổng hợp như DMPC, DMPG có giá thành cao, có thể thay
thế bằng các phospholipid tự nhiên hoặc phospholipid tự nhiên hydrogen hóa
(HSPC) [20].
Các phospholipid được dùng trong công thức bào chế:

Hình 1.4. Phân tử HSPC

Hình 1. 5. Phân tử DSPG.

Ưu điểm của HSPC: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu nành
chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa
no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất [6,
24].
Khi lựa chọn phospholipid cần lưu ý đến:
+ Mức độ bão hòa: có phospholipid không no (như phosphatidylcholin lòng đỏ
trứng, phosphatidylglycerin…); phospholipid no (như dipalmytol
phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic…). Các phospholipid không no dễ bị
oxy hóa dẫn đến hỏng phức hợp ảnh hưởng đến độ ổn định của phức hợp lipid.
+ Khả năng tích điện: một số phospholipid tích điện dương (stearylamin), còn

một số tích điện âm (như acid phosphatidic, phosphatidylserin…). Phospholipid tích
điện tạo ra lực đẩy tĩnh điện tạo ra liên kết tĩnh điện với dược chất tích điện. Một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự thay đổi điện tích trên bề mặt liposom cũng như phức
12


hợp lipid có thể làm thay đổi đặc tính dược động học và sự phân bố của liposom,
phức hợp lipid trong cơ thể.
+ Mức độ tinh khiết: hiện các phospholipid dùng bào chế liposom cũng như
bào chế phức hợp lipid được bán sẵn trên thị trường. Tuy nhiên sản phẩm của các
nhà sản xuất khác nhau có mức độ tinh khiết khác nhau. Tùy theo mục đích của
nghiên cứu và sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp [6].
1.2.4. Độ ổn định của phức hợp lipid AMB.
Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức hợp lipid AMB được coi
là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lý, hóa học và sinh học. Sự thay đổi đặc
tính lý hóa của phức hợp lipid AMB có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế
cũng như trong quá trình bảo quản [6].
Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của phức hợp lipid là do quá
trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy
phân của phospholipid tạo ra các lysophospholipid. Quá trình oxy hóa tăng nhanh
do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, chiếu xạ…[6].
Về mặt vật lý: sự kém ổn định về mặt vật lý của phức hợp lipid AMB có thể là
do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu
phân trong quá trình bảo quản. Khi sử dụng các phospholipid có nhiệt độ chuyển
pha thấp có thể gây ra hiện tượng chuyển pha (từ gel có cấu trúc bền chặt sang dạng
lỏng liên kết lỏng lẻo) cũng có thể là một yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính vật lý của
phức hợp. Trạng thái vật lý của phức hợp lipid AMB có thể được đánh giá thông
qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [6].
1.2.5. Ưu nhược điểm
1.2.5.1. Ưu điểm

Phospholipid là tá dược phân giải sinh học cao, không độc với cơ thể, không
gây đáp ứng miễn dịch khi đưa vào cơ thể [6].
Các dạng bào chế kết hợp với lipid (lipid-based formulations) cải thiện được
độ tan của dược chất ít tan trong nước, đặc biệt là các thuốc thuộc nhóm II và nhóm
IV trong hệ thống phân loại sinh dược học BCS. Các dạng bào chế phối hợp với
13


lipid cũng có thể bảo vệ dược chất bởi sự phân hủy sinh học hoặc sự chuyển dạng,
do đó có thể tăng hiệu lực của thuốc. Thêm nữa, hệ phức hợp lipid có thể giảm độc
tính của nhiều loại thuốc bằng cách thay đổi sự phân bố sinh học của thuốc, tránh
các tổ chức nhạy cảm. Việc giảm được độc tính cho phép nhiều dược chất có thể sử
dụng được hơn và là nền tảng cho sự thành công của một số chế phẩm dựa trên lipid
của AMB như Ambisome, Abelcet [14].
Giảm độc tính của thuốc: trong phức hợp lipid của AMB, phân tử AMB sẽ
liên kết chặt chẽ với các phân tử lipid trong phức hợp, do đó không còn AMB tương
tác với cholesterol trên màng tế bào – tương tác gây nên độc tính của AMB trên
người, đặc biệt trên thận. Dù có sự liên kết chặt chẽ với lipid trong phức hợp xong
phức hợp với lipid này vẫn giữ được tác dụng chống nấm của AMB. Điều này được
giải thích là do sự giải phóng chọn lọc và từ từ AMB ra khỏi phức hợp [17, 21] .
Phức hợp lipid AMB cho phép cải thiện khả năng dung nạp AMB, có thể giải
thích do đặc điểm dược động học của phức hợp lipid này: phức hợp lipid AMB
nhanh chóng thanh thải khỏi máu và có thể tích phân bố lớn. Sau khi tiêm, phức
hợp lipid AMB nhanh chóng bị thực bào và tập trung tại các mô, đặc biệt gan, lách
và phổi là những nơi thường bị nhiễm nấm Candida và Aspergilus nghiêm trọng
[21].
Trong ba công thức thương mại phối hợp với lipid của AMB hiện có trên thị
trường, chỉ phức hợp lipid AMB mới đạt được nồng độ AMB trong phổi cao hơn so
với dạng AMB quy ước. Trong khi đó, phổi được biết đến là đường vào của nhiều
loại nấm gây bệnh, nồng độ AMB cao hơn trong phổi ít nhất về mặt lý thuyết là sẽ

giảm được sự phân bố, xâm nhập của các tác nhân này vào đường máu [16].
Phức hợp lipid của AMB liều đơn giúp cho việc sử dụng thuốc đơn giản hơn,
tránh phải sử dụng nhiều lần. Trong điều trị nấm Candida, việc sử dụng phức hợp
lipid chứa AMB dùng liều đơn cho phép đạt hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so
với sử dụng AMB đa liều thông thường, giảm được nguy cơ xảy ra các tác dụng
không mong muốn do giảm được lượng AMB cần phải sử dụng và giảm được chi
14


phí điều trị so với chi phí khi sử dụng AMB đa liều thông thường với thời gian điều
trị kéo dài [8].
Chi phí điều trị nhiễm nấm với phức hợp lipid chứa AMB thấp hơn so với điều
trị với dạng liposom của AMB [15, 21].
1.2.5.2. Nhược điểm
Đa số phương pháp bào chế phức hợp lipid giống với các phương pháp bào
chế liposom là có sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid, do đó có thể gây tác
động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [9].
Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của dạng bào chế phức
hợp lipid ngắn. Các phospholipid sử dụng đa số được chiết từ nguồn nguyên liệu tự
nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có
thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid
[22].
1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phức hợp lipid AMB có thể được bào chế bằng
các phương pháp tương tự như các phương pháp bào chế liposom đã được nghiên
cứu [14].
Malika Larabi và các cộng sự đã tiến hành bào chế hệ hỗn dịch của AMB bằng
phương pháp thay đổi dung môi. Trong nghiên cứu, AMB (3,5 mg hòa tan trong 10
ml methanol) được phối hợp với một dung môi hữu cơ có chứa các tỉ lệ khác nhau
của DMPC: DMPG (5 ml methanol) tại 40

o
C. Pha hữu cơ này (15ml) sau đó được
phối hợp với pha nước (MilliQRwater, 15ml, waters Millipore, France) kết hợp
khuấy từ ở nhiệt độ phòng để đồng nhất. Thể tích được giảm đi bằng cách bay hơi ở
áp suất thấp đến 5 ml. Tỉ lệ AMB/phospholipid thay đổi từ 5% đến 50% và
DMPC/DMPG thay đổi từ 10:0 đến 0:10 mol/mol. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
KTTP và PDI của phức hợp lipid với AMB phụ thuộc vào tỉ lệ AMB/phospholipid
khi thành phần phospholipid là DMPC: DMPG bằng 7:3 (mol/mol). Kích thước tối
ưu và chỉ số đa phân tán nhỏ nhất khi AMB đạt 35% khối lượng so với
phospholipid trong công thức. Công thức phức hợp lipid tốt nhất
15


(DMPC/DMPG/AMB là 7:3:5) đã ổn định trong 6 tháng sau bào chế và được bảo
quản ở nhiệt độ

4
o
C mà không thay đổi kích thước tiểu phân trong khi KTTP của
các công thức khác tăng lên chỉ sau vài ngày bào chế có hoặc không có hiện tượng
kết tủa [20].
Andrew S.Janoff cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự liên kết giữa
AMB với lipid. Họ đã chỉ ra rằng liên kết giữa AMB và lipid tạo ra nhiều dạng cấu
trúc khác nhau: cấu trúc liposom và các cấu trúc không phải liposom được gọi là
các chuỗi. Họ đã nghiên cứu bào chế các chế phẩm phức hợp lipid chứa AMB có sử
dụng hai lipid DMPC: DMPG (tỉ lệ mol 7:3), cho hàm lượng AMB thay đổi. Tiến
hành phân tích hình ảnh kính hiển vi điện tử đông khô các mẫu chứa 0, 5, 25, 50
mol % AMB cho thấy: ở nồng độ 5 mol % AMB, cấu trúc liposom kích thước nhỏ
được hình thành. Khi hàm lượng AMB tăng lên 25 mol%, cấu trúc liposom cơ bản
là biến mất, được thay thế bằng các cấu trúc dạng chuỗi liên kết chặt chẽ. Ở nồng

độ AMB lớn hơn 50 mol%, các cấu trúc chuỗi tiếp tục xuất hiện, tuy nhiên không
còn liên kết chặt chẽ [14].
Malika Larabi và cộng sự đã sử dụng phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC) để
theo dõi những thay đổi trong cấu trúc lớp lipid kép và sự tương tác của AMB với
phospholipid trong công thức phức hợp lipid AMB mà có thành phần giống của
Abelcet [21].
Theo quan sát của Andrew S.Janoff và cộng sự, khi một lượng lớn AMB liên
kết với DMPC: DMPG (7:3) (Abelcet), peak chuyển pha chính của lipid đã bị dãn
rộng ra và enthalpy của quá trình chuyển pha giảm đi [21].
16


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu.
- Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid chứa AMB
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Amphotericin B
Trung Quốc
USP
2
Hydrogenated soy
phosphatidylcholin
Lipoid – Đức
NSX

3
Distearoyl phosphatidylglycerol
Lipoid – Đức
NSX
4
Chloroform
Labscan – Thái Lan
NSX
5
Methanol
Trung Quốc
TKHH
6
Kali dihydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
7
Natri hydroxyd
Trung quốc
Trung Quốc
8
Nước tinh khiết
Việt Nam
DĐVN
9
Dimethyl sufoxid
Jansen – Đức
NSX
10
Natri chlorid

Trung Quốc
TKHH
11
Hydro chlorid
Trung Quốc
TKHH

- Phương tiện nghiên cứu:
 Máy khuấy từ IKA-WERKE (Đức).
 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern –
Anh).
 Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50
kD, diện tích lọc 28 cm
2
(Spectrumlab, Mỹ).
 Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức).
 Bình cầu NS 29/32, dung tích 1000ml (Buchi – Đức).
17


 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H (Hàn Quốc)
 Cân phân tích Satorius BP121S.
 Máy quét nhiệt vi sai.
 Máy đo pH InoLap.
 Máy đo quang UV-VIS U1800 HITACHI (Nhật).
 Cân kỹ thuật Sartorius TE412 (Đức).
 Tủ sấy, tủ lạnh, tủ hút chân không, các dụng cụ thủy tinh…
2.2. Nội dung nghiên cứu.
- Tiếp tục khảo sát quy trình và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của phức
hợp lipid AMB.

- Chứng minh mẫu bào chế là phức hợp lipid bằng một số phương pháp vật lý.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B.
- Theo nghiên cứu trước [5], công thức có tỉ lệ AMB bằng 25% mol trên tổng
số mol phospholipid (AMB: 50µmol, HSPC: 140µmol, DSPG: 60µmol), được bào
chế bằng phương pháp thay đổi dung môi với dung môi hòa tan dược chất và
phospholipid lần lượt là DMSO và CHCl
3
, dung môi pha nước là đệm phosphate pH
7,4 cho kết quả KTTP nhỏ, phân bố KTTP hẹp, hiệu suất nạp AMB cao và giữ được
ổn định KTTP, PDI sau 3 tuần. Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn mẫu này để
nghiên cứu tiếp.
- Công thức cho mẫu 20ml:
+ AMB: 0,0462 (g)
+ HSPC: 0,1106 (g)
+ DSPG: 0,0467 (g)
Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB như sau:
2.3.1.1. Phương pháp thay đổi dung môi.
- Cân và hòa tan AMB trong dung môi thích hợp.
- Cân và hòa tan HSPC, DSPG trong 10 ml chloroform.