Đánh giá mức độ kích thích miễn dịch của pidotimod việt nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động vật thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH
MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆ
T
NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA
CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG
VẬT THÍ NGHIỆM



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN


ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH
MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆT
NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ
DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ
NGHIỆM


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 60720408


Người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Văn Rư
PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng

HÀ NỘI, NĂM 2014


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người
thầy: TS. Nguyễn Văn Rư – GV Bộ môn Hóa Sinh – trường Đại học Dược
Hà Nội và PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng – Trưởng bộ môn duợc lý – Học viện

quân y đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, các kỹ thuật
viên – Bộ môn Hóa Sinh và bộ môn Dược Lực - trường Đại học Dược Hà
Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội
– những người thầy đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập thạc sỹ tại trường.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và
bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua
những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành luận văn.
Hà nội, ngày 20 tháng 07 năm 2014
Học viên



Đặng Thị Kim Khuyên



MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG: 5
DANH MỤC HÌNH: 5
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Một số nghiên cứu về Pidotimod 3
1.1.1. Cấu trúc hóa học của Pidotimod 3
1.1.2. Dược động học của Pidotimod 3
1.1.3. Tác dụng dược lý của pidotimod 4
1.1.4. Độc tính và tương tác thuốc 10
1.2. Tổng quan về sinh lý miễn dịch 11

1.2.1. Khái niệm về miễn dịch 11
1.2.2. Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) 11
1.2.3. Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) 12
1.2.4. Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD 12
1.2.5. Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch: 14
1.3. Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng 16
1.3.1. Khái niệm 16
1.3.2. Cơ chế tác dụng của các chất KTMD 16
1.3.3. Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD . 17
1.4 Các kỹ thuật đã được sử dụng để đánh giá tác dụng KTMD của Pidotimod 18
1.4.1. Tác động lên miễn dịch tế bào 18
1.4.2. Tác động trên quá trình miễn dịch dịch thể 22
1.4.3. Tác động trên các đại thực bào 24
1.4.4. Tác động không đặc hiệu trên hệ lưới nội mô: độ thanh thải keo
mực Tàu 25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27


2.1. Đối tượng nghiên cứu 27
2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị 27
2.2.1. Nguyên liệu 27
2.2.2. Thuốc và hóa chất 27
2.2.3. Thiết bị 27
2.3. Nội dung nghiên cứu 28
2.4. Thiết kế nghiên cứu 28
2.4.1. Chuẩn bị 28
2.4.2. Tiến hành thí nghiệm 30
2.4.3. Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm 31
2.5. Phương pháp xử lý số liệu 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 33

3.1. Sự biến đổi khối lượng chuột 33
3.2. Ảnh hưởng của Pidotimod lên khối lượng lách tương đối 35
3.3. Ảnh hưởng của pidotimod lên khối lượng tuyến ức tương đối 37
3.4. Ảnh hưởng của pidotimod lên số lượng bạch cầu 39
3.5. Ảnh hưởng của Pidotimod lên chức năng của thực bào của lưới nội mô. 41
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 45
4.1. Về lựa chọn mức liều và phương pháp thử nghiệm Pidotimod. 45
4.2. Về kết quả nghiên cứu 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .
PHỤ LỤC………………………………………………………………………




CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Con - A Concanavilin – A
CY Cyclophosphamid
CT Công thức
DNCB Dinitrochlorobenzen
ĐTB Đại thực bào
ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch
IFN Interferon
IL Interleukin
i.m Tiêm bắp
i.p Tiêm phúc mạc
i.v Tiêm tĩnh mạch
Kl/tt Khối lượng/thể tích
KTMD Kích thích miễn dịch
LPS Lipopolysaccharide

NTHHC Nhiễm trung hô hấp cấp
PHA Phytohaemagglutinin
p.o Đường uống
RCT Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng
s.c Tiêm dưới da


DANH MỤC BẢNG:

Bảng Tên bảng Trang
3.1 Sự thay đổi khối lượng chuột 33
3.2 Khối lượng lách tương đối 36
3.3 Khối lượng tuyến ức tương đối 38
3.4 Số lượng bạch cầu 40
3.5 Chỉ số thực bào 43

DANH MỤC HÌNH:

Hình Tên hình Trang
2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 30
3.2 Khối lượng chuột 34
3.3 Sự thay đổi khối lượng chuột 34
3.4 Khối lượng lách tương đối 36
3.5 Khối lượng tuyến ức tương đối 38
3.6 Số lượng bạch cầu 40
3.7 Chỉ số thực bào 40


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Y học hiện đại đang phải đối mặt với nguy cơ gia tăng cao của các
nhóm bệnh nguy hiểm như: HIV, ung thư, nhiễm khuẩn các vi khuẩn đề
kháng thuốc…. Nguyên nhân của những bệnh này là hệ miễn dịch của người
bệnh bị suy giảm do các tác nhân môi trường, hóa chất, thuốc…
Từ cuối những năm 1990 nhiễm trùng đường hô hấp cấp (NTHHC)
được gọi là "đại dịch bị lãng quên, với một sự phân hóa rõ ràng giữa các nước
đang phát triển và các nước công nghiệp hóa về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc
bệnh liên quan đến NTHHC [7]. Thực trạng này vẫn đúng trong hơn 20 năm
tiếp theo, khi sự ra đời của thuốc kháng sinh và vắc-xin mới góp phần kiểm
soát các dạng NTHHC đe dọa mạng sống nhất, nhưng không kiểm soát được
nhiều các dạng NTHHC do virus. Virus là tác nhân chính chịu trách nhiệm về
NTHHC trong độ tuổi trẻ em. Một cách tiếp cận tích cực trong việc ngăn chặn
và điều trị NTHHC là tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và tăng cường cơ
chế phòng vệ bẩm sinh ở trẻ. Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc
thiên nhiên hoặc tổng hợp với cơ chế tác dụng khác nhau đã được giới thiệu ở
nhiều nước để ngăn chặn NTHHC ở trẻ. Các chất kích thích miễn dịch đã
được tìm thấy và có nguồn gốc rất đa dạng như: interleukin (IL),
interferon (IFN), BCG, bronchovaxom, lentinan, levamisol imuthiol… Các
chất kích thích miễn dịch này đã được sử dụng và có hiệu quả rất khả quan.
Pidotimod là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu đã được
phát triển bởi hãng Poli Industria Chimica – Italia. Đây là một phân tử
dipeptid có tác dụng kích thích miễn dịch và đã được sử dụng trong điều trị ở


2

nhiều nước trên thế giới như Mexico, Costa Rica, Nga, Italia, Georgia, Hy
lạp, Hàn Quốc, Trung Quốc… Một số biệt dược của Pidotimod được lưu hành
ở các nước phát triển như: Adimod, Imunorix, Onaka, Pigitil, Polimod….

Hiện nay các nghiên cứu về bào chế pidotimod trên thế giới đang tập trung
vào hướng làm tăng cường chất lượng và sinh khả dụng của các dạng thành
phẩm pidotimod [33], [42], [43], [32]
Trong thời gian gần đây Pidotimod đã được bộ môn Hóa Dược trường
Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu và tổng hợp thành công ở dạng bột nguyên
liệu thô. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá mức độ kích thích miễn
dịch của Pidotimod Việt Nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên
động vật thí nghiệm” nhằm đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của
Pidotimod được tổng hợp ở Việt Nam với mục tiêu là:
1. Đánh giá được mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod dạng
nguyên liệu sản xuất ở Việt Nam
2. Đánh giá được hiệu quả kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất
tại Việt Nam dưới dạng pha chế dung dịch uống.


3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Một số nghiên cứu về Pidotimod
1.1.1. Cấu trúc hóa học của Pidotimod
 Danh pháp
- Tên theo danh pháp quốc tế: Pidotimod.
- Tên khoa học: acid (R)-3-[(S)-(5-oxo-2-pyrrolidinyl)carbonyl]-
thiazolidine-4-carboxylic.
- Mã ATC: L03AX05 [21], [27], [48].
 Công thức hóa học
- Công thức phân tử: C
9
H
12

N
2
O
4
S.
- Khối lượng phân tử: 244,26 g/mol.
- Công thức cấu tạo: [21], [27].

 Tính chất lý hóa
- Bột tinh thể không mùi, màu trắng hoặc trắng ngà.
- Điểm chảy 194
o
C–198
o
C, sự chảy kèm theo phân hủy nhanh
chóng.
- Năng suất quay cực [α]
25
D
: 150
o
C.
- Độ tan của Pidotimod trong nước là 37,8 (g/l) [21].
1.1.2. Dược động học của Pidotimod
Trên động vật (chuột, chó): Pidotimod hấp thu nhanh qua đường uống,
tốc độ thải trừ nhanh (T
1/2
= 1 giờ), thể tích phân bố lớn, thuốc phân bố nhanh
vào các cơ quan chính, đặc biệt là gan và thận. Sự bài tiết qua nước tiểu ở
dạng không chuyển đổi là 75,6% sau tiêm tĩnh mạch và 31,1% sau uống. Sinh

4

khả dụng của thuốc là 100% qua đường tiêm bắp và 27% qua đường uống
[18].
Trên người: Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và sinh khả dụng là
40 – 44%, T
1/2
= 4 giờ, không phụ thuộc liều và đường dùng [35], [7], thuốc
không bị chuyển hóa và thải trừ hầu hết ở dạng chưa chuyển hóa ra ngoài
nước tiểu, thể tích phân bố lớn (khoảng 30 lít) [35].
1.1.3. Tác dụng dược lý của pidotimod
Nhiều nghiên cứu trong ống nghiệm, trên động vật thí nghiệm và trên
người trước đây cho thấy pidotimod có tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch rất
rõ ràng, tác động trên nhiều tế bào, nhiều khâu của quá trình miễn dịch.
1.1.3.1. Các nghiên cứu trên động vật
 Tác động lên đại thực bào
Các thí nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác
động tích cực lên chức năng của ĐTB (khả năng hóa ứng động, khả năng sản
xuất gốc độc, sản sinh các cytokin gây viêm) [17], [45], [47].
 Pidotimod làm tăng tính hóa ứng động của ĐTB
Prednisolon làm giảm khả năng hóa ứng động của các ĐTB xuống còn
1/4 so với nhóm chứng (không bị ức chế miễn dịch, p < 0,001), nhưng khi
điều trị với pidotimod, khả năng hóa ứng động của ĐTB đã được tăng cường
một cách rõ rệt và phục hồi gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (kể cả
đường uống và tiêm phúc mạc) [17], [47]. Các nghiên cứu mới nhất chứng
mình rõ rằng pidotimod làm tăng cường chức năng của ĐTB M2 [29].
 Pidotimod kích thích ĐTB tăng cường sản xuất các gốc độc
Khi sử dụng prednisolon gây suy giảm miễn dịch và ủ cùng các tác nhân

thích hợp sẽ làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các gốc độc của ĐTB (anion
superoxid, p < 0,01; NO, p < 0,001). Và khi điều trị cùng với pidotimod thì sự
ức chế này gần như bị loại bỏ, đưa lượng NO, superoxid trở về mức ban đầu
[17], [47].


5

 Pidotimod kích thích ĐTB sản sinh ra các cytokine gây viêm
Khi được hoạt hóa, các ĐTB cũng có thể tạo ra những cytokin gây viêm
như TNF-α, IL-1 và IL-6. Nghiên cứu trên chuột bị ức chế miễn dịch bởi
prednisolon và được kích thích bởi các yếu tố gây viêm như LPS, bào tử nấm
Aspergilus fumigatus sự sản sinh TNF-α thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng
(không bị ức chế, p < 0,05) nhưng khi được điều trị bằng pidotimod thì lượng
TNF-α được hồi phục và thậm trí còn tăng so với nhóm chứng (p < 0,001)
[18], [47].
 Tác động lên tế bào D
Pidotimod tác dụng lên cả tế bào D trưởng thành, thông qua thụ thể
HLA-DR, các phân tử CD83 và CD86 để kích thích tế bào D giải phóng các
chất kháng viêm, thúc đẩy sự phát triển của tế bào T để tăng cường quá trình
thực bào [9], [39], [40], [26].
 Tác động lên tế bào đuôi gai chuột
Khi phân tích những thay đổi của tế bào đuôi gai (DCs) gây ra bởi
pidotimod (thymic peptide pidotimod - PTD). Những thay đổi trên tế bào đuôi
gai ở cả hai loại tủy xương được đánh giá bằng các phương pháp: sử dụng
kính hiển vi điện tử quét (SEM), phương pháp đo dòng tế bào (FCM), kính
hiển vi điện tử truyền qua (TEM), sinh học, khảo nghiệm và phương pháp
miễn dịch ELISA. Kết quả cho thấy PTD có khả năng tạo ra DC phynotypic
trưởng thành được minh chứng bằng biểu hiện của các phân tử bề mặt quan
trọng như MHC II, CD80 và CD86. Ngoài ra, các xét nghiệm chức năng đã

chứng minh sự ức chế tuyến yên của ACP trong DCs, khi thực bào xảy ra thì
các DCs giảm, đồng thời với kháng nguyên thì thể hiện theo xu hướng gia
tăng lên. Do đó kết quả cuối cùng cho thấy PTD kích thích sản xuất các
cytokin nhiều hơn. [49]
 Tác động lên tế bào NK
Nghiên cứu trên tế bào NK lách chuột ở các tuần tuổi khác nhau (10 tuần
và 30 tuần) được ủ với tế bào YAC-1 có gắn đồng vị phóng xạ
51
Cr cho thấy,


6

pidotimod liều cao (200mg/kg) tăng cường hoạt động của tế bào NK (không
phân biệt so với chứng), liều thấp hơn thay đổi không đáng kể, thậm chí còn
gây ức chế (liều 50 mg/kg). Kết quả này cho thấy pidotimod có khả năng điều
biến hoạt động của NK [41].
 Tác động lên tế bào lympho
- Trên miễn dịch qua trung gian tế bào: Nghiên cứu các phản ứng tạo
hoa hồng với hồng cầu cừu, phản ứng tăng sinh đáp ứng với các mitogen
(Con – A, LPS), phản ứng quá mẫn muộn với DNCB hay phản ứng chống
thải ghép ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch và được điều trị bằng pidotimod
đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với nhóm không được điều trị. Các kết
quả đều thể hiện pidotimod có khả năng phục hồi các chức năng của hệ miễn
dịch qua trung gian tế bào trở về mức bình thường [17], [45].
- Trên miễn dịch dịch thể: Đánh giá ĐƯMD dịch thể của pidotimod,
người ta sử dụng hai phản ứng với hai kháng nguyên khác nhau (LPS – đối
với miễn dịch thể không phụ thuộc tuyến ức; hồng cầu cừu 3% - đối với miễn
dịch dịch thể phụ thuộc tuyến ức) trên chuột đã có ĐƯMD với các kháng
nguyên này để đo hiệu giá kháng thể. Dựa vào các kết quả này, có thể nói

rằng, pidotimod có tác dụng làm tăng cường ĐƯMD với các kháng nguyên
này, đưa hiệu giá kháng thể trở về mức bình thường [17], [45].
 Tác dụng chống lại vi sinh vật
ĐƯMD chống vi sinh vật là chức năng quan trọng và cần thiết để bảo vệ
cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Các nghiên cứu trên chuột cho thấy,
pidotimod có tác dụng bảo vệ, làm tăng tỷ lệ sống của con vật trước tình trạng
nhiễm vi khuẩn hoặc virus.
- Tác dụng chống vi khuẩn: Để nghiên cứu khả năng chống lại vi
khuẩn của pidotimod, đã có nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau được thiết
lập. Trong đó có 5 mô hình nhằm: xác định liệu trình điều trị với pidotimod
cho hiệu quả thấp nhất; đánh giá hiệu lực tác dụng của thuốc trên nhiều chủng


7

vi khuẩn; so sánh hiệu lực của pidotimod với những thuốc được chọn làm
chuẩn; đánh giá tác dụng của thuốc trên chuột bị gây ức chế miễn dịch;
nghiên cứu hiệu lực của thuốc khi kết hợp với các kháng sinh β-lactam [19].
Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, dù cho không có tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm và kháng candida ở điều kiện in vitro, nhưng pidotimod thực sự có
khả năng kích thích cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể với hiệu quả
cao, tác dụng của pidotimod là rõ rệt và có ý nghĩa thống kê cao sau 5 lần sử
dụng trước tình trạng nhiễm khuẩn. Pidotimod chống lại sự lây nhiễm của
nhiều chủng vi khuẩn với mức liều 0,01 – 100 mg/kg i.p. × 5 lần. Pidotimod
có tác dụng tương đương hoặc tốt hơn so với các thuốc chuẩn so sánh như
bestatin, N-acetylmuramyl-L-Ala-D-iso-Glu-OH và tuftsin; thể hiện rõ tác
dụng bảo vệ trên chuột đã được gây ức chế miễn dịch, cũng như giúp tăng
cường tác dụng kháng khuẩn in vivo của các kháng sinh cefotaxim và
ampicillin, theo hướng hỗ trợ hoặc hiệp đồng (kháng sinh diệt vi khuẩn trực
tiếp và pidotimod tác động lên hệ miễn dịch làm tăng khả năng tiêu diệt vi

khuẩn của cơ thể) [19], [45], [38], [23].
- Tác dụng chống virus: Các thí nghiệm đã tiến hành với 3 loại virus
và 2 mức liều (virus) gây nhiễm khác nhau: virus viêm màng não
(Mengovirus), virus Herpes simplex (HSV), và virus cúm A chủng PR – 8.
Pidotimod được dùng 15 ngày trước khi gây nhiễm và trong suốt quá trình
chuột bị nhiễm virus cho tới khi chết. Tác dụng của thuốc thể hiện ở tỷ lệ
sống sót khác nhau giữa lô chỉ nhiễm virus (lô chứng) và lô nhiễm virus
nhưng được điều trị bằng pidotimod (lô thử). Thời gian mà một nửa số chuột
bị chết ở lô chứng và lô thử: Với Mengovirus tương ứng là 3 và 5,5 ngày; với
HSV tương ứng là 3 và 5 ngày; với virus cúm A PR – 8 là 3 và 6,5 ngày. Thời
gian mà tất cả chuột chết ở lô chứng là 7 ngày còn ở lô thử là 8 ngày [24].
Pidotimod không phải là thuốc chống virus đặc hiệu. Các dữ liệu nghiên
cứu toàn cầu chỉ ra rằng, tác dụng của pidotimod không phụ thuộc vào loại


8

virus và không liên quan chặt chẽ đến cơ chế nhân lên của mỗi loại virus [24],
[45].
 Tác dụng chống ký sinh trùng
Các nghiên cứu của pidotimod trên các vật chủ nhiễm ký sinh trùng được tập
trung vào chủng Toxoplasma gondii là một loài sinh vật đơn bào ký sinh lây
lan qua đường thức ăn và . Toxoplasma gondii gây ra bệnh lý Toxoplasmosis,
là một bệnh lý có tỷ lệ người mắc cao nhưng chỉ đặc biệt nguy hiểm ở các
bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Kết quả thử nghiệm cho thấy pidotimod có
tác dụng đáng kể giúp vật chủ hạn chế được tác động của Toxoplasma gondii
và kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm bệnh [30], [50].
 Các tác dụng khác
Ngoài tác dụng trên hệ miễn dịch, Pidotimod đã được đánh giá khả năng
tác dụng lên các cơ quan khác ở động vật thí nghiệm.

Trên hệ thần kinh
- Pidotimod không có tác động lên hệ thần kinh [37].
Trên hệ tim mạch
- Cơ bản pidotimod không ảnh hưởng lên sự hoạt động bình thường của
tim và huyết áp, không thể hiện tác dụng chống tăng huyết áp hay chống loạn
nhịp trên chuột thí nghiệm [37].
Trên hệ tiết niệu
Các thông số về thể tích nước tiểu và nồng độ ion niệu không có sự sai
khác với bình thường ở chuột được cho dùng pidotimod liều 100 và 200
mg/kg i.p và 200 mg/kg p.o. Duy chỉ có ở liều 400 mg/kg p.o nồng độ ion Na
+

và K
+
có tăng hơn so với trị số bình thường [37].
Các khảo sát khác
Pidotimod không có tác dụng chống viêm, không gây hạ glucose máu,
không gây tê tại chỗ, không ảnh hưởng tới kết tập tiểu cầu hay sự đáp ứng của
ruột cô lập thử với histamin, acetylcholin và BaCl
2
[37].


9

1.1.3.2. Các nghiên cứu trên người
Các nghiên cứu trên người nhằm mục đích: Xác nhận các kết quả thu
được ở động vật và kiểm tra các tác động trên hệ miễn dịch của pidotimod với
đối với các quần thể bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch khác nhau.
- Nghiên cứu trên các bệnh nhân bị ung thư, và bệnh nhân bị khối u

(mới và di căn) cho thấy bổ sung Pidotimod làm tăng đáp ứng với các
mitogen (con – A, PHA) và sự tăng tiết IL – 2 của các tế bào đơn nhân vùng
ngoại vi và của các tế bào lympho T ở nhóm bệnh nhân này.
- Nghiên cứu trên nhóm bệnh nhân lớn tuổi (đặc trưng là suy giảm
miễn dịch qua trung gian tế bào): Pidotimod kích thích ĐTB phúc mạc tăng
tiết cytokine IFN-γ và giảm tiết IL-6 so với trước khi sử dụng và so với nhóm
chứng sử dụng giả dược. Pidotimod cũng kích thích tế bào lympho T tăng tiết
IL-2 và tăng đáp ứng với PHA đáng kể so với nhóm giả dược [45].
- Trên đối tượng là trẻ em bị nhiễm trùng đường hô hấp, pidotimod
làm giảm đáng kể tất cả các thông số thời gian sốt, điều trị kháng sinh, tỷ lệ
tái phát [41]. Nghiên cứu RCT trên 120 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng hô hấp
tái phát cho thấy, pidotimod đã làm giảm 35% nguy cơ tái phát, giảm thời
gian nhập viện (86%) và giảm điều trị kháng sinh (47%); p < 0,01. Nếu tái
phát có xảy ra ở những bệnh nhân này, các triệu chứng của bệnh nhân cũng
giảm nhanh hơn [13].
- Các nghiên cứu của tác giả Carta và cộng sự chỉ ra rằng Pidotimod có
tác dụng In vitro trong viêc tăng cường khả năng của vật chủ để chống lại
NTHHC[14], [8].
+ Thông qua các tác dụng khác nhau trên các enzyme ở bề mặt tế bào
(extracellular-signal-regulated kinase-ERK1/2) và các yếu tố kappa trên nhân
(nuclear factor-kappa B; NF-kB), Pidotimod làm tăng cường sự biểu hiện của
các receptor toll-like 2 protein (là một loại receptor có tác dụng khởi đầu kích
thích các phản ứng chống truyền nhiễm)


10

+ Pidotimod có liên quan tới sự giảm xuống các phân tử kết dính gian bào
(ICAM)-1 của virus cúm, sự giải phóng Interleukin (IL)-8 và các yếu tố hóa
hướng động mạnh cho bạch cầu trung tính. Các hiện tượng này cơ chế để

chống lại sự truyền nhiễm.
+ Tác giả Carta và cộng sự kết luận rằng Pidotimod dường như điều chỉnh
chức năng của các tế bào biểu mô hô hấp giúp giảm sự lây nhiễm virus.
- Nghiên cứu RCT trên 60 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng tiết niệu tái
phát cho thấy, so với giả dược, những bệnh nhân sử dụng pidotimod có thời
gian phục hồi nhanh hơn (9,6 so với 12,3 ngày); thời gian điều trị kháng sinh
ngắn hơn (6,9 so với 8,3 ngày); và một số triệu chứng chính (sốt, bí tiểu, tiểu
nhiều lần, tiểu ra máu…) giảm nhanh hơn [16].
- Trên bệnh nhân bị viêm amidal cấp tính: Pidotimod làm giảm đáng
kể tần số các bệnh nhiễm trùng cũng như cải thiện các dấu hiệu lâm sàng (ho,
khó nuốt) và thời gian điều trị kháng sinh.
- Trên nhóm bệnh nhân Down bị nhiễm trùng đường hô hấp:
pidotimod làm giảm đáng kể tần số, mức độ nghiêm trọng và thời gian truyền
nhiễm so với nhóm chứng không được điều trị [45], [51].
1.1.4. Độc tính và tương tác thuốc
Tương tác thuốc: Pidotimod không làm thay đổi nồng độ và tác dụng
của các thuốc dùng cùng. Pidotimod khá an toàn khi điều trị cùng với các
thuốc khác [37].
Độc tính: Nghiên cứu độc tính của Pidotimod trên chuột nhắt, chuột
cống, chó, cho thấy pidotimod khá an toàn, độc tính thấp.
- Độc tính cấp thể hiện ở liều rất cao: Đối với cả 2 loại chuột: > 8000
mg/kg (p.o và i.p.), > 4000 mg/kg (i.v. và i.m). Ở chó, liều độc > 4000 mg/kg
(p.o.), > 2000 mg/kg (i.v và i.m).
- Độc tính mạn: theo dõi ở chuột trong vòng 4 tháng (với i.v.) và 12
tháng (với p.o.), pidotimod không thể hiện độc tính ở liều 200 mg/kg (i.v.) và
liều 800 mg/kg (p.o.), liều này cao gấp 32,5 lần liều sử dụng trên lâm sàng.


11

Tương tự, theo dõi độc tính trên chó 26 tuần với tiêm bắp và 52 tuần với
đường uống, pidotimod không gây độc ở liều 300 mg/kg (i.m.) và liều 600
mg/kg (p.o.), các liều này cao hơn liều sử dụng trên lâm sàng lần lượt là 48,8
và 24,4 lần.
- Pidotimod không ảnh hưởng lên chức năng sinh sản ở cả chuột cái và
chuột đực ở liều 600 mg/kg (p.o.) và 500 mg/kg (i.v.).
- Pidotimod không gây quái thai ở chuột (1000 mg/kg i.v. và 600
mg/kg p.o.), ở thỏ (300 mg/kg p.o. và 500 mg/kg i.v.).
- Chỉ số điều trị ở chuột dao động trong khoảng 40 – 80 [20].
Như vậy, các khảo sát cho thấy pidotimod khá an toàn, ngoài tác dụng
trên hệ thống miễn dịch thì sự tác động tới các hoạt động chức năng khác là
không có hoặc không rõ ràng. Tính đơn nhất trong tác động của Pidotimod
(chỉ trên hệ miễn dịch) là một thuộc tính có lợi trong điều trị, do đó hạn chế
được những tác dụng phụ không mong muốn [12].
1.2. Tổng quan về sinh lý miễn dịch
1.2.1. Khái niệm về miễn dịch
Miễn dịch (immunity) là khả năng của cơ thể nhận biết, đáp ứng và loại
bỏ các yếu tố lạ gây hại.
Khi bị yếu tố gây bệnh (kháng nguyên) xâm nhập, trước tiên cơ thể vận
hành ngay một số tế bào và phân tử sẵn có để kịp thời ngăn chặn, xử lý, sau
đó tạo ra các tế bào và phân tử đặc hiệu tương ứng với từng loại kháng
nguyên khác nhau để loại trừ chúng.
Phân loại ĐƯMD: gồm 2 loại
- ĐƯMD tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu).
- ĐƯMD thu được (miễn dịch đặc hiệu) [3], [6].
1.2.2. Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity)


12

Được hình thành trong quá trình tiến hóa của của động vật để chống lại
sự xâm nhập, gây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh. Miễn dịch không đặc
hiệu không để lại trí nhớ, khá ổn định và ít bị sai sót.
Các mô, tế bào, phân tử tham gia vào ĐƯMD không đặc hiệu:
- Da và niêm mạc: là hàng rào đầu tiên ngăn cản sự xâm nhập của các vi
sinh vật gây hại.
- Các tế bào gồm:
 Tiểu thực bào, ĐTB: Là các tế bào có khả năng nuốt và tiêu các vi
sinh vật
 Các tế bào diệt tự nhiên (NK-Natural killer cell): Tiêu diệt các tế bào
nhiễm virus, tế bào ung thư (ít hoặc không biểu hiện MHC lớp I).
 Bạch cầu ái toan, bạch cầu ái kiềm, tế bào mast: Tham gia phản ứng
viêm.
- Các phân tử:
 Hệ thống bổ thể (complement): Tạo phức hợp tấn công màng tế bào
mang kháng nguyên, hóa hướng động bạch cầu, hỗ trợ thực bào.
 Protein phản ứng C (CRP: C-reactive protein).
 Interferon (IFN): Có hoạt tính không đặc hiệu chống lại các virus [6].
1.2.3. Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity)
Là trạng thái miễn dịch xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng
với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng
nguyên (ngẫu nhiên hoặc chủ động). Miễn dịch đặc hiệu có khả năng nhận
dạng được hầu hết kháng nguyên và để lại trí nhớ miễn dịch.
Miễn dịch đặc hiệu gồm miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung
gian tế bào với sự đảm nhiệm của các tế bào lympho B và lympho T [6].
1.2.4. Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD
1.2.4.1. Cơ quan lympho trung ương


13

Là nơi sinh sản và biệt hóa tế bào lympho đến trưởng thành, đủ khả
năng xử lý kháng nguyên.
Tủy xương: Là cơ quan trung ương của mọi tế bào máu, nhạy cảm với
tia xạ và các thuốc chống phân bào.
Tuyến ức: Đảm nhiệm chức năng huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế
bào lympho T là nhờ một số yếu tố hòa tan (thymulin, thymosin α1, …) [6].
1.2.4.2. Cơ quan lymopho ngoại vi
Là nơi tế bào lympho trú ngụ và biệt hóa dưới tác động của kháng
nguyên.
Hạch lympho: Được coi như một cái lọc đối với các phân tử lạ ngoại
lai và các mảnh vụn từ mô hoại tử, là trung tâm của sự tuần hoàn các tế
bào lympho, nơi tế bào tiếp xúc với kháng nguyên.
Lách: có nhiệm vụ lọc và dự trữ máu cho cơ thể, ngoài ra còn là nơi
tập trung kháng của kháng nguyên vào cơ thể bằng đường máu.
Các mô lympho không có vỏ bọc: Nằm rải rác ở niêm mạc đường tiêu
hóa, hô hấp, tiết niệu,… [6]
1.2.4.3. Các tế bào tham gia quá trình ĐƯMD
Lympho bào: chiếm khoảng 20 - 30 % tổng số bạch cầu trong máu, có
vai trò chủ chốt trong miễn dịch đặc hiệu. Khi kháng nguyên xâm nhập vào
cơ thể, sẽ gặp phải hàng loạt cơ chế bảo vệ tự nhiên không đặc hiệu nhằm tiêu
diệt hoặc loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Nếu kháng nguyên vượt qua được
hàng rào này, và có đủ thời gian, chúng sẽ gặp phải các chất bảo vệ đặc hiệu
trong ĐƯMD đặc hiệu. ĐƯMD đặc hiệu xuất hiện sẽ làm ĐƯMD tự nhiên
được tăng cường [6].
Tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer): Là một tiểu quần thể tế bào
giống lympho, có khả năng diệt một số tế bào đích: Tế bào u, tế bào vật chủ
nhiễm virus. Chức năng quan trọng của NK là kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn
sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus. Các tế

14

bào NK có thể hạn chế hoặc làm trầm trọng hơn các phản ứng miễn dịch [5],
[41], [48].
Tế bào thực bào đơn nhân (monocyte): đóng vai trò phòng thủ do khả
năng thực bào các loại ký sinh trùng và vi khuẩn. Các ĐTB còn có vai trò
quan trọng trong sự khởi động quá trình miễn dịch đặc hiệu, chúng cần thiết
cho việc hoạt hóa các tế bào lympho T và lympho B trước sự xâm nhập của
các kháng nguyên ngoại lai. Bên cạnh đó, ĐTB còn tiết ra các chất cytokin
như IL-1, IL-6, TNF-α khởi phát quá trình viêm không đặc hiệu [5], [16],
[25], [27], [45].
Các tế bào máu khác: Bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm và
dưỡng bào (mastocyte), Bạch cầu ái toan đều có vai trò quan trọng trong
ĐƯMD của cơ thể với kháng nguyên.
1.2.5. Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch:
Suy giảm miễn dịch là tình trạng của cơ thể sống trong đó hệ thống
miễn dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được với yêu cầu của cuộc sống
bình thường, dẫn đến không chống lại được với các vi sinh vật gây bệnh
mà hậu quả là cơ thể bị nhiễm trùng nặng đi đến tử vong hay nói cách
khác là sinh ra rất ít kháng thể đặc hiệu trong khi cơ thể khác lại sinh miễn
dịch khi đặt trong cùng điều kiện.
Suy giảm miễn dịch được chia làm hai loại:
Suy giảm miễn dịch bẩm sinh
Suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay tiên phát là do những bất thường
mang tính di truyền, tạo ra những khuyết tật trong hệ thống miễn dịch, có
thể là:
+ Suy giảm miễn dịch ngay từ tế bào gốc chung cho cả hai dòng
lympho bào B và T.
+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T: Có 2 trường hợp: Suy giảm

nặng dòng T do sự suy giảm hoạt động của tuyến ức làm cho dòng lympho


15

bào T không trưởng thành và biệt hoá được, do đó không có miễn dịch qua
trung gian tế bào. Hiện tượng này gọi là hội chứng George. Trường hợp
thứ hai là rối loạn quá trình hoạt hoá của lympho bào T trưởng thành.
+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B: Có thể là do tổn thương tuỷ
xương mà không có biệt hoá dòng lympho bào B hoặc có thể có sai sót
trong quá trình hoạt hoá của lympho bào B trưởng thành dẫn đến rối loạn
sự tổng hợp các kháng thể dịch thể.
+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng các tế bào thực bào và sản xuất
bổ thể gây giảm tế bào thực bào và thiếu hụt bổ thể.
Suy giảm miễn dịch mắc phải
Suy giảm miễn dịch mắc phải là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp, là
một hiện tượng thứ phát sau nhiều bệnh. Nhất là các bệnh gây suy dinh
dưỡng, nhiễm độc, ảnh hưởng của một số thuốc gây ức chế miễn dịch và
do kết quả của các bệnh truyền nhiễm như ở người là nhiễm virus HIV -
Một bệnh nan y của thời đại
• Suy giảm miễn dịch thứ phát do suy dinh dưỡng
Người ta đã thấy rõ rằng khi cơ thể bị suy dinh dưỡng sẽ xuất hiện
trạng thái suy giảm miễn dịch cả không đặc hiệu lẫn đặc hiệu mà cơ chế
bệnh sinh ra là do thiếu nguyên liệu trong sinh tổng hợp các chất, đặc biệt
là thiếu đạm.
• Suy giảm miễn dịch thứ phát do nhiễm trùng
Trong tất cả các trường hợp nhiễm khuẩn (virus, vi khuẩn, nấm hay
ký sinh trùng). Nếu kéo dài sẽ gây suy dinh dưỡng dẫn đến suy giảm miễn
dịch. Nhiễm virus dẫn đến rối loạn đáp ứng miễn dịch và làm suy giảm
miễn dịch dễ dẫn đến các bội nhiễm các bệnh khác.

Nhiễm khuẩn mãn tính, đặc biệt là nhiễm vi khuẩn nội bào như bệnh
hủi, lao thì bao giờ cũng gây ra suy giảm miễn dịch tế bào.


16

Ở người, trong căn bệnh thế kỷ AIDS do nhiễm bởi loại Retrovirus
HIV-I và HIV-II, chúng có ái tính đặc biệt với phân tử CD4 và Receptor
với một số chemokin có trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch mà chủ
yếu là các lympho bào T
h
và đại thực bào. Virus làm ly giải các tế bào
T
CD4
hoặc bất hoạt chúng, số lượng tế bào T
CD4
suy giảm trầm trọng ở
người nhiễm HIV (bình thường tỷ lệ T
CD4
/T
CD8
là 2/1, khi nhiễm HIV thì
có thể chỉ là 0,5/1).
Từ giảm sút T
h
dẫn đến suy giảm miễn dịch trầm trọng.
• Suy giảm miễn dịch thứ phát do một số bệnh khác.
Các bệnh ác tính như ung thư, bệnh máu ác tính và các bệnh về thận
như suy thận, thận nhiễm mỡ đều dẫn đến suy giảm miễn dịch.
Ngoài ra ở các cơ thể già, do có những thay đổi trong hoạt động miễn

dịch, người ta thấy có những suy giảm miễn dịch rõ rệt, do đó ở người già
thường thấy tăng khả năng nhiễm khuẩn, hay bị ung thư, mắc bệnh tự miễn
(thấp khớp) , chính là do sự suy giảm miễn dịch.
Như vậy, ĐƯMD là một quá trình phức tạp xảy ra khi có sự tiếp xúc của
kháng nguyên ngoại lai và hệ miễn dịch. Điều hòa hoạt động của hệ miễn
dịch, giữ cân bằng nội môi cần có sự tham gia và phối hợp của nhiều cơ quan,
tổ chức và tế bào sẽ giúp cho cơ thể chống lại các kháng khuyên gây bệnh.
1.3. Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng
1.3.1. Khái niệm
Các chất KTMD là những chất đưa vào cơ thể nhằm biến đổi khả
năng của các tế bào đáp ứng với kháng nguyên hoặc làm thay đổi sự tương
tác giữa các tế bào hay giữa các chất trung gian cần thiết cho sự tạo nên
một ĐƯMD [3], [5].
1.3.2. Cơ chế tác dụng của các chất KTMD
Chủ yếu theo 2 cơ chế:


17

- Tác động vào quá trình biến đổi, chuyển hóa của các kháng
nguyên như tăng tích lũy kháng nguyên, giảm đào thải kháng nguyên, do
đó kéo dài sự có mặt của kháng nguyên trong cơ thể và gây ra kích thích
liên tục giống như tiêm kháng nguyên liều nhỏ nhưng nhiều lần và kéo dài.
- Tương tác với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch: làm tăng hiện
tượng thực bào, tăng hoạt hóa ĐTB, tăng sự tiếp xúc và hòa màng giữa
ĐTB và tế bào lympho để truyền thông tin kháng nguyên từ ĐTB sang tế
bào lympho sản xuất kháng thể quyết định tính đặc hiệu của kháng thể đối
với kháng nguyên [3].
1.3.3. Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất
KTMD

Chất KTMD tác động vào nhiều khâu trong quá trình miễn dịch. Vì
vậy, các kỹ thuật đánh giá tác dụng của các chất KTMD rất đa dạng và có
thể thực hiện theo các khâu chính sau đây:
Khâu xử lý kháng nguyên thông qua hoạt động của ĐTB:
- Kỹ thuật ức chế di tản ĐTB.
- Kỹ thuật điện di ĐTB.
- Kỹ thuật ức chế dính bạch cầu.
- Kỹ thuật ức chế trải giăng bạch cầu.
- Đo hoạt tính thực bào và đánh giá khả năng tiêu hóa nội tế bào của
ĐTB.
Có thể đánh giá chức năng của ĐTB trong giai đoạn cảm ứng miễn
dịch bằng cách xác định tỷ lệ % các ĐTB có ăn kháng nguyên và số lượng
kháng nguyên bị vây bắt ở mỗi ĐTB (chỉ số thực bào) [3].
Khâu hiệu ứng của đáp ứng miễn dịch: Lympho bào T
- Thử nghiệm chuyển dạng lympho bào: dựa vào đặc tính của
lympho T, khi có mặt của kháng nguyên đặc hiệu, các lympho bào mẫn


18

cảm phản ứng bằng cách chuyển sang dạng “blast” (tế bào lớn, bào tương
phình to, hạt nhân nổi rõ).
- Thử nghiệm tạo hoa hồng tự nhiên E (Rosette E): Dựa trên khả
năng tạo hoa hồng với hồng cầu cừu của lympho T.
- Thử nghiệm tạo hoa hồng kép: Thường kết hợp đồng thời thử
nghiệm tạo hoa hồng E với thí nghiệm tạo hoa hồng EA (hồng cầu gà E
được bao phủ bởi kháng thể kháng hồng cầu gà A để tạo phức hợp EA)
[3].
Khâu đáp ứng miễn dịch của lympho bào B và kháng thể Ig
- Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch.

- Kỹ thuật tạo hoa hồng EAC: Dùng để phát hiện lympho B mang
thụ thể dành cho bổ thể, sử dụng hồng cầu cừu E được bao phủ bởi
hémolysin – kháng thể IgM (A) và bổ thể (C) thành phức hợp EAC.
- Kỹ thuật Jerne: Phát hiện lympho bào B tiết kháng thể. Thực hiện
trên môi trường thạch hoặc môi trường lỏng, dựa trên nguyên lý tạo quầng
dung huyết khi cho tế bào lympho tiếp xúc với hồng cầu cừu đồng thời với
sự có mặt của bổ thể.
- Đánh giá tương đối lượng kháng thể bằng cách xác định hiệu giá
kháng thể trong huyết thanh dựa trên phản ứng ngưng kết hồng cầu [3].
Như vậy, đối với một chất KTMD, có khá nhiều phương pháp để
đánh giá tác dụng trên hệ miễn dịch. Tùy vào điều kiện thực tế cũng như
đối tượng, mục tiêu cần đánh giá để lựa chọn phương pháp tối ưu mang lại
hiệu quả cao.
1.4 Các kỹ thuật đã được sử dụng để đánh giá tác dụng KTMD của
Pidotimod
1.4.1. Tác động lên miễn dịch tế bào
 Tế bào bạch huyết của chuột với hồng cầu của cừu