Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzym protease từ vi khuẩn bacillus subtilis natto

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




ĐINH THU HƯƠNG



NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT
ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC




HÀ NỘI 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THU HƯƠNG




NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT
ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH
MÃ SỐ:
607.204.02


Người hướng dẫn khoa học:
TS. Đàm Thanh Xuân


HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm
ơn chân thành nhất tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh và DS. Đinh

Thị Thanh Thảo cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các
thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Học viên
Đinh Thu Hương














MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1: TỔNG QUAN
2
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ………………………………….
2
1.1.1. Phân loại khoa học………………………………………….
2
1.1.2. Nguồn gốc……… …………………………………………
2
1.1.3. Đặc điểm hình thái…………………………………………
2
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng………………………………………
3
1.1.5. Đặc điểm sinh lý……………………………………
3
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto………………
3
1.2. Nattokinase ……………………………………………………
4
1.2.1. Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase
4
1.2.2. Nattokinase………………………………………
5
1.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật …………….
11
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh
vật…………………………………………………………………….
11

1.3.2. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
khả năng sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn………………….
13
1.3.3. Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi
sinh vật………………………………………………………………
14
1.3.3.1. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật
thuộc chi Bacillus……………………………………………………
14
1.3.3.2. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B.
17
subtilis natto…………………………………………………………
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ……………………………………
20
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng……………………………………………
20
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất và thuốc thử…………………………
20
2.1.3. Môi trường ……………………………………………………
20
2.1.4. Máy móc và dụng cụ…………………………………………
21
2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………………………
21
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto………
21
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính

tiêu fibrin của enzyme protease thu được…………………………
21
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………
22
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy B. subtilis natto……….
22
2.3.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên
khả năng sinh enzyme………………………………………………
23
2.3.3. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease………………
23
2.3.3.1. Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat………
24
2.3.3.2. Phương pháp chiết enzyme bằng dung môi hữu cơ (aceton
hay ethanol 96%)……………………………………………………
25
2.3.3.3. Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc kí lọc gel
Sephadex G – 75…………………………………………………….
26
2.3.4. Phương pháp sơ bộ định tính các nhóm enzyme trong dịch lên
men………………………………………………………………
26
2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ
protease………………………………………………………………
27
2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE………………………….
29
2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin…………….
30
2.3.8. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm……….

31
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ …………………….
33
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả
năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto……………
33
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy
B. subtilis natto……………………………………………………
33
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon………………
34
3.1.3. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất……………………
36
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng lên khả
năng tạo enzyme của vi khuẩn B. subtilis natto………………….
38
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ …………………
39
3.1.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của vi
khuẩn B. subtilis natto trên môi trường kết hợp……………………
40
3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt
tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được …………………
41
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme
protease ngoại bào của B. subtilis natto……………………………
41
3.2.2. Lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của B.
subtilis natto……………………………………………………….
43

3.2.2.1. So sánh khả năng chiết enzyme protease bằng dung môi hữu
cơ (aceton, ethanol 96%) và amoni sulfat 60%
43
3.2.2.2. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào
của B. subtilis natto………………………………………………
44
3.2.3. Tinh chế protease bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex
G – 75………………………………………………………… …
48
3.2.4. Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế ……………
51
3.2.5. Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu……
52
Chương 4: BÀN LUẬN ……………………………………………
54
4.1. Về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo
enzyme protease của Bacillus subtilis natto………………………
54
4.2. Về lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu
fibrin của enzyme protease thu được ……………………………
57
4.2.1. Về ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme
protease ngoại bào của B. subtilis natto……………………………
57
4.2.2. Về lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của
B. subtilis natto……………………………………………………
58
4.2.3. Về việc tinh chế protease bằng phương pháp sắc kí lọc gel
Sephadex G – 75……………………………………………………
60

4.2.4. Về kết quả điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế…
61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………….
63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


















DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ
AS

Amoni sulfat
atm

Đơn vị đo áp suất
bh

Bão hòa
B. subtilis natto

Bacillus subtilis natto
CMC

Carboxy methyl cellulose
E. coli

Escherichia coli
FU

Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân
giải fibrin của chất nghiên cứu)
kDa

kilo Dalton
mBar

mili Bar
N
0

Lần thí nghiệm
nKat

nano Katal
pI

Điểm đẳng điện của protein
Điện di SDS – PAGE

Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của
sodium dodecyl sulfat
SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
Tb

Trung bình
TLPT

Trọng lượng phân tử
t – PA

Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa
plasminogen ở mô)




DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Trang
Bảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase 6
Bảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 11
Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus
15
Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B.
Subtilis
16
Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B.
subtilis natto
18
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất 20
Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng 21
Bảng 2.3: Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm 31
Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy B.
subtilis natto
33
Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi
nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có
bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau
34
Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch
lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2
có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau
35
Bảng 3.4: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi
nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các nguồ
n hydratcarbon
khác nhau

36
Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi
nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung maltose ở các
nồng độ khác nhau
37
Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch
lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở
các nồng độ khác nhau
37
Bảng 3.7: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ
sung đậu tương và casein
38
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung muối vô
cơ
39
Bảng 3.9: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
40
Bảng 3.10: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi
nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
41
Bảng 3.11: Đường kính vòng phân giải casein của dịch trong ở
các pH khác nhau
42
Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính phân giải cơ chất và thời gian
tiêu fibrin của enzyme protease ngoại bào thu được khi kết tủa
bằng các tác nhân khác nhau
44

Bảng 3.13: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết
nồng độ
44
Bảng 3.14: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột,
CMC của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni
sulfat bão hòa khác nhau
46
Bảng 3.15: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ
protease của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni
sulfat bão hòa khác nhau
47
Bảng 3.16: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ
protease của các dịch enzyme thu được theo quy trình kết tủa phân
đoạn
48
Bảng 3.17: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân
đoạn thu được sau tinh chế
49
Bảng 3.18: Đánh giá sự có mặt của amylase và cellulase trong các
phân đoạn
50
Bảng 3.19: Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease
51
Bảng 3.20: Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin của mẫu
đối chứng và các dịch thử
53

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Tên hình
Trang
Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto
2
Hình 1.2: Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase
6
Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase
8
Hình 1.4: Hiệu suất và mức tinh sạch của protease chiết tách từ
môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis

17
Hình 1.5: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới
dạng muối halogenid
17
Hình 2.1: Sơ đồ các giai đoạn chiết tách enzyme protease
24
Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn
hydratcarbon đến hoạt tính enzyme của vi khuẩn
35
Biểu đồ 3.2: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải
casein tại các giá trị pH khác nhau
42
Hình 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ protein C – mật độ
quang D của mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret
45
Hình 3.2: Biến thiên khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC
của các dịch enzyme theo nồng độ amoni sulfat bão hòa sử dụng
để chiết
46
Hình 3.3: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzyme protease và các
phân đoạn
50
Hình 3.4: Điện di đồ SDS-PAGE một số phân đoạn tinh sạch sau
khi qua cột Sephadex G75
52
Hình 3.5: Hình ảnh thủy phân fibrin trên đĩa thạch của enzyme
thu được
53

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các chế phẩm enzyme được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzyme
phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzyme có nhiều ứng
dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da…
Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho
hiệu quả tốt.
Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin,
trypsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng
đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các
loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn
thuộc chi Bacillus [24]. Vi khuẩn B. subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus
subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo
nên món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật
đã phát hiện ra trong Natto có chứa Nattokinase – một enzyme thuộc nhóm các
enzyme protease có khả năng phân giải fibrin [28]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên
cứu về B. subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này
có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như Nattokinase [21], elastase
[27], bacillopeptidase F [57]…
Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase Việc thay đổi môi
trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzyme của vi khuẩn. Vì thế, lựa
chọn môi trường tốt nhất cho B. subtilis natto sinh lượng lớn protease và giảm bớt
các enzyme khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, trong đó có
Nattokinase. Vì vậy, luận văn “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme
protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto
” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu được ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto.

2. Chọn được phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme
protease thu được.


2

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis var. natto) là một
chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh
lần đầu tiên vào năm 1905 [24].
1.1.1. Phân loại khoa học
Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Họ
(Family): Bacillaceae, chi (Genus): Bacillus, loài (Species): Bacillus subtilis, phân
loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [18],[24].
Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis natto được coi như là một loài vi sinh
vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của
Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [52],[56], các khóa phân loại đã xếp B.
subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác
là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [24]. Trong dòng B. subtilis natto còn có
nhiều loại như B. subtilis natto B – 12 [58], B. subtilis natto OK2 [15], B. subtilis
natto NRRL 3666 [38]…
1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn
truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis natto có nhiều
trong rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi
khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác
như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [24],[33].

1.1.3. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto (độ phòng đại 100 lần) [64]
Bào tử
Tế bào vi khuẩn

3

B. subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào
tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với
nhau thành chuỗi (hình 1.1). Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có
kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan
rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [49],[55].
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose,
saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid
glutamic, arginin, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan,
phenylalanin và methionin [55].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn
3%. B. subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50
0
C), tối thích là
37
0
C. Nhiệt độ tối thích cho sự nảy mầm của bào tử là 40
0
C. Ở 55

0
C, vi khuẩn
ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. B. subtilis natto phát triển ở
pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự
nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [55].
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ–
transpeptidase theo Noda năm 1989 [44] và Ogawa năm 1991 [45]; amylase theo
Yamane K năm 1974 [61]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [34], Shimizu M năm
1992 [53]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [62]; và nhóm enzyme được nghiên
cứu nhiều nhất là protease [21],[22],[57],[58],[60].
Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis natto như sau:
 Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay
subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có
275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến

4

29 kDa [21],[58]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được
nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
 Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7
[27]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định
hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50
0
C; bị bất hoạt bởi diisopropyl
fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [43].
 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Ser, His, Asp [57].
 Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho

hoạt động của enzyme là 55
0
C, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác:
Asp33, His81, Ser259 [32],[60].
1.2. Nattokinase
1.2.1. Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase
Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzyme đã được
ứng dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase Cơ
chế chung của các enzyme này là hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng
phân giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII,
XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng
kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu. Vì thế plasmin
có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [2]. Căn cứ
vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành hai
nhóm:
a. Enzyme tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác
động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không
mong muốn là chảy máu toàn thân. Một số enzyme điển hình của nhóm này như:
- Streptokinase: chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus
haemolyticus tan huyết β nhóm C. Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ
kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng [2].
- Urokinase: chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào thận
bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen [2].

5

- Anistreplase: là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh
học [2].
b. Enzyme tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzyme hoạt hóa
plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực

tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng. Tuy nhiên, do sản xuất bằng
công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt. Một số enzyme điển hình của nhóm
này như:
- Alteplase: có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết ra
trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt, nước
mắt Alteplase được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN từ tế bào buồng
trứng chuột đồng Trung Quốc gọi là rt- PA [2].
- Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu. Pro-urokinase
được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli [2].
Mặc dù một số enzyme đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị
huyết khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời
gian bán thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản
ứng dị ứng [19]. Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và
thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối
an toàn và giá rẻ [19].
1.2.2. Nattokinase

a. Nguồn gốc
Nattokinase (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một enzyme có hoạt tính tiêu fibrin rất
mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto [14].
Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP, enzyme trong Natto
[23].
b. Đặc điểm cấu tạo
Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin
và không có cầu nối disulfua trong phân tử. Trọng lượng phân tử là 27 kDa và pI=
8,6 ± 0,3 [9]. Là enzyme thuộc họ subtilisin của protease serin, Nattokinase cũng có
trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và

6

nhóm carboxyl của Asp-32. Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- Pro-
Phe-pNA [9],[63]

Hình 1.2.Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [23]
c. Tính chất
Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn
hơn 11, hoạt tính tối ưu ở pH = 8 – 9. Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 40
0
C,
bị giảm hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50
0
C và bị phân hủy ở 70
0
C [19]. Hoạt tính
của Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl
2
, H
2
O
2
và bị ức chế hoàn toàn bởi
phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA),
các ion Fe
3+
và Al
3+
cũng ức chế enzyme này [19],[23]. Hoạt tính của Nattokinase
tăng lên khi có mặt MgSO
4
, CaCl

2
, MnCl
2
[19],[63].
d. Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase
Theo hiệp hội Nattokinase Nhật Bản, Nattokinase có thể được xác định dựa
vào các phương pháp sau: [66]
Bảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase
Phương
pháp
Đơn
vị
Enzyme
mục tiêu
Chất
thử
Điểm mạnh Điểm yếu
Thử
casein
CU
Protease nói
chung
Casein
-
Chất thử phổ
biến
-
Tính chính
xác cao

-
Không đánh giá đặc
hiệu Nattokinase.
(*1)
-
Có sự
khác nhau
giữa các lần thử
nghiệm do chất thử
là sản phẩm tự
nhiên.

7

Chất
thử tổng
hợp
IU (*2).
U
Plasmin
S-2251
(*3)
-
Đơn giản
-
Có thể cho
kết quả trong
thời gian
ngắn
-

Không có sự
khác nhau
giữa các lần
thử nghiệm.

-
Chất thử phù hợp
với plasmin nhưng
không phải là tốt
nhất
cho các
enzyme khác, đặc
biệt là Nattokinase.
Chất
thử tổng
hợp
IU (*4).
U
Urokinase
S-2444
(*5)

-
Chất thử đặc hiệu
nhất
cho urokinase
song không phả
i là
tốt nhất vớ
i các

enzyme khác, đặc
biệt là Nattokinase.
Đĩa
fibrin
mm2
(hoặc U
*6)
Enzyme tan
huyết
Fibrin
-
Khá đơn giản
-
Chất thử đặc
hiệu

-

Tính chính xác kém
và không phù hợp
để định lượng
-
Có sự khác nhau
giữa các lần thí
nghiệm do chất thử
là tự nhiên.
Giáng
hóa
fibrin
FU Nattokinase Fibrin

-
Chất thử đặc
hiệu nhất
-
Khả năng
định lượng
tốt

-
Mất thời gian đánh
giá.
-
Có sự
khác nhau
giữa các lầ
n thí
nghiệm do chất thử
là tự nhiên.
Ghi chú:
*1: có thể được nếu Nattokinase ổn định tốt, tuy nhiên hiệu giá thấp do casein có mối tương quan
thấp với fibrin.
*2: IU có thể được dùng trong trường hợp tính hoạt tính plasmin.
*3: H-D-Val-Leu-Lys-pNA.
*4: IU có thể được dùng trong trường hợp tính hoạt tính urokinase.
*5: pyro-Glu-Gly-Arg-pNA.
*6: U có thể được dùng trong trường hợp chuyển đổi vùng phân giải cho hoạt tính enzyme giáng
hóa fibrin đã biết.

e. Cơ chế tiêu fibrin
Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường

khác nhau:

8


Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [42]
- Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi
fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng
phân tử thấp, hoà tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase
thành Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin,
làm tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.
- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng
hợp t- PA trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ
fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì
vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu
bình thường [42].
f. Công dụng
Trong các protease ngoại bào của B. subtilis natto, Nattokinase có nhiều tiềm
năng được ứng dụng làm dược phẩm. Rất nhiều các nghiên cứu về hiệu quả của
enzyme này trong điều trị bệnh huyết khối và bệnh tim mạch liên quan như nghiên
cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [21], Maruyama năm 1998 [39],
Haritha M năm 2011 [25] đã chứng minh Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu
đông và phòng chống huyết khối thông qua các cơ chế: trực tiếp giáng hóa fibrin
trong cục máu đông; hoạt hóa quá trình tổng hợp t – PA trong huyết tương; thúc đẩy
quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin; tăng cường plasmin nội sinh [21]

9

[25],[39]. Năm 2009, kết quả của Kim J đã chỉ ra Nattokinase có vai trò trong việc
phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [35]. Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng công
trình vẫn còn hạn chế. Năm 2008, bác sĩ Nguyễn Chí Tuệ - Bệnh viện Quân Y 103
đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Nattospes (Nattokinase) trên
73 bệnh nhân đột quỵ não: trong đó 21,62% cải thiện ý thức sau điều trị; 67,67% cải
thiện di chứng; hầu hết bệnh nhân có hiệu quả về lâm sàng, xu hướng giảm đông
máu, không có trường hợp nào bị tai biến chảy máu [65]… Nghiên cứu về tác dụng
của Nattospes trên bệnh nhân đột quỵ não tại Bệnh viện 108 do GS.TS Nguyễn Văn
Thông (2008) cũng cho thấy Nattospes có hiệu quả tương đương aspirin (thuốc đầu
tay trong điều trị đột quỵ não). [65]
Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu
fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể
khi hấp thụ qua đường uống. Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi uống
100mg/ngày và tác dụng của nó kéo dài 8 - 12 giờ. Do ưu điểm an toàn, hiệu lực
cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường, Nattokinase
có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [22]. Ngoài ra, Nattokinase còn có tác
dụng tốt trong các bệnh tim mạch như làm giảm huyết áp, giảm lipid máu, ngăn xơ
vữa động mạch [26],[28].
g. Nattokinase dùng trong thực phẩm chức năng và thuốc
Nattokinase lần đầu tiên được phân lập và bán trên thị trường dưới tên NSK-
SD vào năm 1998 bởi Phòng thí nghiệm sinh học Nhật Bản. Nattokinase đôi khi
được sử dụng trong y học như là một tác nhân làm giảm cục máu đông, thay thế cho
điều trị bằng aspirin hàng ngày. Tuy nhiên, sự thay thế này không được khuyến cáo
[66].
Hiện nay, các nguyên liệu Nattokinase trong sản phẩm trên thị trường chủ
yếu được sản xuất bởi Nhật Bản và Hàn Quốc nhưng nguồn nguyên liệu này khá
hạn chế và giá thành cao. Theo dự đoán, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng
tăng. Riêng tại thị trường Nhật Bản: doanh số khởi đầu đạt 500 triệu yên (2002), đã
tăng đến 1,5 tỉ yên (2006), và đạt 3 tỉ yên năm 2010. Ở các nước đang phát triển
như Trung Quốc, Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng. Hiện sản

10

phẩm viên nén từ enzyme này giá khoảng 10.000 đồng/viên (hoạt tính 1000 FU), và
được khuyến cáo sử dụng hàng ngày. Các sản phẩm bán trong nước hiện tại giá dao
động trong khoảng 4.000 - 5.000 đồng/viên (hoạt tính 300 FU) dưới dạng thực
phẩm chức năng. Từ đó cho thấy nguồn nguyên liệu enzyme này có thị trường rất
tiềm năng.
Các sản phẩm Nattokinase trên thị trường hiện nay:




Sản phẩm từ Nhật Bản



Sản phẩm Việt Nam, nguyên liệu nhập khẩu




11

Bảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase
Sản phẩm
Hàm lượng
Nattokinase
(FU)
Dạng bào

chế
Nhà sản xuất
Nattospes

300
Viên nang
Công ty IMC, Việt Nam
S-Nattokinase

5.000
Viên nang
United Biomedical, Mỹ
Nattokinase
1.000
Viên nang
CNS Pharm Korea Co., Ltd, Hàn
Quốc
Nattokinase
plus
3.000
Viên nang
Food Science of Vermont dba Da
Vinci Laboratories, Mỹ
Nattokinase
plus FUcoidan
2.000
Viên nang
Umeken, Nhật Bản

1.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật

Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzyme bằng phương pháp hóa học
(synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có
hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzyme hiện nay vẫn được chiết
tách từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật [4].
Vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất phong phú trong đó có những enzyme
mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp enzyme với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể
tác động vào vi sinh vật để thu được enzyme theo ý muốn. Mặt khác enzyme vi sinh
vật thường có hoạt tính mạnh [11],[29].
Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ
yếu:
 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme
 Chiết tách và thu nhận enzyme
 Tinh sạch thu chế phẩm enzyme
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh vật
a. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

12

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng
hợp enzyme của vi sinh vật. Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các
môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzyme và
thành phần enzyme được tạo thành cũng khác nhau. Hiện tượng này chỉ thấy ở vi
sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật. Khi trong môi trường có những chất
khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường những enzyme tương ứng để
phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì vậy khi cho chất cảm ứng vào
môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật có thể
tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường.Trong công nghệ sản xuất
enzyme cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của

nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [4],[5],[8].
b. Ảnh hưởng của pH của môi trường
pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng
lớn đến sự tổng hợp enzyme. Do đó người ta thường điều chỉnh pH để thu được
enzyme với hiệu suất cao nhất. Mỗi loại enzyme thường được tổng hợp mạnh trong
một vùng pH xác định đối với từng loại vi sinh vật. Ví dụ: amylase và pectinase của
nấm mốc được tổng hợp mạnh trong môi trường có pH = 4,5 - 5,0 còn protease thì
pH = 6 - 6,5 [4],[8].
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme đều thuộc loại ưa
nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22 - 32
0
C, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt
độ cao hơn (35 - 55
0
C) và chúng có khả năng tổng hợp các enzyme có độ bền nhiệt
cao. Khi nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng
hợp enzyme bị giảm rõ rệt [4],[8].
d. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng
thời gian cho phép tích tụ enzyme tối đa. Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi
sinh vật và ít phụ thuộc vào enzyme chúng tổng hợp.
Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm
cho phù hợp [4],[8].

13

1.3.2. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn
Từ trước tới nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên

men bán rắn chủng B. subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hoặc lên men
dịch thể. Một số hướng nghiên cứu Nattokinase tái tổ hợp cũng đang được tiến hành
đem lại kết quả bước đầu khả quan. Mới đây, Weng và cộng sự đã nghiên cứu cải
thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E. coli bằng đột
biến điểm: thay thế Methionin tại vị trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của
enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này [59]. Trong nước,
Nguyễn Thị Thảo và cộng sự (2008) đã nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện
gen mã hóa Subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong E. coli
BL21/pESUb [11]…. Tuy nhiên công nghệ lên men tạo enzyme Nattokinase vẫn là
một hướng nghiên cứu lâu đời và có nhiều triển vọng trong sản xuất enzyme nhằm
sản xuất với số lượng lớn và giảm giá thành sản xuất cho sản phẩm.
Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy vi khuẩn cho sản lượng Nattokinase cao nhất.
a. Ngoài nước

Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B. subtilis natto NLSSE. Khảo
sát các nguồn nitrogen: (NH
4
)
2
SO
4
, NaNO
3
, natri glutamat, casein, pepton từ đậu
nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và
glycerol với hàm lượng 20 g/l. Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N,
MgSO
4

.7H
2
O, KH
2
PO
4
.3H
2
O, cao nấm men và CaCl
2
. Kết quả nguồn carbon tốt
nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase
đạt 1.300 U/ml với thành phần môi trường tối ưu (g/l): pepton đậu nành: 8,28,
CaCl
2
: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [37]. Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối
ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các
nhân tố được chọn để khảo sát: glucose, pepton, MgSO
4
, và CaCl
2
ở 5 mức độ. Hoạt
tính đạt 3.194 U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%,
MgSO
4
0,2% và CaCl
2
0,5% [17]. LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu