Tách chiết, tinh chế ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (amphibia) và xác định một số tính chất của enzym

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






NGUYỄN QUỐC TOẢN



TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG
ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM






LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






NGUYỄN QUỐC TOẢN





TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG
ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM





LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 60720408



Người hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Văn Rư - Bộ môn Hóa sinh -
Trường Đại học Dược Hà Nội
Người hướng dẫn 2: PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng - Bộ môn Dược lý
- Học viện Quân y

Nơi thực hiện đề tài : Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn
lâm khoa học và công nghệ Việt Nam
Thời gian thực hiện : Từ 02/2014 đến 08/2014

HÀ NỘI 2014


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ và hỗ trợ cả về vật chất cũng như tinh thần của các
thầy cô giáo, các quý đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Trước tiên, từ đáy lòng mình tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Rư - Trưởng bộ môn Hóa sinh - Trường đại học
Dược Hà Nội và PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng - Trưởng bộ môn Dược lý - Học
viện Quân y, những người thầy luôn ở bên để hướng dẫn, truyền đạt cho tôi
những kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình làm thí nghiệm
và hoàn thành quyển luận văn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ và bạn
đồng nghiệp tại phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện
tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, song quyển luận văn này chắc chắn sẽ
không tránh khỏi những thiếu sót về các thuật ngữ chuyên môn, nội dung, bố
cục và hình thức trình bày. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ
những nhà chuyên môn, các quý đồng nghiệp và bạn đọc xa gần.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình
cũng như bạn bè đã hết sức ủng hộ, luôn bên cạnh động viên, chia sẽ và giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014
Tác giả





MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Khái quát chung về RNase 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất 4
1.1.3. Cấu trúc phân tử 4
1.1.4. Cơ chế xúc tác 6
1.2. Các chức năng sinh học của RNase 7
1.2.1. Chức năng tiêu hoá 7
1.2.2. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN 7
1.2.3. Tham gia vào quá trình hiệu chỉnh của ARN 8
1.3. Các chức năng sinh học mới của RNase 8
1.3.1. Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus 8
1.3.2. Hoạt tính cytotoxicity 9
1.3.3. Các chức năng sinh học khác 11
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đển hoạt tính RNase 13
1.4.1. Nhiệt độ 13
1.4.2. pH môi trường 13
1.4.3. Các chất kìm hãm (Inhibitor) 14
1.4.4. Các chất hoạt hoá 15
1.5. Các công trình nghiên cứu về RNase từ nội tạng động vật 15
1.6. Khả năng ứng dụng của RNase trong y học 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1. Nguyên liệu và hoá chất 20
2.1.1. Nguyên liệu 20
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 20
2.1.3. Hóa chất 21


2.2. Các phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Phương pháp chiết rút enzym 22
2.2.2. Phương pháp thử tính bền nhiệt của RNase 22
2.2.3. Phương pháp tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat 23

2.2.4. Định tính hoạt tính của RNase bằng phương pháp đục lỗ trên gel
agarose 25
2.2.5. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 25
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính RNase 26
2.2.7. Xác định sơ bộ băng RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid
không biến tính kết hợp ép gel agarose 28
2.2.8. Phương pháp loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 30
2.2.9. Tinh chế RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 31
2.2.10. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên hoạt
tính của RNase 34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1. Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE và DCTC 35
3.1.1. Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE 35
3.2.2 Kết quả thủ tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTC 38
3.3. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein
thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat. 47
3.3.1. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn
protein thu được từ DCTE 47
3.3.2. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase từ các phân đoạn
protein thu được từ DCTC 51
3.4. Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase bằng phương pháp điện di
Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel Agarose 54
3.4.1. Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn
protein thu được từ DCTE 54


3.4.2. Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn
protein thu được từ DCTC 55
3.5. Loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 57

3.6. Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 58
3.7. Kết quả nghiên cứu một số tính chất của RNase từ DCTE và DCTC 59
3.7.1. Xác định giá trị t
0
opt
59
3.7.2. Xác định giá trị pH
opt
61
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63

4.1. Về việc lựa chọn môi trường để chiết rút RNase từ trứng cóc nhà và
trứng ếch đồng 63
4.2. Về kết quả nghiên cứu tính bền nhiệt của các RNase chiết rút từ trứng
cóc nhà và trứng ếch đồng 63
4.3. Về sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được
bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat 64
4.4. Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase từ các loại dịch chiết bằng
phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose 65
4.5. Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69





DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT

A Hoạt tính enzym
A
0
Hoạt tính riêng của enzym
ADN Acid Deoxyribonucleic
Amph Amphinase
ARN Acid Ribonucleic
BS - RNase Ribonuclease từ tinh dịch bò (Bovine seminal ribonuclease)
CV Thể tích cột Hitrap SP XL 1ml
DC Dịch chiết
DCTC
a
Dịch chiết trứng cóc nhà trong môi trường H
2
SO
4
0,25N
DCTC
b
Dịch chiết trứng cóc nhà trong môi trường đệm PBS
DCTE
a
Dịch chiết trứng ếch đồng trong môi trường H
2
SO
4
0,25N
DCTE
b
Dịch chiết trứng ếch đồng trong môi trường đệm PBS

dH
2
O Nước khử ion
đv E Đơn vị enzym
Gly Glycin
Mr Khối lượng phân tử
OD Mật độ quang học
ONC Onconase
Phđ Phân đoạn
pH
opt
pH tối ưu


Pr Protein
RNase Ribonuclease
TC Trứng cóc nhà
TE Trứng ếch đồng
t
opt
Nhiệt độ tối ưu
TTHĐ Trung tâm hoạt động

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33] 24

Bảng 3.1. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại
trong dịch ly tâm từ DCTE
a
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong
5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 35

Bảng 3.2. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại
trong dịch ly tâm từ DCTE
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong
5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 37

Bảng 3.4. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại
trong dịch ly tâm từ DCTC

a
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở
100
0
C trong các khoảng thời gian khác nhau 41

Bảng 3.5. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại
trong dịch ly tâm từ DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR
trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 43

Bảng 3.6. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại
trong dịch ly tâm từ DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở
100
0
C trong các khoảng thời gian khác nhau 45

Bảng 3.7. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong
các phân đoạn protein nhận được từ DCTE
a
48

Bảng 3.8. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong
các phân đoạn protein nhận được từ DCTE
b
50

Bảng 3.9. Kết quả xác lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong các
phân đoạn protein nhận được từ DCTC
a
51

Bảng 3.10. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong
các phân đoạn protein nhận được từ DCTC
b
53

Bảng 3.11. Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi ủ hỗn hợp phản ứng
trong 1 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 59

Bảng 3.12. Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi cho hỗn hợp phản ứng
1 phút trong môi trường đệm Natri phosphat ở các giá trị pH khác
nhau 61





DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc không gian của RNase A 5

Hình 1.2. Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase (màu xanh là nhóm amino,
màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng trung tâm hoạt động) . 6

Hình 2.1. Thứ tự các lỗ đục trên gel Agarose 25

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTE
a
ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 36

Hình 3.3. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE
b

sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ
khác nhau 37

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch
ly tâm từ DCTE
b
ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 38

Hình 3.5. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ
DCTC
a
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị
nhiệt độ khác nhau 39

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch
ly tâm từ DCTC
a
ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 40

Hình 3.7. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ
DCTC
a
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100

0
C trong các khoảng
thời gian khác nhau 41

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch
ly tâm từ DCTC
a
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100
0
C trong
các khoảng thời gian khác nhau. 42

Hình 3.9. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ
DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các nhiệt độ
khác nhau 43

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch
ly tâm từ DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở
các nhiệt độ khác nhau. 44

Hình 3.11. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ
DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100
0
C trong các khoảng

thời gian khác nhau 45



Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch
ly tâm từ DCTC
b
sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100
0
C trong
các khoảng thời gian khác nhau 46

Hình 3.13. Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein
nhận được từ DCTE
a
48

Hình 3.14. Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein
nhận được từ DCTE
b
49

Hình 3.15. Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein
nhận được từ DCTC
a
51

Hình 3.16. Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein
nhận được từ DCTC
b

52

Hình 3.17. Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được
từ DCTE
a
54

Hình 3.18. Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được
từ DCTE
b
55

Hình 3.19. Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được
từ DCTC
a
56

Hình 3.20. Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được
từ DCTC
b
56

Hình 3.21. Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các mẫu thu được sau khi
đi qua cột loại muối Sephadex G25 57

Hình 3.22. Sắc ký đồ của các phân đoạn DCTE
b
và DCTC
b
trên cột Hitrap

SP XL 58

Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTE
b
vào
nhiệt độ 60

Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTC
b
vào
nhiệt độ 60

Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTE
b
vào pH 62

Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTC
b
vào pH 62





1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ung thư là một bệnh có tỷ lệ tử vong cao, chi phí điều trị lớn
nhưng hiệu quả lại rất thấp. Cho đến nay con người vẫn chưa biết chính xác
nguyên nhân gây ra bệnh ung thư do đó chưa tìm được thuốc nào điều trị đạt

được kết quả một cách triệt để. Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư chủ yếu do
sự sai hỏng của phân tử ADN, tạo nên các đột biến ở các gene thiết yếu điều
khiển quá trình phân bào. Một hoặc nhiều đột biến sẽ gây ra sự tăng sinh tế
bào không thể kiểm soát được và tạo thành khối u.
Người ta đã nghiên cứu để tìm ra nhiều phương pháp chữa bệnh ung
thư, dùng nhiều tiến bộ khoa học vào việc chẩn đoán sớm bệnh để điều trị
bằng thuốc hoặc cắt bỏ sớm không cho tế bào ung thư di căn vào các cơ quan
khác trong cơ thể. Trong các phương pháp để điều trị ung thư thì phương
pháp hóa trị liệu sử dụng các hóa chất có tác dụng ngăn cản sự phát triển của
tế bào ung thư là một phương pháp rất quan trọng, đang được sử dụng phổ
biến hiện nay.
Việc sử dụng enzym ribonuclease (RNase) làm thuốc chữa bệnh đã
được phôi thai cách đây hàng nửa thế kỉ. Đó là vào cuối những năm 50 của
thế kỉ XX một số nhà khoa học đã phát hiện ra hoạt tính gây độc tế bào (hay
hoạt tính cytotoxicity) của các RNase và nghĩ tới khả năng sử dụng nuclease
để chữa bệnh do virus. Hiện nay một trong những hướng nghiên cứu quan
trọng đang được tiến hành trên thế giới là kiếm tìm nguồn RNase tự nhiên có
hoạt tính gây độc tế bào và chuyển các RNase từ dạng không hoạt tính
cytotoxicity thành các dạng có hoạt tính cytotoxicity, nhất là với các enzym
tuýp tụy, để làm thuốc điều trị ung thư. Hơn nữa, ngày càng có nhiều nghiên
cứu thông báo về vai trò của nhiều loại RNase trong hệ thống phòng thủ và tự
vệ của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn và virus. Tuy nhiên
RNase từ nội tạng của động vật còn ít được nghiên cứu. Để góp phần tìm hiểu

2
thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nước ta chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài “ Tách chiết, tinh chế Ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư
(Amphibia) và xác định một số tính chất của enzym”, cụ thể ở đây là trứng
ếch đồng (Ranna rugulosa) và trứng cóc nhà (Duttaphrynus melanostictus).
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với các mục tiêu sau:

1. Xác định được hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein từ dịch
chiết trứng ếch đồng và trứng cóc nhà.
2. Tách chiết, tinh chế và xác định được một số tính chất của RNase
phân lập từ trứng ếch đồng và trứng cóc nhà.












3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Khái quát chung về RNase
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
RNase là nhóm enzym có phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đóng vai
trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của acid nucleic, thực hiện chức
năng tiêu hoá, chống virus, tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể
Vào năm 1950, ba nhà khoa học: Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc) và Clerk
(Bỉ) đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên về khả năng chữa các bệnh
virus bằng RNase[23]. Kết quả bước đầu cho thấy các enzym này có khả
năng kìm hãm sự phát triển của một số loại virus gây bệnh như ospovaxin,
herpes, adenovirus (chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm
(chứa ARN)

Những năm 1960 -1970, RNase tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5) trở
thành mô hình mẫu trong các công trình nghiên cứu enzym học nhờ ưu thế
về nguồn tiếp cận, khả năng tinh chế dễ dàng cũng như kích thước phân tử
nhỏ (~14 kDa) [15]. RNase A cũng là enzym đầu tiên được xác định trình tự
amino acid (Stein, Moor và cộng sự, 1960) và là enzym thứ ba được xác
định cấu trúc (sau Lysozyme và Carboxypeptidase A). Năm 1972, giải
thưởng Nobel hóa học được trao cho Stanford Moore, William Stein và
Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu về RNase. Năm 1984,
Bruce Merrifield vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với công trình
nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A[37]. Từ sau những năm cuối thập
kỷ 80, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng dụng RNase
đã được tiến hành song song và phối hợp chặt chẽ với nhau, đặc biệt là sau
khi có các bằng chứng khoa học cho thấy enzym này có biểu hiện hoạt tính
gây độc tế bào (Cytotoxicity).

4
1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất
Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzym với các chất
xúc tác khác cũng như giữa enzym này với enzym khác. Nhóm nuclease tham
gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của các acid nucleic. Chúng được đặc
trưng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau.
Hầu hết các RNase tìm thấy ở động vật có xương sống đều có tính đặc
hiệu pyrimidin. Nó phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau pyrimidin (của base
cytocil và uracil đầu tiên) mà không phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau purin để
tạo thành dẫn xuất pyrimidin-2’,3’-phosphat vòng. Sau đó các sản phẩm vòng
này được tích lũy hoặc bị thủy phân thành các nucleotide-3'-phosphat bằng cách
phân cắt liên kết C2'-O-P. RNase cũng xúc tác thủy phân tạo nên các phosphat
vòng cytidin-2’,3’-phosphat và uridin-2’,3’-phosphat. Những phosphat vòng này
là tiền chất của các mononucleotide pyrimidin được tìm thấy trong quá trình tiêu
hóa ARN. Phù hợp với tính chất đặc hiệu này là các RNase không tác động đến

các phosphat vòng adenosin-2',3'-phosphat và guanosin-2',3'-phosphat. Cũng
xuất phát từ tính đặc hiệu pyrimidin, RNase chỉ thuỷ phân các acid
polythymidylic, polyuridylic, polypseudouridylic và acid polyguanylic [30, 39].
1.1.3. Cấu trúc phân tử
Trong thế kỉ XX, RNase từ tụy bò (RNase A) được coi là mô hình mẫu
và được nghiên cứu nhiều nhất, đầy đủ nhất về cấu trúc hoá học, tính bền
vững, quá trình bao gói, cơ chế xúc tác cũng như hướng tiến hoá phân tử. Nhờ
vậy chúng ta có thêm thông tin về các enzym thành viên thuộc siêu họ RNase
ngoại tiết (hay siêu họ RNase A). Hiện nay hơn 100 thành viên thuộc siêu họ
RNase A đã được biết đến bao gồm tất cả các RNase ngoại tiết thuộc ngành
động vật có xương sống, từ lớp lưỡng cư cho đến lớp thú. Hầu hết các enzym
thành viên thuộc siêu họ này khác nhau ít nhiều về trình tự amino acid nhưng
lại giống nhau về cấu trúc không gian (dạng monomer), trung tâm hoạt động
và các tính chất xúc tác [37, 39].

5

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của RNase A
RNase A được tiết từ các tế bào ngoại tiết tuyến tụy bò để phân huỷ
một lượng lớn ARN được tạo bởi những vi sinh vật khu trú trong dạ cỏ. Nó có
khối lượng phân tử nhỏ (~14 kD) với 124 gốc amino acid trong các chuỗi
polypeptide, 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein có mặt trong
cấu trúc này (không có Trytophan). Công thức phân tử dạng không tích điện là
C
575
H
907
N
171
O

192
S
12
với Mr = 13 686 Da . Về hình dạng, RNase A giống quả
thận, các gốc của trung tâm hoạt động nằm trong vùng hốc (cleft) -là vùng lõm
của quả thận. Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase bao gồm 4 phiến cấu trúc
đối song song ngược chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn ỏ ngắn. Trong phân tử có
4 cầu nối disunfide được hình thành từ 8 gốc cystein ở các vị trí 26-84; 40-95;
58-110 và 65-72. Các cầu nối này có thể bị phá vỡ bởi mercaptoethanol dư
thừa, tạo thành 8 nhóm -SH tự do làm phân tử enzym bị duỗi ra và mất hoạt
tính xúc tác [37].

6

Hình 1.2. Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase (màu xanh là nhóm amino,
màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng trung tâm hoạt động)
Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều cấu tạo từ một mạch
polypeptide, tức là có cấu trúc monomer, chỉ có một ngoại lệ là RNase trong
tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 -dimer. BS-RNase được tách ra ở
dạng dimer, trong đó hai tiểu đơn vị thành phần (subunit) được nối với nhau
bởi hai cầu disunfide. Ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp
gồm hai cấu trúc bậc 4 hoàn toàn khác nhau, được ký hiệu là M=M (không có
sự trao đổi chéo các đoạn mạch đầu N giữa 2 tiểu đơn vị thành phần) và MxM
(có sự trao đổi chéo trên: một đoạn mạch peptide ngắn đầu N của mỗi tiểu đơn
vị này sẽ liên kết với phần cấu trúc thân chính của tiểu đơn vị kia) [29, 34].
1.1.4. Cơ chế xúc tác
Phản ứng hoá học do RNase xúc tác là phản ứng thuỷ phân liên kết
phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thuỷ phân ARN do
RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm – acid chung
với sự tham gia của 2 gốc His-12 và His-119:

- Giai đoạn 1: Phản ứng diễn ra nhanh, phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản
phẩm trung gian là phosphat vòng mà không giải phóng nhóm acid. Trong giai
đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H
+
ở vị
trí 2') còn His-119 đóng vai trò là acid chung.
Nhóm
Carbonyl
Trung tâm
hoạt động
Nhóm
amino

7
- Giai đoạn 2: Diễn ra chậm hơn và giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc
gốc phosphat trong quá trình thuỷ phân dẫn xuất phosphat vòng. Trong giai
đoạn này vai trò của 2 gốc His-12 và His-119 lại ngược lại: His-119 tương tác
với H
2
O theo cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận
việc proton hoá nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2' [30, 37, 39].
1.2. Các chức năng sinh học của RNase
1.2.1. Chức năng tiêu hoá
Trong cơ thể con người cũng như trong cơ thể động vật bậc cao,
tuyến tụy có một vai trò vô cùng quan trọng đối với quá trình tiêu hoá. Các
acid ribonucleic có trong thức ăn bị phân giải ở tá tràng dưới tác động của
RNase do tuyến tụy tiết ra. RNase sẽ thuỷ phân các ARN thành các
mononucleotide, phosphat vô cơ và oligonucleotide. Sau đó các dạng này
mới tiếp tục bị các enzym khác trong hệ tiêu hoá phân giải thành các dạng
mới giúp cơ thể dễ hấp thụ [39].

1.2.2. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN
Một vai trò rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực
tiếp vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [13, 37, 39]. Điển hình
trong vai trò này phải kể đến RNase H. RNase H thuỷ phân mạch ARN
trong thành phần phân tử lai (heteroduplex) ARN-ADN tạo thành các đoạn
có đầu cuối 5'-P và 3'-OH. Enzym này không thể hiện hoạt tính với cả ds-
và ss-ARN (ARN có cấu trúc mạch kép và cấu trúc mạch đơn). RNase H
chính của người (HI) được tách từ các tế bào tăng bạch hồng cầu K562, đây
là một loại tế bào ung thư. RNase H được phân ra làm 2 loại: RNase HI và
RNase HII [39].
- RNase HI đóng vai trò loại bỏ ARN mồi trong quá trình sao chép
ADN. RNase này có Mr = 89 kDa, cần cation hoá trị 2 cho hoạt tính xúc tác,
pH tối ưu trong khoảng 8,0 – 8,5 khi có mặt 10 mM Mg
2+
cho thực hiện chức
năng của nó.

8
- RNase HII có Mr = 33 kDa và được tách chiết từ nhau thai, tham gia
vào quá trình sao mã (tổng hợp ARN) [39], để thực hiện chức năng của mình
nó cần ion Mg
2+
, pH tối ưu trong vùng 8,5 -9.
1.2.3. Tham gia vào quá trình hiệu chỉnh của ARN
Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hoá phức
tạp với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau [39]. Một trong những
RNase đó là RNase P. Enzym này có mặt ở cả sinh vật thuộc nhóm đơn giản
như vi khuẩn cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn
(Eucaria). RNase P là một enzym có hai thành phần chính là ARN và protein
gắn với nhau, trong đó tiểu đơn vị protein chiếm trọng lượng phân tử nhỏ còn

tiểu đơn vị ARN đóng vai trò là TTHĐ và chiếm trọng lượng chủ yếu trong
thành phần enzym. ARN có cấu trúc bậc 2 và có thể biểu hiện hoạt tính ngay
cả khi không có tiểu phân tử protein [31].
RNase P giữ vai trò thuỷ phân liên kết phosphodiester trên phân tử tiền
chất tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp protein. Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng
cách dùng các trình tự định hướng để liên kết với cơ chất qua các liên kết cặp
đôi base, sau đó cắt rồi phân li sản phẩm [31, 39].
1.3. Các chức năng sinh học mới của RNase
1.3.1. Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus
Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây bệnh
xâm nhập vào cơ thể như các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh vật,
các phân tử lạ Đến nay, chúng ta đã tìm ra được nhiều loại RNase có khả
năng tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus như RNase L, RNase bạch
cầu ưa axit ECP và EDP, Onconase, Amphinase, BS-RNase…
RNase L là endonuclease được tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon,
được hoạt hoá bởi 2', 5'-oligoriboadenylat (các gốc A liên kết với nhau bằng
các liên kết 2', 5'-phosphodiester) và được phosphoryl hoá, có Mr = 83,5 kDa.

9
RNase L thuỷ phân cả ARN của vi khuẩn và của tế bào theo các trình tự UpN,
ApU trong cùng một mạch của ARN tạo thành sản phẩm có các đầu cuối 3'-
phosphat và 5'-OH. Hoạt động của enzym này cần sự có mặt của các ion Mg
2+

và ATP. RNase L bị ức chế bởi protein-inhibitor đặc hiệu RL-I (là protein cản
trở thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [39].
Ngoài RNase L đã nêu trên, còn nhiều RNase khác có hoạt tính chống
virus như ECP, EDN của bạch cầu [21, 25] BS-RNase [25] và cả Onconase
[25]. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn, thể hiện hoạt tính cytotoxicity,

neurotoxin và helmintotoxin. EDN là glycoprotein, trong trình tự amino acid
của nó, có 5 trình tự glycosyl hoá tại Asn (tại các vị trí 17, 59, 65, 84 và 95).
ECP là một protein rất kiềm (với điểm đẳng điện pI = 10,8), có 3 điểm
glycosyl hoá bởi oligosacchatide phức tạp giống với EDN [39].
1.3.2. Hoạt tính cytotoxicity
Hoạt tính cytotoxicity là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng
của RNase. Trong số hơn 100 enzym thuộc siêu họ RNase A được biết cho
đến nay, chỉ có BS-RNase (enzym từ tinh dịch bò) và các RNase từ 3 loài ếch:
ếch báo phương Bắc Rana pipiens, ếch bò Rana catesbeiana và ếch đồng
Nhật Bản Rana japonica -là có hoạt tính cytotoxicity [13, 19, 32, 37, 41]. Cơ
sở của hoạt tính cytotoxicity là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein
ức chế (RI) trong bào tương [11, 12, 14, 18, 37], nhờ đó RNase dễ dàng phân
cắt cơ chất ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp hiệu quả diệt khối u được nâng
cao. Ba enzym có hoạt tính cytotoxicity được nghiên cứu nhiều là Onconase
(ONC), Amphinase (Amph) và BS-RNase:
- ONC là một protein được tinh sạch từ trứng và phôi sớm của loài ếch
Rana pipiens có hoạt tính chống ung thư. Protein này còn được kí hiệu là P
30. Đó là một protein-monomer, có phân tử cấu tạo từ một chuỗi polypeptide
với Mr = 12 000 Da và có tính tương đồng cao với RNase A [16, 32]. ONC
bám vào tế bào với 2 lực bám khác nhau: một lực bám có K
d
= 6,2x10
-6
và

10
một lực bám có K
d
= 2,5x10
-7

. Ủ ở 4
0
C làm tăng tỉ lệ ONC bám vào tế bào tỉ
lệ với nồng độ bám ở 37
0
C và cũng làm tăng độ mẫn cảm của tế bào với hoạt
tính gây độc của ONC. Các dẫn liệu này cho thấy rằng bước mà ONC bám
vào thụ thể trên bề mặt tế bào là bước khởi đầu cho sự thể hiện độc tính của
nó. Hoạt tính này có thể bị ức chế bởi NaN
3
và 2-deoxyglucose. Hoạt tính gây
độc tế bào của nó gấp 10 lần Monensin. Hoạt tính RNase rất cần thiết cho sự
thể hiện độc tính vì khi ONC được alkyl hoá hoạt tính ribonucleolytic của nó
chỉ còn lại 2% so với hoạt tính này của enzym ban đầu và khả năng ức chế sự
tổng hợp protein tế bào của ONC đã được alkyl hoá cũng bị giảm đi tương
ứng 100 lần [40]. Không giống như RNase A, ONC không bị ức chế bởi
protein ức chế RNase có trong tế bào chất (RI), chất ức chế RNase từ nhau
thai (PRI) [13, 32]. ONC bám trên bề mặt các tế bào nhờ các thụ thể, chúng
xâm nhập vào trong tế bào và thực hiện quá trình phân huỷ ARN của tế bào
đó, nhờ đó ức chế quá trình tổng hợp protein và làm cho tế bào bị chết [32].
- Amphinase (Amph) được phát hiện có trong trứng loài ếch Rana
pipiens. Ở động vật lưỡng cư, Amph vượt qua được các chất ức chế để phá
hủy tế bào ung thư. Amph có khả năng nhận biết và gắn vào một loại đường
trên màng tế bào ung thư, qua đó xâm nhập được vào bên trong tế bào ung
thư, phá hủy ARN, ngăn cản quá trình nhân lên của tế bào ung thư [42]. Hiện
nay, trên thế giới có công trình của GS. Ravi Acharya - Trường Đại học Bath
(Anh) hợp tác với tập đoàn Alfacell (Mỹ) đã phân lập và giải trình tự thành
công Amph. Theo GS. Acharya, Amph là một phân tử sinh học hoạt động rất
mạnh mẽ. Amph khi tiêm trực tiếp vào vùng có khối u không gây hại cho các
tế bào lành xung quanh [28].

- BS-RNase được tách chiết từ tinh dịch bò, chúng là một dạng đồng đẳng
dimer của RNase A từ tụy bò, có độc tính với các tế bào của động vật có vú. Trái
ngược với BS-RNase dimer, dạng monomer của BS-RNase lại không có độc
tính và bám chặt với chất ức chế của RNase trong tế bào chất. BS-RNase dimer

11
đi vào trong tế bào theo phương thức hấp thụ chứ không phải là nội nhập bào
qua trung gian thụ thể tế bào và sau đó không tương tác với chất ức chế của
RNase trong tế bào chất, thể hiện hoạt tính phân huỷ ARN của tế bào [34]. Hoạt
tính gây độc tế bào của BS-RNase có liên quan đến cấu trúc bậc bốn của nó: chỉ
dạng BS-RNase dimer có hoạt tính cytotoxicity, còn dạng BS-RNase monomer
hoàn toàn không độc với tế bào [34]. Ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là
một hỗn hợp gồm hai cấu trúc bậc bốn hoàn toàn khác nhau, có thể biến đổi qua
lại: M=M và MxM (Picolli và cộng sự 1992). Sự biến đổi thuận nghịch của
M=M và MxM là kết quả của sự biến đổi của các chuỗi xoắn  ở đầu tận cùng N
giữa các tiểu đơn vị như là nó đã diễn ra trong suốt quá trình dimer hoá nhân tạo
RNase A [12]. Hoạt tính cytotoxicity của dạng MxM cao hơn của dạng M=M vì
nó tồn tại bền vững trong môi trường khử của bào tương. Thay thế Cys-31 hay
Cys-32 bằng Ser không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, nhưng làm giảm lượng
của dạng MxM ở trạng thái cân bằng và giảm hoạt tính cytotoxicity [34].
Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung thư người ta
đã tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy người mang
hoạt tính cytotoxicity, kể cả ở dạng dimer [11, 12] và monomer [14, 20, 22].
1.3.3. Các chức năng sinh học khác
Ngoài những chức năng chính đã kể trên đây, RNase còn biểu hiện
nhiều hoạt tính khác đặc trưng cho từng loại tế bào, từng loại mô trong các cơ
quan khác nhau của cơ thể:
- RNase 5 (Angiogenin) tham gia vào sự hình thành mao mạch -kích
thích sự phát triển mao mạch mới [39].
- BS-RNase gây ức chế miễn dịch [34].

- Một số RNase thể hiện độc tính chọn lọc: hoạt tính kháng khuẩn
(ECP, EDP), kháng giun, kháng côn trùng [39].
Bên cạnh các RNase, trong cơ thể người còn có một số protein biểu
hiện hoạt tính ribonucleolytic như Lactoferrin, ABzyme

12
- Lactoferrin có trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết (mật, nước mắt),
Mr = 80 kDa. Chức năng sinh lý chính của Lactoferrin trước đây được cho là
vận chuyển sắt. Tuy nhiên, protein này còn có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích
phân chia tế bào, tham gia điều hoà quá trình tạo nguyên bào tủy xương và có
các tính chất kích thích miễn dịch. Protein này có 3 dạng iso khác nhau là Lf-,
Lf- và Lf-. Người ta đã chỉ ra rằng 2 trong 3 isoform của Lactoferrin (Lf- và
Lf-) không liên kết sắt, mà là các RNase đặc hiệu pyrimidin (tạo các sản phẩm
với đầu cuối 3'-phosphat và 5'-OH). pH tối ưu của phản ứng là 7,5

8,0,
isoform thứ 3 (Lf-) liên kết sắt và không có hoạt tính RNase [39].
- Các kháng thể thuỷ phân ARN: cách đây không lâu các nhà khoa học
đã chỉ ra rằng, trong máu của các bệnh nhân mắc chứng lao ban đỏ và cả
nhiều loại bệnh tự miễn khác có mặt các kháng thể thuỷ phân ARN hay
ABzyme. Các ABzyme cũng đã phát hiện thấy có trong sữa người. Giả định
rằng, các kháng thể này là các antiidiotip thứ cấp (cấp II) bắt chước trung tâm
hoạt động của RNase. Hoạt tính thuỷ phân ARN của kháng thể còn chưa được
đặc trưng kỹ với các cơ chất chuẩn, nhưng đã rõ rằng trong các kháng thể này
có cả các protein giống và khác nhau, đã phát hiện được các hoạt tính tương
ứng với tính đặc hiệu cuả RNase 1 (RNase tuýp tụy) trong các chế phẩm Ig.
Ngoài ra còn tìm thấy các tuýp hoạt tính RNase khác được kích thích (hoạt
hoá) bởi ion Mg
2+
[17, 39].

Cho đến nay vẫn chưa rõ về vai trò sinh lí của hoạt tính ribonucleolytic của
lactoferrin và ABzyme. Có thể giả định rằng các protein này cũng có một vai trò
nào đó trong phản ứng tự vệ của cơ thể. Giả định này rất phù hợp với các dẫn liệu
về việc phát hiện được nhiều protein có hoạt tính RNase với chức năng tự vệ ở cả
vi sinh vật và thực vật, như các ribotoxin -sarcin từ nấm mốc Aspergillus
giganters, antigen Asp f1 của Aspergillus fumigatus góp phần đa dạng hoá nguồn
RNase tự nhiên tạo cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị bệnh.

13
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đển hoạt tính RNase
Hoạt tính của RNase phụ thuộc vào nhiều yếu tố hoá lí như: nhiệt độ,
pH, môi trường, chất ức chế, chất hoạt hoá, các tác nhân biến tính…Sự thay
đổi hàm lượng hay nồng độ các yếu tố trên dù rất nhỏ cũng gây ảnh hưởng ít
nhiều đến hoạt tính chung của RNase trong tế bào.
1.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phản ứng thuỷ phân ARN. Khi nhiệt
độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzym thu được một năng lượng lớn hơn nên
có xu hướng chuyển động nhanh hơn. Năng lượng mà chúng thu được có thể đủ
để thắng các tương tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các protein hình cầu dẫn
đến một sự biến đổi hình thể protein và do đó làm giảm hoạt tính của enzym. Nếu
nhiệt độ cao quá enzym sẽ bị biến tính, ít có khả năng phục hồi hoạt độ. Ở nhiệt
độ thấp dưới 0
0
C, hoạt độ enzym tuy giảm nhưng vẫn có thể tăng lên khi đưa về
nhiệt độ bình thường. Hầu hết các RNase có nhiệt độ thích hợp khoảng 40-70
0
C
(Invitro). Ví dụ: RNase tụy có nhiệt độ tối ưu là 60
0
C; RNase tinh khiết tách từ

nọc rắn hổ mang Naja naja vùng Guntur Ấn Độ hoạt động tốt ở 37-60
0
C với nhiệt
độ tối ưu là 37
0
C [38]; một số enzym rất bền với nhiệt nhưng hoạt tính không tăng
tuyến tính với nhiệt độ như RNase nọc rắn hổ mang đen của Việt Nam: ở 25-49
0
C
hoạt tính enzym được tăng cường, từ 59-90
0
C thì hoạt tính enzym giảm đáng kể
và tới 100
0
C thì hoạt tính lại cao nhất [3, 4, 7, 8, 10]. Một số enzym khác thì kém
bền nhiệt, ví dụ: RNase trong nọc rắn hổ mang vùng Trung Á Liên Xô (Naja
oxiana) bị mất 50% hoạt tính khi đun cách thuỷ 5 phút ở 50
0
C và mất hoàn toàn
hoạt tính khi xử lý như vậy ở 70
0
C [27, 36].
1.4.2. pH môi trường
pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym cũng như độ bền của protein
enzym. Các nghiên cứu trước đây về RNase cho thấy hầu hết các enzym này
thể hiện hoạt tính cao nhất ở vùng pH 6 đến pH 9, nhưng pH thích hợp nhất

14
cho RNase hoạt động là từ 7 đến 8. Nếu pH quá cao hay quá thấp hoạt tính

RNase đều bị giảm hay biến mất. Ví dụ, RNase tụy bò có pH
opt
= 7,7; RNase
nấm men rượu có pH
opt
= 7,6 [30, 39].
1.4.3. Các chất kìm hãm (Inhibitor)
RNase có mặt trong mọi cơ thể sống kể cả ở người và đóng vai trò quan
trọng trong rất nhiều quá trình nền tảng của tế bào do đó hoạt tính của nó
được kiểm soát chặt chẽ bởi một hệ thống điều hoà tinh vi, đó là các chất kìm
hãm có bản chất protein do chính tế bào sản sinh ra. Các protein kìm hãm
ribonuclease (RI) có nhiều trong dịch bào của động vật có vú, phân bố ở
nhiều mô và giữ vai trò bảo vệ tế bào khỏi độc tính của các RNase.
RI có khối lượng phân tử khoảng 50 000 Da, chiếm 0,01-0,1% tổng số
protein trong bào tương. Riêng ở nhau thai và não tỉ lệ này lớn hơn, tương
ứng là 0,1% và 0,08% [18, 37, 39].
Phân tử RI có ái lực mạnh với RNase, chúng tạo phức với nhiều thành
viên thuộc siêu họ RNase A theo tỉ lệ 1:1. Mỗi phân tử RI chứa từ 30-32 gốc
Cys dạng khử nên môi trường khử như dịch bào rất phù hợp để duy trì hoạt
tính RI. Việc oxy hoá một gốc Cys sẽ kéo theo sự oxy hoá các gốc còn lại.
Khi bị oxy hoá, RI mất khả năng liên kết với RNase và nhanh chóng bị thuỷ
phân bởi protease trong tế bào [1].
Tuy nhiên, khả năng bảo vệ tế bào của RI cũng bị hạn chế bởi một số
enzym. Chẳng hạn, BS-RNase có cấu trúc bậc 4 dạng dimer có thể thoát khỏi
sự kiểm soát của RI nên độc với tế bào. Chỉ khi hai cầu nối disunfide bị khử,
dạng dimer này chuyển thành hai tiểu đơn vị BS-RNase monomer bị RI kìm
hãm nên mất hoàn toàn hoạt tính. Hầu hết các thành viên thuộc siêu họ RNase
A có cấu trúc monomer đều bị kìm hãm bởi RI có trong dịch bào, ngoại trừ
ONC và Amph. Chúng nằm ngoài vùng kiểm soát của RI nhờ những đặc
trưng về mặt cấu trúc với vòng ngoài của phân tử protein bị cắt ngắn, đa số