Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 7 (3’ spiro1,3dioxolan 2’ oxoindolin 1’ yl)heptanamid và một số dẫn chất

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ VÂN TRANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
N-HYDROXY-7-(3’-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-
2’-OXOINDOLIN-1’-YL)HEPTANAMID
VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ






HÀ NỘI - 2015
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!

!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
!


NGUYỄN THỊ VÂN TRANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
N-HYDROXY-7-(3’-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-
2’-OXOINDOLIN-1’-YL)HEPTANAMID
VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1. TS. Phan Thị Phương Dung
2. ThS. Trần Thị Lan Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược!



HÀ NỘI - 2015
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!

!
!
!

LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiệ n đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với
những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám
ơn chân thành đến GS. Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phương Dung, ThS.
Trần Thị Lan Hương và DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại
học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi
trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đạ i học Quốc gia Chungbuk - Hàn
Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè
đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Trang





!

!

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
2
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
2
1.1.1. Khái niệm histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase
(HDAC)

2
1.1.2. Phân loại các HDAC
3
1.1.3. Vai trò sinh học của HDAC và cơ chế chống ung thư của các chất ức chế
HDAC

3
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
6
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
6
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
7

1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
8
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI

12
1.3.1. Thay đổi nhóm khoá hoạt động
12
1.3.2. Thay đổi cầu nối
13
1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG
NƯỚC

14
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
16
2.1.1. Hóa chất
16
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
16
!
!

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
16
2.2.1. Tổng hợp hóa học

16
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
17
2.3.1. Tổng hợp hóa học
17
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
18
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
21
3.1. HÓA HỌC
21
3.1.1. Tổng hợp hóa học
21
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
29
3.1.3. Xác định cấu trúc
30
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
34
3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
34
3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
34
3.2.3. Sơ bộ đánh giá mức độ giống thuốc
34
3.3. BÀN LUẬN
35
3.3.1. Tổng hợp hóa học

35
3.3.2. Khẳng định cấu trúc
36
3.3.3. Thử hoạt tính sinh học
39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC




!
!

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13
C-NMR
:
Cộng hưởng từ hạt nhân
13
C
CTCL
:
U da tế bào lympho T
DCM
:
Dicloromethan
DMF

:
Dimethyl formamid
HAT
:
Histon acetyltranferase
HDAC
:
Histon deacetylase
1
H-NMR
:
Cộng hưởng từ hạt nhân
1
H
IR
:
Phổ hồng ngoại
MeOH
:
Methanol
MS
:
Phổ khối lượng
RPMI 1640
:
Môi trường nuôi cấy được phát triển bởi Viện tưởng niệm
Roswell Park
SAHA
:
Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG
:
Nhóm nhận diện bề mặt
T°
nc
:
Nhiệt độ nóng chảy
TB
:
Tế bào
TCA
:
Acid tricloroacetic
TLC
:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
TSA
:
Trichostatin A
TsOH
:
Acid p-toluensulfonic
ZBG
:
Nhóm kết thúc gắn với kẽm




!

!

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1: Cấu trúc và hoạt tính của các dẫn xuất SAHA
ω-alkoxy trong nghiên cứu của Hanessian S. và cộng sự
10
2
Bảng 1.2: Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic
được thiết kế, tổng hợp trong nước
15
3
Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid
hydroxamic từ ester
29
4
Bảng 3.2: Giá trị R
f
và nhiệt độ nóng chảy (t
o
nc
) của các dẫn
chất IVa-d
30
5
Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d
31

6
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất
IVa-d
31
7
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các dẫn chất
IVa-d
32
8
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các dẫn
chất IVa-d
33
9
Bảng 3.7: Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất
IVa-d theo quy tắc Lipinsky
34
10
Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn
chất IVa-d bằng phương pháp định lượng IC
50

40
11
Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của
các dẫn chất IVa-d
41

12
Bảng 3.10: Kết quả thử hoạ t tính của các acid hydroxamic
có khung isatin-3-oxim, isatin-3-methoxim và 3-spiro[1,3]
dioxolan-2-oxoindolin
43


!
!

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Cấu trúc chromatin điều khiển quá trình phiên mã, dịch
mã
2
2
Hình 1.2: Vai trò điều khiển sự chết tế bào theo chương trình
của các chất ức chế HDAC
4
3
Hình 1.3: Vai trò điều khiển chu trình tế bào của các chất ức chế
HDAC
5
4
Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC
7
5

Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
8
6
Hình 1.6: Cấu trúc apicidin và azumamid E
8
7
Hình 1.7: Tương tác giữa HDAC4 và một hợp chất có cầu nối
mạch vòng trong nghiên cứu của Micco S.D. và cộng sự
9
8
Hình 1.8: Mô hình ZBG theo nghiên cứu của Vanommeslaeghe
K. và cộng sự
11
9
Hình 1.9: Cấu trúc các chất trong nghiên cứu của Feng T. và
cộng sự
13
10
Hình 1.10: Cấu trúc cơ bản của các hợp chất tương tự SAHA có
nhóm thế tại C7 trong nghiên cứu của Taddei M. và cộng sự
13
11
Hình 1.11: Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và
cộng sự
14
12
Hình 1.12: Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên
cứu và công bố
14
13

Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất
IVa-d theo phương pháp Western blot
39
14
Hình 3.2: Biểu đồ so sánh tác dụng của các dẫn chất IVa-d trên
từng dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1
42
!
!

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT
Tên sơ đồ
Trang
1
Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung
21
2
Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIa
21
3
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIIa
22
4
Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVa
23
5
Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVb
25
6

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVc
26
7
Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVd
28
8
Sơ đồ 3.8: Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-d
35
9
Sơ đồ 3.9: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-d
35
10
Sơ đồ 3.10: Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d
36

!


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) là các enzym
quan trọng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen. Nhiều nghiên cứu cho
thấy sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá
trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [15,20]. Do đó,
các HDAC là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung
thư hiện nay [12,21,39]. Trong số các loại chất ức chế HDAC đã được tổng hợp và
công bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt
một dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza
®
) ,

đã được FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL).
Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứ u tại bộ môn Hóa Dược - Đại học
Dược Hà Nội cũng đã tổng hợp, thử hoạ t tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất
acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt. Trong
bài báo khoa học của GS. Nguyễn Hải Nam và cộng sự [31], các acid hydroxamic
tương tự SAHA được tổ ng hợp sử dụng khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol làm nhóm
khoá hoạt động, đã cho tác dụng ức chế HDAC tốt hơn nhiều lần SAHA. Các kết
quả nghiên cứu trên cho thấy sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt động có khả
năng cho hoạt tính tốt. Dựa vào kế t quả trên, nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Hải
Nam [1,30] tiếp tục tổng hợp các chất có nhóm khoá hoạt động là dị vòng isatin-3-
oxim và isatin-3-methoxim với cầu nối heptanamid (thay thế cầu nối octandiamid
trong SAHA), kết quả thu được cũng rất khả quan. Trên cơ sở các nghiên cứu trên,
chúng tôi tiến hành tổng hợp các chất hướng ức chế HDAC với cầu nối heptanamid
được tiếp tục sử dụng nhưng nhóm khoá hoạt động được thay đổi bằng khung 3-
spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin. Đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của
N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid và một số
dẫn chất” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid
và 3 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp đượ c.
!


2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
Nhiễm sắc thể được cấu thành từ các đơn vị cấu trúc cơ bản là các protein,
gọi là mononucleosom. Mỗi mononucleosom là một octamer của các histon (gồm 2
cặp của mỗi protein H2A, H2B, H3 và H4) [24].
Các đầu tận của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình methyl

hoá (Me), phosphoryl hoá (P) hoặc acetyl hoá (Ac) sau dịch mã. Quá trình acetyl
hoá histon được điều khiển bởi các enzym histon acetyltransferase (HAT) và histon
deacetylase (HDAC) [5].
1.1.1. Khái niệm histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase
(HDAC):
Histon acetyltransferase (HAT): là enzym acetyl hoá nhóm ε-NH
2
trong gốc
lysin (đầu N tận) của histon, làm trung hoà điện tích dương trên lysin, do đó giảm
khả năng tương tác của histon vớ i ADN (tích điện âm), tạo ra cấu trúc mở của
chromatin. Vì vậy, sự acetyl hoá histon tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch
mã xảy ra (hình 1.1b) [5,19].
Histon deacetylase (HDAC): là enzym có tác dụng đố i lập với HAT. HDAC
loại bỏ nhóm acetyl từ acetyllysin (Ac-Lys) ở đầu N tậ n của histon, làm đóng xoắ n
chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã (hình 1.1a) [5,19].


Hình 1.1: Cấu trúc chromatin điều khiển quá trình phiên mã, dịch mã
a. Sự methyl hoá và deacetyl hoá tạo ra cấu trúc “đóng” của chromatin, gây ức chế quá trình
phiên mã, dịch mã với sự tham gia của enzym HDAC
b. Sự acetyl hoá và demethyl hoá tạo ra cấu trúc “mở” của chromatin, tạo điều kiện cho quá trình
phiên mã, dịch mã với sự tham gia của enzym HAT
!


3
1.1.2. Phân loại các HDAC
Cho đến nay, 18 HDAC đã được tìm thấ y ở người. Các HDAC có thể được
chia thành 2 loại: loại phụ thuộc Zn
2+

và loại phụ thuộc NAD
+
(nicotinamid adenin
dinucleotid) [32].
HDAC cũng có thể được chia thành 4 nhóm [32]:
Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8.
Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10.
Nhóm III: Sirtuin (SIRT) 1-7.
Nhóm IV: HDAC11.
Trong đó nhóm III là các HDAC phụ thuộc NAD
+
, nhóm I, II, IV là các
HDAC phụ thuộc Zn
2+
. Nhóm I, II, IV còn được gọi là nhóm các HDAC “kinh
điển” [32].
1.1.3. Vai trò sinh học của HDAC và cơ chế chống ung thư của các chấ t ức chế
HDAC
1.1.3.1. Điều khiển quá trình phiên mã
HDAC được coi là chất ức chế quá trình phiên mã. Sự acetyl hoá histon bởi
các enzym HAT làm trung hoà điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng
tương tác với ADN (tích điện âm). Vì vậy, sự acetyl hoá histon tạo điều kiện cho
các yếu tố kích thích quá trình phiên mã gắn vào ADN, thúc đẩy quá trình phiên
mã. Ngược lại, sự khử nhóm acetyllysin của các HDAC ngăn cản quá trình phiên
mã [20]. Sự mất cân bằng hoạt động của HAT và HDAC có thể dẫ n đến những sai
lệch trong quá trình phiên mã, từ đó dẫn đến bất thường biểu hiện gen [20].
1.1.3.2. Điều khiển sự chết tế bào theo chương trình
Sự chết tế bào theo chương trình được điều khiển bởi nhiều phức hợp
protein. Quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố nội tại và yếu tố ngoại lai, trong
đó có các HDAC (hình 1.2) [22].

Các nghiên cứu đã cho thấy HDAC1 ức chế các yếu tố tăng trưởng TGF-β1
(transforming growth factor-β1), do đó ức chế HDAC1 dẫn đến sự chết tế bào theo
chương trình. Ngược lạ i, sự biểu hiệ n quá mức HDAC1 lại kích thích sự nhân lên
!


4
của tế bào. HDAC2 đóng vai trò như yếu tố điều hoà âm tính với TGF-β1. Loại bỏ
HDAC1 và HDAC2 làm kích thích sự chết tế bào theo chương trình, khởi đầu với
quá trình hyperacetyl hoá p53. Sự phân huỷ HDAC3 và HDAC4 phụ thuộc caspase,
sự phân huỷ HDAC4 tạo ra các mảnh protein, các mảnh này kích thích sự giải
phóng cytochrom c và gây ra sự chết tế bào theo chương trình [22].

Hình 1.2: Vai trò điều khiển sự chết tế bào theo chương trình
của các chất ức chế HDAC
Ghi chú: : : Hoạt hoá quá trình
: Ức chế quá trình
TRAIL: các yếu tố tăng trưởng kích động sự gắn của các thụ thể chết xuyên màng; FADD: vùng
kết cấu protein (liên quan đến sự chết của tế bào) gắn với thụ quan Fas; TGF-β1: yếu tố tăng
trưởng-β1; Bcl-2 và Bcl-XL: các yếu tố ức chế sự chết tế bào theo chư ơ ng trình; Bid, Bax và Bad:
các yếu tố kích thích sự chết tế bào theo chươ ng trình; p53: protein ức chế khối u; các caspase:
các enzyme truyền tín hiệu; CAD: deoxyribonuclease được hoạt hoá bở i caspase; ICAD: chất ức
chế CAD.

Các chất ức chế HDAC nhắm vào đích là các yế u tố ức chế sự chết tế bào.
Các butyrat và TSA hoạt hoá caspase-3 và kích thích sự tăng lên của các protein
Bad - protein khởi đầu sự chết của tế bào ung thư. Một protein khởi đầu sự chết tế
bào khác, Bak, cũng được nhân lên bởi butyrat. TSA và butyrat còn làm giảm các
yếu tố ức chế sự chết tế bào như Bcl-2 [35].
!

5
1.1.3.3. Điều khiển chu trình tế bào
Nghiên cứu trên gen tế bào nấm men cho thấy các HDAC đóng vai trò là yếu
tố điều hoà gen có liên quan đến chu trình tế bào [5]. Ngoài cơ chế điều hoà gen,
các HDAC còn điều khiển chu trình tế bào theo nhiều cơ chế khác như tương tác
với các yếu tố điều hoà chu trình tế bào, dẫn đến sự ngừng chu trình tế bào ở một số
điểm (hình 1.3) [19]. Ví dụ, sự giảm HDAC1 gây ngừng chu trình tế bào ở điểm
giới hạn G1/S hoặc điểm kiểm soát G2/M [36]. Trapoxin ức chế HDAC do đó gây
ngừng chu trình tế bào ở G1/S và G2/M [34].

Hình 1.3: Vai trò điều khiển chu trình tế bào của các chất ức chế HDAC
Điểm giới hạn G1/S và điểm kiểm soát G2/M là các điểm kiểm soát trong
chu trình tế bào, nhằm đảm bảo sự chính xác của quá trình phân bào. Nghiên cứu về
ảnh hưởng của các chất ức chế HDAC đối với điểm kiểm soát G2/M trong chu trình
tế bào bình thường và trên mộ t số dòng tế bào ung thư cho thấy các chất ức chế
HDAC kích thích sự kiểm tra tại G2 [19]. Cơ chế phân tử của quá trình này chưa
được biết rõ, nhưng có quan điểm cho rằng ở một số dòng tế bào, các chất ức chế
HDAC tác động đế n một (hoặc một vài) gen nhất định. Các gen này tác động kích
thích trực tiếp hoặc gián tiếp lên sự kiểm soát tại G2/M [19].
Các tế bào thường đi qua sự kiểm tra tại G2 trong chu trình tế bào mà không
bị tiêu diệt. Trong khi đó, ở các tế bào ung thư, sự sai hỏng ADN làm bất hoạt các
phức hợp chuyển từ G2 sang M, do đó chu trình tế bào bị ngừng ở G2 [9]. Các tế
bào ung thư có thể tiếp tục nhân đôi ADN, cuối cùng sẽ chết theo chương trình [19].
!


6
Ngoài ra, các chất ức chế HDAC còn tác động lên tế bào ung thư theo mộ t số

cơ chế khác như tác động lên sự hình thành mạch nuôi dưỡng tế bào ung thư, tác
động lên sự biệt hoá tế bào, sự di căn và đề kháng vớ i hoá trị liệu của tế bào ung
thư, tác động lên các chaperon (là các yếu tố giúp protein gập xoắn để hình thành
cấu trúc bậc cao) [22].
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 4 nhóm dựa trên cấu trúc hoá
học: acid hydroxamic, acid carboxylic, benzamid, peptid vòng (hình 1.4) [20]. Một
số tác giả chia các chất ức chế HDAC thành 6 nhóm: acid hydroxamic, acid
carboxylic, các benzamid, peptid vòng, epoxid (VD trapoxin A), phân tử lai
(hybrid) [13,44].
Trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được
tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC. Sau đó, SAHA (vorinostat) với cấu trúc tương
tự TSA là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA phê duyệt cho điều trị u da tế bào
lympho T (CTCL) [10]. Tuy nhiên, TSA và vorinostat đều là các chất ức chế
HDAC chưa chọn lọc [20].
Các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất, bao gồm depsipeptid,
apicidin, các peptid chứa nhóm hydroxamic. Depsipeptid được FDA phê duyệt cho
điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) vào tháng 11 năm 2009. Depsipeptid là tiền
thuốc, được chuyển hoá trong tế bào thành dạng chứa nhóm sulfhydryl hoạt động,
có khả năng tương tác với ion Zn
2+
tại trung tâm hoạt động của các HDAC nhóm I,
đặc biệt HDAC1 và HDAC2 [13].
Các acid carboxylic, bao gồm các acid butyric, phenylbutyric, acid valproic,
là các chất ức chế HDAC tương đối yếu (có tác dụng ở nồng độ mM) [20].
MS-275 là dẫn xuất benzamid tổng hợp, có tác dụng ứ c chế HDAC1,
HDAC2 và HDAC3 ở nồng độ µM. MGCD0103 là benzamid thể hiện tác dụng ức
chế chọn lọc lên các enzym HDAC nhóm I và IV, không tác dụng lên các enzym
HDAC nhóm II [40].

!


7
N
H
N
H
OH
O
O
N
H
OH
O O
N
N
O N
H
NH
NH
2
O
O
N N
N
N
H
N
H

O
NH
2
SAHA
Trichostatin A
MS-275
MGCD0103
Acid hydroxamic Benzamid
NH
O
NHO
HN
NH
O
S
S
O
O
O
OH
O
O
-
Na
+
O
Natri phenylbutyrat
Acid valproic
Peptid vòng
Acid carboxylic

Depsipeptid (FK228, romidepsin)
Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc các chất ức chế HDAC thường gồm 3 phần chính (hình 1.5) [26]:
- Nhóm khóa hoạt động (cap group) hay nhóm nhận diện bề mặt (SRG): là
các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề
mặt amino acid [26].
- Vùng cầu nối (linker): thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocacbon
thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết
Van der Waals với kênh enzym [26].
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid
hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton Nhóm
kết thúc gắn với kẽm tham gia tạo tương tác với ion Zn
2+
tại trung tâm hoạt động
của các HDAC [26].
!


8

Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Như vậy, các phần trong cấu trúc củ a các chất ức chế HDAC đều tham gia
vào quá trình hình thành liên kết với enzym và phát huy tác dụng.
1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
1.2.3.1. Ảnh hưởng của nhóm khoá hoạt động
Ảnh hưởng của cấu trúc không gian
Các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mag vòng lớn (ví dụ azumamid E,
depsipeptid và apicidin) cho tác dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I.
O

N
O
NH
O
HNN
O
O
O
HN
NH
NH HN
HN
O
O
O
O
OH
O
Apicidin Azumamid E
Hình 1.6: Cấu trúc apicidin và azumamid E
Tác dụng chọn lọc củ a các cyclopeptid thiên nhiên đã được Micco S.D. và
cộng sự nghiên cứu và giải thích như sau: các hợp chất trên mang vòng lớn
(cyclopeptid, với vai trò là nhóm khoá hoạt động) (hình 1.6) [26], do đó yêu cầu
một khoảng không gian trong enzym để tạo tương tác. Các HDAC nhóm I đáp ứng
điều kiện này do có chứa một túi ở bề mặt với đường kính 11 Å, vì vậy phù hợp để
các hợp chất vòng lớn có thể vào đây và tạo các tương tác Van der Waals, tương tác
!


9

hydro. Các tương tác này làm cho liên kết giữa các chất ức chế HDAC và enzym
khá bền vững [26].
Ở các HDAC nhóm II, tại bề mặt enzym có các phân tử cồng kềnh, do đó
khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn khác [26].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của cầu nối
- Ảnh hưởng của mạch thẳng và vòng thơm
Năm 2013, nghiên cứu được công bố bởi Micco S.D. và cộng sự cho thấy
trong kênh enzym của HDAC có hai nhóm phenylalanin, hai nhóm này tham gia
vào quá trình acetyl hoá lysin của histon. Nhóm tác giả sau đó đã nghiên cứu
docking nhiều hợp chấ t có cầu nối mạch thẳng và cầu nối vòng thơm đ ể xác định
cấu trúc cầu nối phù hợ p tạo tương tác với hai nhóm phenylalanin trong HDAC. Kết
quả cho thấy các chất ức chế HDAC có cầu nối vòng thơm cho ái lực mạnh với
đích, do vòng thơm đã tạo liên kết π-π với hai gốc phenylalanin (hình 1.7) [26].
N
NHOH
O
O
F
1


Hình 1.7: Tương tác giữa HDAC4 và một hợp chất có cầu nối mạch vòng trong
nghiên cứu của Micco S.D. và cộng sự
Ghi chú: Protein được biểu diễn bởi các dải. Mạch của các acid amin His158, His159 and Tyr170
(màu xanh nhạt) và 1 (trắng) được biểu diễn bởi các đư ờng ống. Màu của các nguyên tử: H màu
trắng, N xanh lam đậm, O đỏ, F xanh lục.

- Ảnh hưởng của chiều dài cầu nối và nhóm thế
Một số nghiên cứu đã cho thấy chiều dài cầu nối đóng vai trò quan trọng
trong tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC [11,18]. Chiều dài cầu

nối phù hợ p sẽ đưa được nhóm kế t thúc đến gắn với Zn
2+
và giúp nhóm khoá hoạt
động ở vị trí phù hợ p để tạ o liên kết với các acid amin bề mặt. Đối với đa số HDAC
nhóm I, chiều dài cầ u nối phù hợp để tạo tác dụng chọn lọc là 6 carbon. Riêng với
chất ức chế chọn lọc HDAC6, cầu nối thường dài hơn 6 carbon [26].
!


10
Tuy nhiên, chiều dài cầu nối thích hợp để tạo tác dụng ức chế chọn lọc còn
phụ thuộc vào các nhóm thế. Năm 2007, Hanessian S. và cộng sự đã nghiên cứu khả
năng ức chế HDAC2 và hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào
ung thư ở người (NB4, H460 và HCT-116) của các dẫn xuất ω-alkoxy có cấu trúc
tương tự SAHA với mạch 7 carbon (n=4), 8 carbon (n=5), 9 carbon (n=6). Kết quả
nghiên cứu cho thấy (bảng 1.1) [16]:
Bảng 1.1: Cấu trúc và hoạt tính của các dẫn xuất SAHA ω-alkoxy
trong nghiên cứu của Hanessian S. và cộng sự
N
N
H
OH
O
O
ORH
( )
n
n = 4, 5, 6
2-4

R
n
Hợp
chất
Ức chế HDAC2
IC
50
1*
(µM)
Độc tính tế bào
IC
50
2*

(µM)
0,5-0,1
≥0,05
NB4
H460
HCT-116
SAHA
-
+
0,70
3,40
1,20
-H
4
2a
-

-



5
3a
+
-
0,34
0,46
1,09
6
4a
-
-



-Me
4
2b
+
-
3,50
5,70
5,00
5
3b
+
-

0,52
1,20
0,88
6
4b
-
-



-CH
2
=CHCH
2

4
2c
-
-



5
3c
+
-
0,45
1,79
0,99
6

4c
-
+
0,62
1,80
0,95
4-MeOC
6
H
4
CH
2

4
2d
-
-



5
3d
-
+
0,12
0,52
0,22
6
4d
-

-



-CH
3
CH
2
CH
2

4
2e
+
-
4,10
10,40
8,50
-C
6
H
5
CH
2

4
3f
+
-
>5

5,50
2,40
3,5-(MeO)
2
C
6
H
3
CH
2

5
4j
-
+
0,05
0,45
0,30
Ghi chú: *: Các kết quả là trung bình của ít nhất 3 lần đo;
1
Nồng độ ức chế 50% hoạt động
deacetyl hoá của HDAC2;
2
Nồng độ gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào.

- Các dẫn xuất mạ ch nhánh 7 carbon: 2b, 2e-f có tác dụng ức chế HDAC2
trung bình nhưng hoạt tính kháng tế bào ung thư kém.
!

11
- Các dẫn xuất mạch nhánh 8 carbon: cho tác dụng tốt nhất khi so sánh giữa
các chất có cùng nhóm thế R, chỉ khác về độ dài mạch carbon.
Trong các dẫn xuất mạch nhánh 8 carbon, các dẫn xuất benzyloxy 3d, 3j ức
chế HDAC2 tương tự SAHA, nhưng hoạt tính kháng tế bào ung thư rất mạnh.
- Các dẫ n xuất mạch nhánh 9 carbon: 4a-b, 4d bị mất tác dụng ức chế
HDAC2 ở nồng độ dưới 0,1 µM, trừ dẫn chất mạch nhánh 9 carbon ω-O-allyl 4c
cho tác dụng ức chế HDAC2 và hoạt tính kháng tế bào ung thư tương tự SAHA.
1.2.3.3. Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn với kẽm (ZBG)
- Cấu trúc của ZBG
Năm 2005, Vanommeslaeghe K. và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc của
vùng chứa ion Zn
2+
trong HDAC, thấy rằng vùng này chứa 1 gốc Tyr và 2 nhóm
His-Asp. Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong
phân tử chất ức chế HDAC gồm 5 phần (hình 1.8) [43]:
O
H
A
B C
L
D
H
H
N
N
H
O
O
N

N
H O
O
Zn
2+
Tyr297
Asp173
His132
Asp166
His131

Hình 1.8: Mô hình ZBG theo nghiên cứu của Vanommeslaeghe K. và cộng sự
+ Phần A: mang đôi electron không liên kết, có khả năng tạo liên kết hydro
với H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn
2+
. Tuy
nhiên A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của
tyrosin tạo liên kết hydro)
+ Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết.
+ Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132.
+ Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131
và liên kết chelat mạnh với Zn
2+
.
!


12
+ Phần L: vùng cầu nối.
Từ cấu trúc này có thể lý giải tác dụng ức chế HDAC mạnh của các dẫn chất

hydroxamic [43].
- Ảnh hưởng của ZBG tới tính chọn lọc của chất ức chế HDAC
Cấu trúc ZBG có tác động tới tính chọn lọc của chất ức chế. Một số nghiên
cứu cho thấy các chất ức chế HDAC có ZBG là nhóm 2-amino benzamid có tác
dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I, đặc biệt HDAC1 và HDAC2 [25,33]. Nhóm
amino của benzamid liên kết với Zn
2+
trong trung tâm hoạt động của enzym. Tuy
nhiên, khác với các ZBG khác (acid hydroxamic, acid carboxylic, ), để nhóm
amino benzamid có thể liên kết với Zn
2+
cần có một khoảng không gian trong kênh
enzym để chứa vòng phenyl. Các HDAC nhóm I đáp ứng được điều kiện này do ở
đáy của kênh enzym 11 Å có một túi rỗng kích thước 14 Å [26].
Ngoài ra, trong kênh 11 Å của các HDAC nhóm I có chứa nhóm CO của
glycyl và tyrosyl: Glyl 49 và Tyr 303 của HDAC1, Gly 154 và Tyr 308 của
HDAC2, Gly 143 và Tyr 298 của HDAC3, Gly 151 và Tyr 306 của HDAC8. Đây là
các nhóm có thể tạo liên kết hydro. Mặt khác, kênh của các enzym HDAC nhóm II
không chứa chất cho và nhận để tạo liên kết hydro. Do đó, các chất ức chế chọn lọc
HDAC nhóm I thường chứa liên kết amid giữa cầu nố i và ZBG (-NH của amid có
thể tạo liên kết hydro với nhóm CO của glycin) [26].
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Thay đổi nhóm khoá hoạt động
Nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm khoá hoạt động có vai trò quan trọng đối
với tác dụng chọn lọc của chất ức chế HDAC [26,42]. Do đó, việc thay đổi nhóm
khoá hoạt động có thể cải thiện tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC [38].
Năm 2013, Feng T. và cộng sự đã nghiên cứu các chất ức chế HDAC dẫn
xuất N-hydroxyfurylacrylamid có mạch nhánh ở nhóm khoá hoạt động (hình 1.9)
[12]. Các hợp chất này được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên

các dòng tế bào PC-3, HCT116, A549, HepG2 và khả năng ức chế chọn lọc các
!


13
enzym HDAC1, HDAC4, HDAC6. Kết quả nghiên cứu cho thấy 5a, 5b, 5c, 5d cho
tác dụng chọn lọc tốt nhất với HDAC6. Bên cạnh đó, khả năng ức chế HDAC1 (của
hợp chất 5a, 5b, 5c) cũng không hoàn toàn biến mất. Qua nghiên cứu docking hợp
chất 5b, các tác giả giải thích 5b có sự ức chế chọn lọc HDAC6 là do mạch nhánh
cồng kềnh ở nhóm khoá hoạt động có kích thước đủ lớn vừa khít với rãnh trên bề
mặt HDAC6, nhưng không khít với rãnh trên bề mặt HDAC1 và HDAC4 [12].

O
N
R
1
N
H
OH
R
O
5a, R = -CH
2
CH
3
, R
1
= -CH
2
-C

6
H
5
5b, R = -CH
2
CH
2
CH
3
, R
1
= -CH
2
-C
6
H
5
5c, R = -CH
2
CH
2
CH
2
CH
3
, R
1
= -CH
2
-C

6
H
5
5d, R = -CH
2
CH
3
, R
1
=
O
O
-CH
2
5

Hình 1.9: Cấu trúc các chất trong nghiên cứu của Feng T. và cộng sự
1.3.2. Thay đổi cầu nối
- Thay đổi nhóm thế
Các nghiên cứu gắn thêm nhóm thế vào mạch carbon trong cầu nối của
SAHA đã tạo ra các hợp chất có tính chọn lọc tốt trên HDAC [8,6]. Năm 2013,
Taddei M. và cộng sự đã tổng hợp các hợp chất 6 có nhóm thế amido lactam ở vị trí
C7 của SAHA (hình 1.10) [39]. Các hợp chất tổng hợp được cho hoạt tính ức chế
mạnh với HDAC và độc tính mạnh trên các dòng tế bào ung thư. Thử nghiệm cho
thấy vòng amid trên cầu nối (gần vị trí nhóm khoá hoạt động) đóng vai trò quan
trọng trong sự gắn kết chất ức chế với enzym [39].
N
H
N
H

OH
O
OHN
NH
O
O
n
6

Hình 1.10: Cấu trúc cơ bản của các hợp chất tương tự SAHA có nhóm thế tại C7
trong nghiên cứu của Taddei M. và cộng sự
- Thay đổi mạch thẳng/ vòng
Nghiên cứu cấu trúc HDAC cho thấy trung tâm hoạ t động của HDAC1 có
kích thước bé hơn trung tâm hoạt động của HDAC6 [4]. Vì vậy, Lee J.H. và cộng
!


14
sự đã nghiên cứu hoạt tính củ a các hợp chất thay đổi cầu nối mạch thẳng (SAHA)
thành cầu nối có cấu trúc cồng kềnh hơn về không gian nhằm tổ ng hợp các chất ức
chế chọn lọc HDAC6. Kết quả cho thấy hợp chất N-hydroxy-4-(2-[(2-
hydroxyethyl)(phenyl)amino]-2-oxoethyl)benzamid (HPOB) 7 cho hoạt tính ức chế
chọn lọc HDAC6 in vitro và in vivo (hình 1.11) [21].
N
N
H
OH
O
O
HO

7 (HPOB)

Hình 1.11: Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự
1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC
N
S
N
H
NHOH
R
O
O
8a, R = -H
8b, R = -CH
3
8c, R = - OCH
3
8d, R = -OC
2
H
5
S
N
N
N
H
NHOH
OO
[ ]
4

R
9a, R = -H
9b, R = 2-Cl
9c, R = 3-Cl
9d, R = 4-Cl
9e, R = 4-F
9f, R = 4-Br
9g, R = 2-NO
2
9h, R = 4-NO
2
8e, R = -SO
2
CH
3
8f, R = -NO
2
8g, R = -Cl
8h, R = -CF
3
9i, R = 2,6-Cl
2
9j, R = 4-CH
3
9k, R = 4-OCH
3
9l, R = 4-N(CH
3
)
2

9m, R = 3,4-CH
2
OCH
2
-
9n, R = 2,3,4-(OCH
3
)
3
9o, R = 3,4,5-(OCH
3
)
3
N
O
N
NHOH
OH
O
R
10a, R = -H
10b, R = 5-F
10c, R = 5-Cl
10d, R = 5-Br
10e, R = 5-NO
2
10f, R = 5-CH
3
10g, R = 7-Cl
N

O
N
NHOH
OCH
3
O
R
11a, R = -H
11b, R = 5-F
11c, R = 5-Cl
11d, R = 5-Br
11e, R = 5-NO
2
11f, R = 5-CH
3
11g, R = 7-Cl
8
9
10
11
Hình 1.12: Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu và công bố
!


15
Cùng với xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa
Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác
dụng sinh học của một số acid hydroxamic mới hướng ức chế histon deacetylase
dựa trên cấu trúc của SAHA (hình 1.12) [1,2,27,28,29,30,31,41].
Kết quả cho thấy nhiều chất tổng hợp được có tác dụng rất tốt khi thử khả

năng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư
(bảng 1.2). Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng dị vòng làm nhóm khoá
hoạt động và heptanamid làm cầu nối (thay thế phenyl và dioctanamid trong cấu
trúc SAHA) đem lại kết quả rất khả quan.
Bảng 1.2: Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic
được thiết kế, tổng hợp trong nước
Hợp
chất
R
Tác dụng
ức chế
HDAC
1

Độc tính tế bào IC
50
2
(µM)/ dòng tế bào
SW620
MCF-7
PC3
AsPC-1
NCI-
H460
SAHA
+
3

3,70
6,42

4,31
3,66
2,77
8g
Cl
+
3

0,90
4,10
2,32
0,96
1,10
9b
2-Cl
+
4

0,34
1,23
0,42
0,63
0,11
10b
5-F
+
3

0,11
1,55

2,73
1,72
1,50
11g
7-Cl
+
3

0,26
0,34
0,29
0,63
0,35
Ghi chú:
1
Tác dụng ức chế HDAC là (+) khi hiện tượng deacetyl hóa không xảy ra (hoạt tính của
enzym bị ức chế hoàn toàn);
2
Nồng độ gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình
ba kết quả với độ lệch dưới 10%;
3
Hoạt tính của enzym bị ức chế hoàn toàn khi thử ở nồng độ 1
µ
g/ml
bằng phương pháp Western blot;
4
Hoạt tính của enzym bị ức chế hoàn toàn khi thử ở nồng độ 10
µ
g/ml
bằng phương pháp Western blot

Các kết quả trên đây đã tạo nền tảng cho khoá luận phát triển hướng nghiên
cứu bằng việc giữ nguyên cấu trúc cầu nối heptanamid nhưng phát triển nhóm khoá
hoạt động (thay thế khung 3-oxim-isatin và 3-methoxim-isatin bằ ng khung 3-
spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin). Kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong các
chương tiếp theo của khóa luận.

!


16
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
- Các isatin:
+ Isatin
+ 5-Fluoroisatin
+ 5-Cloroisatin
+ 7-Cloroisatin
- Acid p-toluensulfonic
- Ethyl 7-bromoheptanoat
- Ethylen glycol
- Hydroxylamin hydroclorid
- Sắt (III) clorid
Các hóa chấ t và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF),
dicloromethan (DCM), methanol, aceton, ethyl acetat, toluen, natri hydroxyd, natri

sulfat khan, kali carbonat, acid hydrocloric, nước muối bão hoà, nước cất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn
hồi lưu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-210.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.
- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm.
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy Melting point Apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Impact 400 để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap để ghi phổ MS.
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học