Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cao chiết từ lá cây phèn đen phyllanthus reticulatus poir thu hái tại bắc giang

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HOÀNG THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY PHÈN ĐEN
Phyllanthus reticulatus Poir.
THU HÁI TẠI BẮC GIANG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


HOÀNG THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY PHÈN ĐEN
Phyllanthus reticulatus Poir.

THU HÁI TẠI BẮC GIANG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Thái Hà Văn
2. PGS. TS. Phùng Hòa Bình
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS. Phùng Hòa Bình, người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết
chỉ bảo tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Thái Hà Văn đã nhiệt tình
hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật
viên của bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh
chị nhân viên phòng Dược lý – sinh hóa – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện
giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Xin gửi lời cảm ơn đến cô Lê Thanh Bình (Bộ môn Dược liệu – ĐH
Dược Hà Nội), thầy Nguyễn Văn Hải (Bộ môn Công nghiệp Dược – ĐH
Dược Hà Nội) đã chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè –
những người đã luôn gắn bó, ủng hộ và khích lệ tôi trong trong suốt quá trình
học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Hoàng Thị Mỹ Linh.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALP : Alkaline phosphatase
ALT : Glutamat pyruvat transaminase.
AST : Glutamat oxaloacetat transaminase.
EtOAc : Ethyl acetat
HDL : Lipoprotein tỷ trọng cao (High density lipoprotein)
IC
50
: Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Half maximal inhibitory
concentration)
LDL : Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low density lipoprotein)
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
UV : Tử ngoại (Ultra violet)
VLDL : Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (Very low density lipoprotein).


DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Thành phần hóa học trong các bộ phận rễ, thân cành, vỏ thân
7
3.1

Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất trong cao lá Phèn đen
24
3.2
Giá trị R
f
của các vết dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn
ethyl acetat.
26
3.3
Ảnh hưởng của cao chiết lên hoạt độ ALT trong huyết thanh
chuột bị gây độc bằng paracetamol
29
3.4
Ảnh hưởng của mẫu cao dược liệu lên hoạt độ AST trong huyết
thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol
30
3.5
Hàm lượng glucose huyết thanh và tỷ lệ (%) ức chế so với lô
chứng bệnh lý
31
3.6
Hiệu lực tác dụng trên nồng độ ALT huyết thanh của Phèn đen
Phyllanthus reticulatus và Phyllanthus emblica, Phyllanthus
niruri, Phyllanthus acidus, Phyllanthus polyphyllus
34
3.7
Tác dụng hạ đường huyết của cao lá cây Phèn đen và các vị
thuốc khác
35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỔ THỊ
Hình
Tên hình ảnh
Trang
1.1
Công thức cấu tạo của một số flavanoid trong lá
3
1.2
Công thức cấu tạo của một số tanin
4
1.3
Công thức cấu tạo của triterpen trong lá Phèn đen
4
1.4
Công thức cấu tạo của một số sterol trong lá
5
1.5
Công thức cấu tạo của các hợp chất khác
6
2.1
Cây Phèn đen
14
2.2
Lá Phèn đen (khô)
14
3.1
Quy trình bào chế cao dược liệu nghiên cứu
19

3.2
Sắc ký đồ của dịch chiết nước và dịch ethyl acetat ở
hệ Toluen : ethyl acetat : acid formic (6 : 2 : 1 )
26
3.3
Chất HL65 thu được
27
3.4
Sắc ký đồ chất HL65 quan sát tại UV 254nm
28
3.5
Sắc ký đồ chất HL65 quan sát ở ánh sáng thường sau khi hiện màu
bằng hơi amoniac
28
3.6
Tinh thể chất HL65 khi soi ở vật kính 10
28




MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Thành phần hóa học 2
1.1.1. Thành phần hóa học của lá 2
1.1.2. Thành phần hóa học của các bộ phận khác 7

1.2. TÁC DỤNG SINH HỌC 10
1.2.1. Tác dụng hạ glucose máu 10
1.2.2. Tác dụng bảo vệ gan 10
1.2.3. Tác dụng khác 11
1.2.4. Độc tính 12
1.3. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỂN VÀ DÂN GIAN 13
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 14
2.1.1. Nguyên liệu 14
2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 14
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.2.1. Bào chế cao 15
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 16
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học trên động vật 17
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. BÀO CHẾ CAO 19
3.2. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 19
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học 20
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 25
3.2.3. Phân lập 27
3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 29
3.3.1. Tác dụng bảo vệ gan 29


3.3.2. Tác dụng trên glucose huyết 30
BÀN LUẬN 33
KẾT LUẬN 36
ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở Việt Nam, Phèn đen là loại cây mọc hoang dã ở nhiều vùng địa lý khác
nhau, điều kiện sinh thái khác nhau với sức sống mãnh liệt. Nhân dân đã sử
dụng Phèn đen để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau như: viêm nhiễm đường
tiêu hóa (ỉa chảy, lỵ, viêm ruột), viêm tiết niệu cấp, vàng da, ứ huyết tụ huyết
do chấn thương [5].
Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện nhiều tác dụng quý của
Phèn đen: hạ đường huyết [30], [39], bảo vệ gan [14], [46], giảm mỡ máu
[35], kháng khuẩn [10], [44], [45], chống viêm [27], [31], [41], … đặc biệt là
tác dụng ức chế virus viêm gan B [15].
Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) cùng chi với cây Diệp hạ
châu đắng (Phyllanthus amarus). Các nghiên cứu cho thấy hai cây này có các
tác dụng tương tự nhau [10], [14], [15], [24], [27],[35].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu cây Phèn đen ở giai đoạn đầu, chủ yếu về
thành phần hóa học, chưa có nghiên cứu xác định giá trị trong y học. Vì thế,
chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số
tác dụng sinh học của cao chiết từ lá cây Phèn đen (Phyllanthus
reticulatus) thu hái tại Bắc Giang” với 2 mục tiêu:
- Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết từ lá cây Phèn đen.
- Nghiên cứu một số tác dụng sinh học trên động vật thực nghiệm của cao
lá Phèn đen.






2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir. thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae, bộ
phận dùng gồm có lá, rễ và vỏ thân [5].
1.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
1.1. 1. Thành phần hóa học của lá
Thành phần hóa học trong lá của Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) gồm
các nhóm chất: flavonoid, tanin, triterpenoid, sterol và các hợp chất khác.
1.1.1.1. Flavonoid
Kết quả của một số nghiên cứu đã cho thấy sự có mặt của các flavanoid trong lá
Phèn đen:
- Flavonol: Phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết ethanol có chứa kaempferol
[6].
- Flavonol glycosid: Có 5 flavonoid glycosid trong các phân đoạn của dịch
chiết methanol: isoquercitrin (quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid); quercitrin
(quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid); astragalin (kaempferol 3-O-β –D
glucopyranosid) [5], [17]; kaempferol - 3-rutinosid (kaempferol-3-O-α-L-
rhamnopyranosyl-(6→1)-β-D-glucopyranosid) [17], rutin (quercetin - 3-O-
rutinosid) [5], [16], [17] (hàm lượng 2.503 % [16]).
Rutin và astragalin là các flavonoid chiếm chủ yếu trong phân đoạn ethyl acetat
[6].






3

Isoquercitrin Quercitrin


Rutin Astragalin

Kaempferol-3-rutinosid
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số flavanoid trong lá
1.1.1.2. Tanin
Tanin trong lá gồm 2 nhóm: tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ.
- Tanin thủy phân được: Dịch chiết methanol có corilagin [17].
- Tanin ngưng tụ: Methyl este của acid geraniinic ((5R*,6R*)-4,6-
dimethoxycarbonyl-5-[2′ ,3′ ,4′ -trihydroxy-6′-(methoxycarbonyl) phenyl]-5,6-
dihydro- 2H-pyran-2-on) được phân lập từ dịch chiết methanol [38].

4



Corilagin



Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số tanin
1.1.1.3. Triterpenoid
Kết quả của nghiên cứu dịch chiết dầu hỏa của lá thấy có: friedelin [10], [16];
golchidonol [16], [20]; friedelan-3β-ol [16].
Trong dịch chiết methanol có lupeol, lupeol acetat [21].

Friedelin Friedelan-3β-ol Golchidonol

Lupeol Lupeol acetat
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của triterpenoid trong lá Phèn đen


(5R*, 6R*)-4,6-Dimethoxycarbonyl-5 [2′ ,3′ , 4′-
trihydroxy-6′-(methoxycarbonyl) phenyl]-5,6
dihydro-2H-pyran-2-on
5


1.1.1.4. Sterol
Lá Phèn đen có các sterol: β-sitosterol và β-sitosterol-3-O-β-glucosid [17] ;
stigmasterol [23], [28] và stigmasterol-3-O-β-glucosid [17]; stigmast-22-en-3-ol và
stigmast-5-en-3-ol [22].



β-sitosterol Stigmasterol

β-Sitosterol-3-O-β-glucosid

Stigmasterol-3-O-β-glucosid


Stigmast-22-en-3-ol Stigmast-5-en-3-ol
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của một số sterol trong lá
6

1.1.1.5. Các hợp chất khác
Trong dịch chiết lá có các hợp chất: acid ellagic [17]; acid 2,7-Di-O-
methylellagic [17]; methyl brevifolincarboxylat [17], acid 3,3',4-tri-O-methylellagic
[38], methyl gallat [17], acid gallic [48] và acid p-coumaric [36].


Acid ellagic Acid 2,7-Di-O-methylellagic


Methyl brevifolincarboxylat Acid 3,3',4-tri-O-methylellagic



Methyl gallat Acid gallic Acid p-coumaric

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của các hợp chất khác


7


1.1.2. Thành phần hóa học của các bộ phận khác
Nghiên cứu trên các bộ phận khác (rễ, vỏ thân, thân) cho thấy sự có mặt của các
nhóm chất: triterpenoid, flavanoid, sterol, ankanol.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong các bộ phận rễ, thân cành, vỏ thân
Nhóm chất
Tên chất
Bộ
phận

Công thức hóa học
Tài liệu
Triterpenoid
Friedelin
Rễ
Thân
cành

[21],
[25]
Epi-
friedelinol
Rễ

[21],
[25]
Fridelan-3β-
ol
Thân
cành

[13]
21-α-
hydroxy
friedelan-3-
on
Rễ
Thân
cành
Vỏ

thân

[25]
[13]
[21]
Betulin
Rễ

[25]
8


Acid
betulinic
Thân
cành


[18]
Glochidonol
Thân
cành



[42]

Olean-12-en-
3β,15α-diol

20-O-acetyl-
lup-1-en-3-
on

lup-20(29)-
en-3β,24-
diol
Vỏ
thân

[20]
Taraxerol
Rễ

[25]
9


Taraxerol
acetat

Taraxeron

Sorghumol
Rễ

[21]
Sorghumol
acetat

Kokoonol

Sterol
β-Sitosterol
Rễ

Thân
cành

[25]

[18]
10


Daucosterol
Vỏ
thân

[20]
Flavanoid
Tricin
Rễ

[21]
Alkanol
Octacosan-1-
ol
Rễ

[25]
Teracosan-1-
ol
Rễ

[21]
Tricosan-1-
ol


1.2. TÁC DỤNG SINH HỌC
1.2.1. Tác dụng hạ glucose máu
Cắn chiết ether dầu hỏa và ethanol của lá có tác dụng trong điều trị đái tháo
đường. Liều tương đương 18 g dược liệu/ kg chuột nhắt trắng có tác dụng giảm
đường huyết rõ rệt ( giảm khoảng 40 %) [30].
Tác dụng hạ đường huyết phụ thuộc liều dùng. Cắn của dịch chiết methanol của
lá, liều 100 mg/kg chuột nhắt trắng gây giảm đường huyết 18.4 %. Liều 400 mg/kg,
sự giảm nồng độ glucose máu đạt mức cao nhất là 35,0% [39].
1.2.2. Tác dụng bảo vệ gan
Cắn chiết ethanol của các bộ phận trên mặt đất có tác dụng chống lại sự tổn
thương gan gây ra bởi CCl
4
trên chuột cống
.
Hoạt tính bảo vệ gan được thể hiện ở
sự giảm rõ ràng nồng độ ALT, AST và ALP huyết thanh [14].
11


Cắn chiết ethanol rễ Phèn đen trong chống nhiễm độc gan do paracetamol trên

chuột cống. Liều uông 300 mg/kg chuột cống có tác dụng giảm rõ rệt nồng độ
ALT, AST và ALP huyết thanh (p<0.05) [46].
1.2.3. Tác dụng khác
1.2.3.1. Tác dụng giảm đau
 Tác dụng giảm đau ngoại vi
Cắn chiết ethyl acetat của các bộ phận trên mặt đất tác dụng giảm đau 51.23 %
và 65.12 % tương ứng với liều khoảng 15 g và 30 g dược liệu/kg chuột cống [41].
 Tác dụng giảm đau trung ương
Cắn chiết methanol của lá Phèn đen có tác dụng giảm đau theo cơ chế thần kinh
trung ương trên chuột nhắt trắng. Liều tương đương khoảng 30 g dược liệu/kg, thời
gian phản ứng lại của chuột trong nhóm uống dịch chiết methanol khoảng 6.2-6.7
giây (60.49%); trong khi ở nhóm tiêm morphin 2 mg/kg dưới da là 5.82 giây (96.7
%) (p< 0.01) [27].
1.2.3.2. Tác dụng chống viêm
Phyllanthus reticulatus có tác dụng chống viêm trên chuột được gây phù bằng
carragenin [27], [31], [41]. Liều 300 mg/kg phân đoạn ethyl acetat, tương đương với
30 g lá/kg thể trọng có tác dụng giảm viêm 60.49 % trên chuột cống [41].
1.2.3.3. Tác dụng trên cholesterol máu
Cắn chiết nước phần trên mặt đất của Phyllanthus reticulatus đã được chứng
minh là có tác dụng hạ cholesterol máu. Tại liều 250 mg/kg và 500 mg/kg tương
đương với 1.6 g và 3.2 g dược liệu đều có tác dụng hạ tổng lượng cholesterol,
VLDL-cholesterol, triglycerid (TG), LDL-cholesterol; trong khi đó làm tăng nồng
độ HDL-cholesterol (p<0.05) [35].
1.2.3.4. Tác dụng kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa [10],
[44], [45]. Cắn chiết ethanol, cloroform, ether của lá có tác dụng chống lại vi khuẩn
gram dương (Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa,
Shigella sonnei) và vi khuẩn gram âm (Sarcina lute, Bacillus megaterium,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus-β-
haemolytica). Trong đó cắn chiết ethanol có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều chủng vi

khuẩn, đặc biệt là chủng S. aureus – vi khuẩn kháng Methicillin và P. aeruginosa –
một loại vi khuẩn đa kháng. Vùng ức chế của Tetracyclin thấp hơn nhiều so với
vùng ức chế của cắn ethanol [10].
12


Cả 3 cắn chiết methanol, hexan, cloroform đều có tác dụng kháng khuẩn trên
chủng S. aureus, trong đó dịch methanol có tác dụng tốt nhất [44].
1.2.3.5. Tác dụng chống virus viêm gan B hoạt động
Cắn chiết ethanol của các bộ phận trên mặt đất. Tại nồng độ 20 mg / ml và 40
mg / ml cho thấy tác dụng kháng virus viêm gan B với kháng nguyên bề mặt (Anti-
HBsAg) trong thử nghiệm in vitro [15].
1.2.3.6. Tác dụng chống oxy hóa
Cắn chiết methanol và ethanol của toàn cây có hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả
của thử nghiệm in vitro cho thấy toàn cây có tác dụng chống oxy hóa lên tới 90% ở
nồng độ 400 mg/kg trong khi butylated hydroxyl toluene (BHT) chống oxy hóa
85% ở nồng độ 400μg /ml. Trong đó, cắn methanol có tac dụng chống oxy hóa tốt
hơn dịch chiết ethanol [34].
1.2.3.7. Tác dụng cầm máu
Đã áp dụng trên lâm sàng cao lỏng bào chế từ lá 4 dược liệu: lá cây phèn đen,
ngũ bội tử và xạ can để làm thuốc cầm máu dùng tại chỗ cho 100 ca cắt amidan.
Thuốc đã có tác dụng cầm máu nhanh khi chấm vào hốc amidan mới bóc tách ra
khỏi vị trí. Chỉ cần chấm bông thuốc hai lần là hốc amidan rất sạch, trong khi dùng
nước oxy phải mất 4-5 lần. Ở bề mặt mới bóc tách, tổ chức liên kết săn lại, ngả màu
sẫm khô ráo, không có chảy máu tái phát khi cắt [7].
1.2.3.8. Tác dụng cầm tiêu chảy
Mới đây, một nghiên cứu về tác dụng cầm tiêu chảy của cắn chiết methanol lá
Phèn đen đã được tiến hành. Chuột bị gây tiêu chảy theo hai phương pháp: dầu thầu
dầu và magie sulfat. Thuốc đối chiếu là Loperamid. Liều 200 mg/kg và 400 mg/kg
chuột cống đều cho hiệu quả có ý nghĩa (p<0.05) [46].

1.2.3.9. Tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Lá Phyllanthus reticulatus đã được thử in vitro có tác dụng chống ký sinh
trùng sốt rét Plasmodium falciparum với IC
50
≤ 10 microgam / ml [37].
1.2.4. Độc tính
Độc tính cấp tính của các chất chiết xuất ether, ethyl acetat, methanol được
nghiên cứu theo phương pháp mô tả bởi Ganapathy (2002). Thử nghiệm với liều
tăng dần từ 100mg /kg chuột nhắt trắng. Không phát hiện thấy có tác dụng phụ hoặc
tử vong ở chuột cho đến liều 2 g cắn methanol/kg (tương đương với 200g dược liệu)
trong thời gian 24 giờ sau khi chuột uống cắn chiết [39].

13


1.3. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỂN VÀ DÂN GIAN
Bộ phận dùng của Phèn đen: rễ, lá, vỏ thân [5].
Theo y học cổ truyền, rễ Phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm,
thu liễm, chỉ tả. Lá có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng [5].
Phèn đen được dùng làm thuốc cầm máu, làm lành vết thương, chữa đậu mùa và
tiểu tiện khó khăn, có mủ [7].
Rễ Phèn đen được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và
trẻ em cam tích. Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn
ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt; còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và
rắn cắn. Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn [5].
Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch lá làm viên với Long não và Màng tang để trị
lợi răng bị thương; dịch lá cũng đươc dùng trị ỉa chảy cho trẻ em [5].
Ở Malaysia, nhân dân dùng cành và lá phèn đen xát lên ngực để làm giảm hen,
dùng nước sắc lá trị viêm họng. Ở Phylippin, nước sắc lá hoặc vỏ thân là thuốc lợi
tiểu, hồi phục chức năng, lọc máu, làm mát, chữa đau răng, và lá giã đắp vào bụng

chữa giun kim. Nước hãm vỏ chữa lỵ và nước hãm rễ chữa hen. Ở các nước Lào,
Campuchia, phèn đen được dùng chữa đậu mùa và giang mai. Ở Nam Phi, lá phèn
đen khô tán bột rắc lên vết thương giúp mau lành. Ở Tây Phi, nước sắc phần trên
mặt đất cây phèn đen trị ngứa da. Ở Nepal, nhân dân dùng dịch ép của cây bôi trị
nhọt [7].














14


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Phèn đen được thu hái ở Tân Mỹ, T.p Bắc Giang, T. Bắc Giang vào tháng
11/2014. Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Phyllanthus reticulatus Poir., Họ Thầu
dầu (Euphorbiaceae) (Người giám định: ThS Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực
vật, Trường Đại học Dược Hà Nội). Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ

môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã tiêu bản: HNIP/18113/15 (Phụ
lục 3).
Xử lý mẫu: Lá được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín nơi khô
ráo (hình 2.2)





















Hình 2.2. Lá Phèn đen (khô)


Hình 2.1. Cây Phèn đen
15

2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
a. Hóa chất
- Các dung môi: Ethanol, Methanol, Chloroform, Toluen, Ethyl acetat, Nước…
đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Thuốc thử: Mayer, Fehling A&B,….
- Hóa chất khác: NaOH, HCl, H
2
SO
4
, KCl, acid tricloracetic, acid
thiobarbituric, HCl 0,1N chuẩn, acid acetic, n- butanol, CCl
4
,… đạt tiêu chuẩn tinh
khiết phân tích.
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck).
- Thuốc đối chiếu: Silymarin (Honymarin chứa 70 mg silymarin- Korea),
Glyclazid (Standa).
b. Thiết bị và máy móc
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ), cân kỹ thuật.
- Tủ sấy Memmert (Đức).
- Đèn tử ngoại Camag.
- Kính hiển vi Labomed.
- Thiết bị sắc thuốc Hàn Quốc – DWP 2000M.
- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Human Lyzer 2000.
- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU
- Máy nghiền đồng thể.
- Nồi inox 10L.
- Bếp hồng ngoại 2000W (Sanaky).

c. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuộc cả 2 giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm,
cung cấp bởi Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Bào chế cao
- Chiết nóng (phương pháp sắc): dung môi là nước.
- Cao dược liệu thu được bằng cách cô dịch chiết nước của lá Phèn đen ở áp
suất thường.




16


2.2.2. Nghiên cứu về hóa học
2.2.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
 Nguyên tắc:
Phản ứng định tính:
- Chọn phản ứng đặc trưng thường là phản ứng màu, phản ứng tạo tủa.
- Chọn thuốc thử đặc hiệu, nhạy, dễ phát hiện [2].
 Tiến hành:
Định tính xác định một số nhóm hợp chất phổ biến: alcaloid, glycosid tim,
flavanoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử,
polysaccharid, sterol, chất béo, caroten [1], [2], [3].
- Alcaloid: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat, Dragendorff, Mayer.
- Anthranoid: Phản ứng Borntraeger
- Glycosid tim: Phản ứng Liebermann- Budchardat, Legal, Baljet, Keller – Kiliani.
- Flavanoid: Phản ứng với dung dịch NaOH, amoniac, dd FeCl
3

5%, phản ứng
Cyanidin.
- Courmarin: Phản ứng mở đóng vòng lacton, quan sát huỳnh quang.
- Saponin: quan sát hiện tượng tạo bọt.
- Tanin: Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%, chì acetat 10%, gelatin 1%.
- Acid hữu cơ: Phản ứng với natri cacbonat.
- Acid amin: Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3%.
- Đường khử: Phản ứng với thuốc thử Fehling A & B.
- Polysaccharid: Phản ứng với dung dịch Lugol.
- Chất béo: Hiện tượng tạo vết mờ trên giấy lọc.
- Sterol: Phản ứng Liberman-Bouchardat.
- Caroten: Phản ứng với acid sulfuric đặc.
2.2.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Mẫu thử được chấm lên pha tĩnh là bản mỏng có tráng chất hấp phụ, sau đó pha
động (dung môi khai triển) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu
tử của mẫu thử với vận tốc khác nhau tạo thành sắc ký đồ với R
f
tương ứng (Dược
điển Việt Nam IV-phụ lục 5.4) [4].
Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254 (Merk) được hoạt hóa ở nhiệt độ 110
o
C trong 1 giờ.
17


Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để tách tốt nhất. Pha dung môi theo
đúng tỷ lệ, lót giấy lọc bên trong thành bình, cho hệ dung môi khai triển vào bình
triển khai sắc ký. Đậy kín, để yên. Bão hòa dung môi trong 30 phút.

Chấm sắc ký: Dịch chấm sắc ký được chuẩn bị sẵn, chấm với 1 thể tích phù hợp
(5-10 µL).
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký, đậy kín, để yên. Khi vết
dung môi cách mép trên khoảng 0.5 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu vạch dung
môi kết thúc, làm khô bản mỏng trong tủ hốt.
Phát hiện vết: Quan sát ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó dùng thuốc
thử hiện màu.
2.2.2.3. Phân lập
- Sử dụng SKLM phát hiện được vết rõ, đậm và lớn nhất xác định được vị trí
chất HL65 chiếm tỷ lệ lớn trong dịch chiết.
- Dùng SKLM điều chế để phân lập chất HL65 ra khỏi dịch chiết.
- Kiểm tra chất HL65 bằng SKLM.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học trên động vật
2.2.3.1. Tác dụng bảo vệ gan
Dùng paracetamol 220 mg/kg gây tổn thương gan ở chuột nhắt trắng (20 – 25 g)
ở cả 2 giống. Khi đủ liều gây độc, paracetamol gây rối loạn chức năng gan: tăng các
chỉ số ALT, AST, ALP và billirubin huyết tương [8].
Thuốc thử có tác dụng bảo vệ gan khi các chỉ số về chức năng gan giảm:
- Chỉ số quan sát: ALT, AST
- Đánh giá: So sánh lô thử thuốc với lô đối chứng. Các chỉ số ALT, AST giảm
với p < 0.05 thì thuốc thử được đánh giá là có tác dụng với độ tin cậy 95 %.
2.2.3.3. Tác dụng trên glucose huyết
Sử dụng mô hình gây tăng glucose huyết bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi chuột
nhắt trắng dung dịch alloxan [9] (pha trong nước muối sinh lý) với liều 65 mg/kg.
Chuột được uống thuốc thử.
- Chỉ số quan sát: hàm lượng glucose trong huyết tương chuột.
- Chỉ số đánh giá: So sánh hàm lượng glucose trong huyết tương lô chuột thử
thuốc với lô đối chứng. Hàm lượng glucose lô thử thuốc giảm so với lô chứng với p
< 0.05, thuốc được đánh giá là có hiệu quả giảm đường huyết với độ tin cậy 95 %.
2.2.3.4. Xử lý kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý