Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


VŨ NGÂN BÌNH



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN


KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ









HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



VŨ NGÂN BÌNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN


KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
TS. Phạm Thị Thanh Hà
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất

!




HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm
Thị Thanh Hà – Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược
Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn
thành khoá luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Hóa
phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất
về cơ sở vật chất để em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, các phòng ban,
bộ môn và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại
trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ và tạo động lực cho em trong suố t quá trình học tập và thực hiện đề
tài.
Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2015
Sinh viên


Vũ Ngân Bình




MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Phân tích đồng phân đối quang 2
1.1.1. Đồng phân đối quang 2
1.1.2. Phân tích đồng phân đối quang 4
1.2. Tổng quan về atenolol 9
1.3. Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị 14

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14
2.1.2. Hoá chất 14
2.1.3. Trang thiết bị 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol
bằng điện di mao quản 15
2.2.2. Thẩm định phương pháp 15
2.2.3. Ứng dụng 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 16
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 17
2.4. Phương pháp xử lý số liệu 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch
làm việc 20
3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 21
3.2.1. Một số điều kiện ban đầu 21
3.2.2. Lựa chọn cột mao quản 21
3.2.3. Lựa chọn dung dịch điện ly nền 23
3.2.4. Lựa chọn điện thế áp vào hai đầu mao quản 24
3.2.5. Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 26
3.2.6. Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân (R)- và (S)-atenolol 27
3.2.7. Xác định hàm lượng đồng phân (R)- và (S)- atenolol trong chuẩn
(R,S)-atenolol 29
3.3. Thẩm định phương pháp 29
3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 29
3.3.2. Độ đặc hiệu 30
3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 32
3.3.4. Độ chính xác 33
3.3.5. Độ đúng 34

3.3.6. Ứng dụng phương pháp định lượng hai đồng phân đối quang
atenolol trong chế phẩm 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO



i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AGP
Acid α1-glycoprotein
BGE (Background Electrolyte)
Dung dịch điện ly nền
β-CD
Beta cyclodextrin
CD
cyclodextrin
CE (Capillary Electrophoresis)
Điện di mao quản
CM-β-CD
Carboxymethyl beta
cyclodextrin
EOF (Electroosmotic flow)
Dòng điện thẩm
GC (Gas Chromatography)
Sắc ký khí
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

I.D. (inner diameter)
Đường kính trong
kl/tt
Khối lượng trên thể tích
L
e
(effective length)
Chiều dài hiệu dụng
ppm (part per million)
Phần triệu
R
s
(Resolution)
Độ phân giải
RSD (Relative Standard Deviation )
Độ lệch chuẩn tương đối
SD (Standard Deviation)
Độ lệch chuẩn
SĐK
Số đăng ký
TLC (Thin Layer Chromatography)
Sắc ký lớp mỏng
t
m
(migration time)
Thời gian di chuyển
Tris
Tris (Hydroxymethy)
amimomethan

ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Số bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang Atenolol
bằng HPLC
10
1.2
Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol bằng
CE
11
3.1
Xác định hàm lượng các đồng phân trong chuẩn (R,S)-
atenolol
29
3.2
Độ phù hợp hệ thống
30
3.3
Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của (R,S)-
atenolol và (R)-, (S)-atenolol
32
3.4

Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp
33
3.5
Kết quả đánh giá độ đúng của (R)-,(S)-atenolol
34
3.6
Kết quả xác định hàm lượng (R)- và (S)-atenolol trong các
mẫu chế phẩm
35







iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc và kích thước của các cyclodextrin tự nhiên [11]
7
1.2
Tương tác giữa chất phân tích mang điện dương và
cyclodextrin mang điện âm. Tương tác tĩnh điện khiến phức 1
bền hơn phức 2 (K1>K2) [4]
8
1.3

Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol
9
3.1
Điện di đồ của dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi sử dụng
mao quản dài 48,5 cm
21
3.2
Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau a)
Đệm phosphate 50 mM b)Đệm 50 mM Tris – H
3
PO
4

22
3.3
Điện di đồ dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol ở 4 điện thế
a) 15 kV; b) 20 kV; c) 25 kV; d) 30 kV
24
3.4
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian di chuyển các
đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử
dụng
25
3.5
Điện di đồ dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi thay đổi
nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang a) CM-β-CD 6 mM; b)
CM-β-CD 8 mM; c) CM-β-CD 10 mM
26
3.6
Điện di đồ dung dịch a) chuẩn (S)-atenolol và b) chuẩn (R,S)-

atenolol
28
3.7
Điện di đồ: a) mẫu placebo; b) mẫu S-atenolol; c) mẫu chuẩn
(R,S)-atenolol; d) mẫu viên nén atenolol STADA 50 mg
31
3.8
Điện di đồ dung dịch thử viên nén Ternomin 50 mg
36


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều thuốc có chứa hoạt chất là các đồng phân
quang học. Các đồng phân đối quang có thể có hoạt tính sinh học rất khác nhau.
Một xu hướng phổ biến trong nghiên cứu thuốc là chuyển hoạt chất từ dạng hỗn
hợp racemic sang dạng đơn đồng phân, nếu đồng phân đó có tác dụng chính và
độc tính thấp hơn đồng phân còn lại. Phân tích các đồng phân đối quang có ý
nghĩa ngày càng quan trọng, do có thể giúp phân biệt đặc điểm dược động học và
dược lực học của hai đồng phân và phân tích tạp đối quang.
Atenolol là dẫn chất của aryloxypropanolamin, có tác dụng ức chế chọn lọc trên
thụ thể β
1
- adrenergic dùng điều trị tăng huyết áp [2]. Atenolol có hai đồng phân
đối quang là (S)-atenolol và (R)-atenolol, trong đó (S)-atenolol có vai trò chính
ức chế beta giao cảm đồng thời độc tính cũ ng thấp hơn so với (R)-atenolol
[22],[29]. Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự chuyển dạng
đồng phân từ hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân (S)-atenolol. Điều này đòi
hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn
đồng phân trong hỗn hợp racemic của atenolol.

Hiện nay, kỹ thuật điện di mao quản được dùng phổ biến để tách các đồng phân
quang học do tính linh hoạt, hiệu lực tách cao, lượng mẫu sử dụ ng ít. Tuy nhiên
ở Việt Nam kỹ thuật này vẫn còn được áp dụng khá hạn chế.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng
phân đối quang atenolol bằng điện di mao quả n” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của
atenolol bằng điện di mao quản.
2. Ứng dụng phương pháp này định lượng các đồng phân đối quang của
atenolol trong chế phẩm.


2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Phân tích đồng phân đối quang
1.1.1 Đồng phân đối quang
Đồng phân đối quang là một đồng phân lập thể được hình thành do sự sắp xếp
không gian đối nghịch nhau của các nhóm thế trên một nguyên tử bất đối,
thường gặp nhất là nguyên tử carbon. Hầu hết các tính chất lý hoá của hai đồng
phân đối quang tư ơng tự nhau, trừ khả năng làm quay mặt phẳng ánh sánh phân
cực theo hai góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau.
Đồng phân đối quang làm quay mặt phẳng ánh sang phân cực theo chiều cùng
chiều với kim đồng hồ được gọi là đồng phân (+) hoặc d (tiếng Latin dextro),
đồng phân đối quang là quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều ngược
chiều với kim đồng hồ đư ợc gọi là đồng phân (-) hoặc l (tiếng Latin là levo).
Ngoài ra tuỳ theo thứ tự sắp xếp của các nhóm chức trong không gian xung
quanh vị trí nguyên tử bất đối mà đồng phân đối quang có thể được gọi là đồng
phân (R) hoặc (S), (D) hoặc (L). Do danh pháp d, l và (D), (L) dễ bị nhầm lẫn,
các đồng phân đối quang thường được gọi là đồng phân (+), (-) hoặc (R), (S).
Tuy tính chất lý hoá của hai đồng phân rất giống nhau, hoạt tính sinh học của hai
đồng phân đối quang có thể rất khác nhau. Rất nhiều thuốc trên thị trường có

hoạt chất là các chất hoạt quang, được sử dụng ở dạng racemic (là hỗn hợp của
hai đồng phân đối quang, với tỷ lệ thường là 50:50), hoặc ở dạng đơn đồng phân.
Việc nghiên cứu các đặc tính dược lực học, dược đ ộng họ c của hai đồng phân
đối quang là quan trọng, do chúng có thể có những đặc điểm hoàn toàn khác
nhau và khác với hỗn hợp racemic.


3
Về đặc điểm dược lực học, tác dụng của hai đồng phân đối quang có thể thuộc
một trong bốn trường hợp như sau:
- Có cùng tác dụng dược lý và cùng mức độ tác dụng. Có rất ít dược chất
thuộc nhóm này. Ví dụ: promethazine [19]
- Có cùng tác dụng dược lý nhưng khác mức độ tác dụng và/hoặc độc tính.
Hầu hết các dược chất thuộc nhóm này. Ví dụ levofloxacin có tác dụng
kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục lần dextrofloxacin, hai đồng phân đối
quang của lamivudin có tác dụng trên HIV tương đương nhau, nhưng (-)
lamivudin có độ c tính trên tế bào thấp hơn so với (+) lamivudin [10].
- Chỉ có một đồng phân có tác dụng dược lý. Ví dụ (S)-ketoprofen có tác dụng
chống viêm còn đồng phân (R)-ketoprofen thì không có tác dụng này [23].
- Có tác dụng dược lý hoàn toàn khác nhau: ví dụ dextropropoxyphen có tác
dụng chống viêm, còn levopropoxyphen có tác dụng chống ho [18].
Đặc điểm dược động học thể hiện qua 4 quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá,
thải trừ. Trong bốn quá trình này, có những quá trình mang tính chọn lọc đối
quang, tức là ưu tiên tương tác trên một đồng phân đối quang hơn là đồng phân
còn lại do sự tương thích về cấu trúc không gian, do đó làm cho đặc điểm dược
động học của hai đồng phân đối quang khác nhau. Ví dụ Levodopa (L-dopa)
được hấp thu nhiều hơn D-dopa [10].
Do các đặc điểm dược lực học và dư ợc động học của các đồng phân đối quang
có thể rất khác nhau và khác racemic, việc nghiên cứu riêng các đặc điểm này
của hai đồng phân đối quang là quan trọng. Trên thế giới, Cơ quan Dược phẩm

Châu Âu (European Medicinal Agency – EMEA) [15] đã ra hướng dẫn với các
thuốc mới cần xác định sự có mặt của các đồng phân đối quang. Nếu có, cần
nghiên cứu tách các đồng phân đối quang và tác dụng riêng rẽ của từng đồng


4
phân này. Từ đó đưa ra giải thích cho việc lựa chọn đơn đồng phân hoặc dạng
racemic cho chế phẩm.
Phần lớn những hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên hoặc bán tổng hợp tồn tại ở
dạng đơn đồng phân đối quang. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp, mặc dù một
đồng phân có tác dụng chính, vẫn được sử dụng chủ yếu ở dạng racemic. Từ kết
quả nghiên cứu về sự khác nhau giữa đặc điểm dược lực học và đặc điểm dược
động học của hai đồng phân đối quang, từ những năm 1990 bắt đầu xuất hiện
trào lưu mới, chuyển hoạt chất từ dạng hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân
(“chiral switch”). Ví dụ esomeprazole (S-omeprazol), S-salbutamol,
levofloxacin… Đối với những thuốc mới việc nghiên cứu chuyển từ dạng
racemic sang đơn đồng phân là một xu hướng khá phổ biến. Việc chuyển từ dạng
racemic sang đơn đồng phân có những ưu điểm sau [18]:
- Tăng tác dụng điều trị và chọn lọc với liều giữ nguyên hoặc giảm liều
- Giảm độc tính và tác dụng không mong muốn
- Giảm tương tác giữa các đồ ng phân đối quang và với các thuốc khác
- Dược lực học và dược động học có độ lặp lại tốt hơn
- Quan hệ liều – đáp ứng đơn giản hơn
Tuy nhiên không phải trường hợp chuyển dạng đồng phân nào cũng thành công.
Ví dụ R-thalidomid đ ã bị thu hồ i chỉ một thời gian ngắn sau khi đưa ra thị trường
do không làm giảm tác dụng không mong muốn so với dạng racemic như dự
đoán [27].
1.1.2 Phân tích đồng phân đối quang
Nhu cầu phát triển phương pháp cho phân tích đồng phân đối quang ngày càng
tăng. Trong nghiên cứu dược, việc phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa

đặc biệt quan trọng do có thể thực hiện được các nhiệm vụ sau:
- Phân biệt dạng đơn đồng phân và racemic


5
- Phân tích tạp đồng phân đối quang
- Phân biệt dược động học và dược lực học của hai dạng đồng phân
Do các đồng phân quang học rất giống nhau về tính chất lý hóa nên áp dụng các
phương pháp tách thông thường không đem lại kết quả. Để tách được hai đồng
phân đối quang, cần biến đ ổ i chúng thành những sản phẩm có tính chất lý hoá
khác nhau, hoặc dùng những chất có khả năng tương tác chọn lọc với một trong
hai đồng phân. Việc tách các đồng phân đối quang được thực hiện theo một
trong hai phương pháp: phương pháp gián tiếp và phương pháp trực tiếp [4].
Phương pháp gián tiếp
Nguyên tắc của phương pháp này là cho hai đồng phân đối quang phản ứng với
một hợp chất bất đối tạo thành một hỗn hợp hai đồng phân lập thể không đối
quang, sau đ ó phân tách bằng các phương pháp tách thông thường như sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc điện di mao quản (CE). Tuy nhiên phương
pháp này có nhiều nhược điểm như tốn thời gian xử lý mẫu, thuốc thử bất đố i
phải có độ tinh khiết cao, hai đồng phân racemic cần có cùng tốc độ và mức độ
phản ứng, detector cần có đáp ứng như nhau với hai dẫn xuất tạo thành…
Phương pháp trực tiếp
Đây là phương pháp thông dụng hơn. Các đồ ng phân đố i quang tuy có tính chất
lý hoá tương tự nhau nhưng do cấu trúc không gian khác nhau, chúng có khả
năng tương tác khác nhau với các tác nhân chọn lọc hoạt quang (chiral selectors).
Khi mức độ khác biệt của quá trình tương tác với chất chọn lọc hoạt quang đủ
lớn, các đồng phân đối quang sẽ được tách ra khỏi nhau. Các tương tác giữa hai
đồng phân đối quang và chất chọn lọc đối quang là liên kết hydro, tương tác kỵ
nước, liên kết π-π, lưỡng cực - lưỡng cực.
Các chất chọn lọc hoạt quang có bản chất hóa học khá đa dạng, được chia thành

các nhóm chính sau [4], [8]:


6
- Có bản chất protein: α1-acid glycoprotein, albumin huyết thanh, ovalbumin
- Dẫn chất polysaccarid: dẫn xuất cellulose, amylase
- Chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành "hốc" chọn lọc đối
quang (các cyclodextrin và dẫn xuất, ether vòng, polymer)
- Chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và
nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)
- Nhóm trao đổi ion (đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)
Các phương pháp phân tích các hợp chất đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC), và điện di mao quản (CE).
Trong đó HPLC và CE là hai kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất [16].
Nguyên lý HPLC
HPLC là kỹ thuật tách các chất dựa trên tương tác khác nhau của chất phân tích
với pha tĩnh và pha động, làm cho chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau
và được phân tách ra khỏi nhau [3]
Trong HPLC các đồng phân quang học trong hỗn hợp racemic có thể được tách
bằng một trong ba cách sau:
- Tạo dẫn xuất hoạt quang trước khi phân tích
- Thêm vào pha động tác nhân chọn lọc hoạt quang
- Sử dụng cột tách chọn lọc đối quang (chiral stationary phases): Tác nhân
chọn lọc hoạt quang được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh.
Trong đó sử dụ ng cột pha tĩnh hoạt quang là phương pháp phổ biến nhất do tính
tiện lợi, nhanh chóng và chính xác. Tuy nhiên một cột sắc ký hoạt quang thường
chỉ tách được một vài nhóm chất và chi phí của những cột này khá cao.

7
Nguyên lý CE
Điện di là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào sự di chuyển với vận tốc
khác nhau của các phần tử mang điện dưới tác động của điện trường. Điện di
mao quản là quá trình điện di được thực hiện trong mao quản có kích thư ớc rất
nhỏ, dưới 100 µm. Dưới tác dụng của dòng điện di và dòng điện thẩm, các chất
phân tích được di chuyển trong ống mao quản [3], [4].
Dòng điện di là dòng điện tạo ra do các ion hoặc các phần tử điện di chuyển dọc
theo mao quản về phía cực trái dấu dưới tác dụng của lực điện trường.
Dòng điện thẩm EOF là dòng dung dịch chảy trong mao quản dưới tác dụng của
điện trường do thể zeta tạo ra trên giao diện tiếp xúc giữa bề mặt mao quản và
dung dịch trong mao quản.
Các đồng phân đối quang được phân tích bằng điện di mao quản phần lớn là theo
phương pháp trực tiếp: thêm chất chọn lọc đối quang vào dung dịch điện ly nền
(Background Electrolyte – BGE) hoặc gắn vào thành của điện di mao quản hoặc
pha tĩnh.
Khi phân tích đồng phân đối quang bằ ng HPLC thườ ng sử dụng các cột hoạt
quang rất đắt tiền, và một cột hoạt quang chỉ phân tích được một vài chất nhất
định. Trong khi đó với CE có thể thay đổi linh hoạt hệ điện ly nền sử dụng nhiều
loại chất chọn lọc đối quang khác nhau và hệ đệm khác nhau để ứng dụng tách
nhiều nhóm chất khác nhau. Chi phí sử dụng các chất hoạt quang này với nồng
độ nhỏ trong điện di thấp hơn nhiều so với chi phí của cột sắc ký hoạt quang.
Như vậy CE giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời tính linh hoạt cũng cao
hơn HPLC. Chất chọn lọc đối quang được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật
điện di mao quản là các cyclodextrin.

8
Tổng quan về các cyclodextrin
Cyclodextrin (CD) là các hợp chất thu đượ c từ phân huỷ tinh bột bằng enzym.
Về mặt cấu tạo, các cyclodextrin là oligosaccharid mạch vòng, gồ m 6 đến 12 đơn
vị D(+)-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid. Trong số đó,
các CD có 6,7,8 đơn vị D(+)-glucose (tương ứng với α, β, γ-CD) là được sử dụng
phổ biến [11]. CD có hình dạng như một hình nón cụt rỗng với một hốc kỵ nước,
và mặt ngoài thân nước do sự có mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của
glucopyranose). Các chất phân tích có thể tương tác với các CD tạo thành các
phức lồng. Cấu trúc của α, β, γ-CD được mô tả trong hình 1.1.







Hình 1.1: Cấu trúc và kích thước của các cyclodextrin tự nhiên [11]
Kích thước hốc kỵ nước của β-CD phù hợp với nhiều hợp chất hoá học. Độ tan
của β-CD là tương đối thấp hơn so với α- và γ-CD, tuy nhiên có thể được cải
thiện bằng cách tạo các dẫn xuất không mang điện tích như dẫn xuất methylat-,
hydroxy- ethylat-, hydroxypropylat- và các dẫn xuất mang điện tích như dẫn xuất
carboxymethylat-, sulphat-, phosphat-…Các dẫn xuất này có thể làm tăng sự
chọn lọc trong phân tích đồng phân đố i quang như làm tăng độ tan, khả năng tạo
các liên kết thứ cấp…Ngoài ra khi tác nhân chọn lọc đối quang mang điện tích
có chiều chuyển động ngược với chất phân tích sẽ làm tăng độ phân giải vì làm
tăng sự khác biệt về linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong


9

phức lồng (hình 1.2) [4], [16]. Quá trình phân tích đồng phân đối quang có thể bị
tác động bởi nhiều yếu tố như loại và nồng độ của CD, pH, thành phần BGE,
điện thế, chiều dài cột mao quản, đường kính trong mao quản (I.D.)…

Hình 1.2. Tương tác giữa chất phân tích mang điện dư ơ ng và cyclodextrin
anionic. Tương tác tĩnh điện khiến phức 1 bền hơn phức 2 (K
1
> K
2
) [4]
1.2 Tổng quan về atenolol
Công thức phân tử: C
14
H
22
N
2
O
3

- Tên khoa học
(2-{4-[2-hydroxy-3-(propan-2-ylamino)propoxy]phenyl}acetamid)
- Khối lượng phân tử 266,3
- Atenolol có một nguyên tử carbon bất đối và đo đó tồn tại dưới dạng hai
đồng phân đối quang (S)- atenolol và (R)- atenolol (hình 1.3)

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol
Tính chất lý hoá [21]:
- Là bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng


10
- Tan trong methanol, acid acetic, tan trong ethanol, ít tan trong aceton, thực tế
không tan trong acetoniril, chloroform.
- Nhiệt độ nóng chảy 146-148
o
C
- logP = 0,16
- pKa = 9,6
- Cực đại hấp thụ (dung dịch pha trong methanol): 225, 275, 283 nm
Dược lý và cơ chế tác dụng
Atenolol có tác dụng chống tăng huyết áp, thuộc nhóm chẹn chọn lọc trên thụ thể
beta
1
, làm giảm lực co cơ và tần số tim [2]. Nghiên cứu so sánh tác dụng giảm
nhịp tim của atenolol racemic và (R)-atenolol, (S)-atenolol trên người cho thấy
uống 100 mg atenolol racemic cho tác dụng tương đương với uống 50 mg (S)-
atenolol, trong khi không thấy tác dụng này sau khi uống 50 mg (R)-atenolol
[29]. Ngoài ra, (S)-atenolol ức chế β
1
-adrenergic chọn lọc hơn 40 lần và có ít tác
dụng phụ như loạn nhịp, đánh trống ngực hơn so với (R)-atenolol [22].
Như vậy trong hai đồng phân đối quang của atenolol, chỉ đồng phân (S)-atenolol
có tác dụng chẹn beta giao cảm. Đồng phân (R)-atenolol không những không có
tác dụng dược lý này, thậm chí còn có nhiều tác dụng không mong muốn hơn
đồng phân (S)-atenolol. Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự

chuyển dạng đồng phân như đã đề cập ở trên [30].
1.3 Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol
Các nghiên cứu ở nước ngoài
Các đồng phân đối quang của atenolol được định tính và định lượng chủ yếu
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột sắc ký hoạt quang hoặc tạo dẫn xuất
hoạt quang (bảng 1.1). Những nghiên cứu này sử dụng detector huỳnh quang và
cột sắc ký hoạt quang đắt tiền. Việc tạo dẫn xuất đòi hỏi xử lý mẫu khá phức tạp.
Một số nghiên cứu dùng cột Chiral AGP khi phân tích atenolol racemic từ chế


11
phẩm viên nén pic các đồng phân quang học của atenolol chưa tách khỏi nhau
hoàn toàn [12].
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang Atenolol bằng HPLC
STT
Tác giả
Loại cột
Pha động
Detector
1
Engquist và Hermansson,
1989 [14]
α1-AGP (100 x 4,0
mm, 5µm)
đệm phosphat pH 7,1 chứa
acetonitril 0,25% (v/v)
huỳnh
quang
2
Egginger et al., 1993

[13]
(R,R)-
diaminocyclohexan-
dinitrobenzoyl
dichloromethan : methanol
98/2 (v/v)
huỳnh
quang
3
Santoro và Cho, 2000
[26]
Chiralcel OD (250 x
4,6 mm; 10 µm)
Hexan - ethanol - diethylamine
= 75: 25: 0,1
UV
4
Eaga et al., 2010 [12]
Chiralcel AGP (150 x
4.0 mm, 5 µm)
đệm phosphat pH 7 - methanol
(95:5)
UV
5
Hefnawy et al., 2013
[17]
Chirobiotic V
MeOH: acid acetic băng:
triethylamin = 100:0.025:0.75
huỳnh

quang
Kỹ thuật điện di mao quản được ứng dụng rộng rãi trong việc tách đồng phân đối
quang của Atenolol. Một số nghiên cứu được công bố dùng kỹ thuật điện di mao
quản vùng và sử dụng chất chọn lọc đối quang là dẫn xuất hydroxylpropyl,
carboxyl, sulfat CD (bảng 1.2). Các nghiên cứu này sử dụng đa dạng các chất
chọn lọc đối quang. Tuy nhiên độ phân giải giữa hai pic của đồng phân đối
quang atenolol chưa tốt. Trong nghiên cứu của Wuhong et al. 2010 [20], tác giả
đã tách được hai đồng phân đối quang của atenolol hoàn toàn khỏi nhau và thời
gian di chuyển của hai đồng phân không quá dài. Tuy nhiên tác giả chưa xác
định được thứ tự di chuyển của hai đồng phân.







12
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol bằng CE
STT
Tác giả
Kích thước
mao quản
nhiệt độ,
thế
Dung dich điện ly nền
t (phút)
1
Peterson
1993 [24]

50 cm x 75 µm
I.D.
10 kV
28 mM Me-β-CD, đệm
20 mM Tris - acid
phosphoric, pH 2,4
(-) atenolol: 17,15
(+) atenolol: 17,37
2
Wren và
Rowe
1993 [31]
57 cm x 50 µm
I.D.
25
o
C, 20
kV
40 mM Me-β-CD 50
mM lithium phosphat
pH 3,0
Khoảng 25 phút
3
Aumatell
et al. 1994
[7]
100 cm x 50
µm I.D.
20 kV
2,0 mM SBE-β-CD, 20

mM citric và phosphat
pH 2,5
13,03 – 13,25;
Rs 0,67
4
Quang et
al. 1995
[25]
60cm x 52 µm
I.D
40
o
C
HP- β -CD 20mM
100 mM TMA
phosphat pH 2,5
18,68 – 18,82;
Rs 0,59
5
Stalcup và
Gahm
1996 [29]
60 cm x 75 µm
I.D.
15 kV
Sulfat CD 2%, 10mM
đệm phosphat pH 3,8
Không tách
6
Wuhong

Li et al.
2010 [20]
48,5 cm x 50
µm I.D.
20
o
C, 24
kV
8mM CM- β -CD
50mM Tris, H
3
PO
4

pH 4,0
Từ 17 – 18 phút
Các nghiên cứu ở trong nước
Ở Việt Nam, phân tích đồng phân đối quang atenolol đã được thực hiện bằng kỹ
thuật HPLC [5] và CE [6].
Một số thông số của phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol
bằng HPLC [5]:
- Cột Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(α-
naphtyl)ethylamine) kích thước 4,0 x 250 mm; 5 µm.
- Pha động: n-hexan/ 1,2 dicloromethan/ methanol / acid trifluoroacetic tỷ lệ
57,5/35/7,5/0,2 (v/v/v/v), Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
- Detector UV, bước sóng phát hiện 229 nm
- Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml (racemic), Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.


13

Nghiên cứu này dùng cột sắc ký hoạt quang đắt tiền, chương trình sắc ký pha
thuận, pha động có chứa các dung môi hữu cơ ít phân cực, độc hại.
Nghiên cứu [6] tách đồng phân đối quang atenolol bằng CE sử dụng tác nhân
chọn lọc đối quang là carboxymethyl-β-cyclodextrin và các điều kiện điện di
sau:
- Cột mao quản silica nung chảy: 60 cm (50 cm) x 75 µm (I.D).
- BGE: TRIS 50 mM, CM-β -CD 8 mM, pH 4,0, chỉnh bằng H
3
PO
4
đặc.
- Nhiệt độ: 20
o
C.
- Điện thế: 16 kV
- Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar x 3 s.
- Bước sóng phát hiện: 194 nm.
- Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/ml hay 100 ppm atenolol racemic.
Hai đồng phân đối quang đã tách hoàn toàn khỏi nhau và đã xác định được thứ tự
di chuyển của hai đồng phân. Tuy nhiên thời gian di chuyển của hai đồng phân
còn dài (thời gian di chuyển của đồng phân (R)- và (S)-atenolol lần lượt là 29,5
và 30,4 phút), chưa phù hợp với thực tế kiểm nghiệm thuốc.


14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chế phẩm viên nén có chứa atenolol 50 mg (dạng racemic):
- Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô: 051113,

hạn dùng: 04/11/18, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-VN.
- Mẫu placebo: chứa các thành phần tá dược của viên do công ty STADA
cung cấp gồm: tinh bột ngô, tinh bột tiền hồ hóa, lactose monohydrat,
povidon K25, natri laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat.
2.1.2. Hóa chất
- Chất chuẩn atenolol (racemic), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
hàm lượng: 100,17 %, độ ẩm: 0,11 %, số kiểm soát: 0102093.
- Chất chuẩn S-atenolol, hãng sản xuất Sigma – Aldrich, Mỹ, hàm lượng 99
%, số lô 021M4620V.
- Carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD), dạng muối natri, Sigma-
Aldrich, Mỹ, số lô BCBK3651V.
- Natri hydroxyd Merck KGaA, Đức.
- Tris (hydroxymethyl amino methan (Tris) Merck KGaA, Đức.
- Acid phosphoric 85 % Merck KGaA, Đức
- Acid hydrochloric Merck KGaA, Đức
- Methanol Merck KGaA, Đức.
2.1.3. Trang thiết bị
- Máy điện di mao quản Agilent, model: G1600AX, số seri: DE1603499,
Agilent, Mỹ.
- Cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid loại có chiều dài hiệu
dụng 40,0 cm, chiều dài tổ ng cộng 48,5 cm, đường kính trong 50 µm,
Agilent, Mỹ.
- Máy đo pH (744 pH meter), Metrohm, Thụy Sỹ.


15
- Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, d = 0,1 mg và XS105DU, d = 0,01
mg, Thụy Sỹ.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, Elma, Đức
- Máy cất nước hai lần Hamilton WSC/4D, Anh.

- Hệ thống lọc nước siêu sạch Labostar-1, Siemens, Đức.
- Màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,2 µm, Sartorius, Đức.
- Bộ lọ nhựa đựng mẫu và nắp đậy.
- Các dụng cụ chính xác: các pipet chính xác với thể tích khác nhau, bình
định mức với thể tích khác nhau.
- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol
bằng điện di mao quản
- Lựa chọn cột mao quản
- Lựa chọn dung dịch điện ly nền
- Lựa chọn hiệu điện thế
- Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang
- Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân đối quang
- Xác định hàm lượng đồng phân (R)- và (S)-atenolol trong chuẩn atenolol
racemic
2.2.2. Thẩm định phương pháp
- Độ phù hợp hệ thống
- Khoảng nồng độ tuyến tính
- Độ đặc hiệu
- Độ lặp lại
- Độ đúng




16
2.2.3. Ứng dụng
Định lượng các đồng phân đối quang atenolol trong chế phẩm viên nén có
chứa atenolol trên thị trường.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi đưa ra một số điều kiện điện di ban
đầu và khảo sát thêm một số điều kiện điện di: cột mao quản, dung dịch đ iện
ly nền, nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang, điện thế.
Lựa chọn cột mao quản
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt)
với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau.
Lựa chọn dung dịch điện ly nền
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt) sử dụng
dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0,
chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-
CD 8 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện
ly nền thích hợp.
Lựa chọn điện thế
Thay đổi điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (∆E= 5 kV) và
tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn điện thế phù hợp.
Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm với điều kiện điện
di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang CM-β-
CD từ 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn
nồng độ CM-β-CD thích hợp.





17
Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân đối quang
Điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm và dung dịch chuẩn (S)-

atenolol 50 ppm trong cùng điều kiện. Dựa vào thời gian di chuyển của các
đồng phân trên điện di đồ, xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân.
Xác định hàm lượng của đồng phân (S)-atenolol và (R) atenolol trong
chuẩn (R,S)-atenolol
Do đơn đồng phân (R)-atenolol có giá rất cao, nồng độ của hai đồng phân đ ối
quang của atenolol trong mẫu chuẩn racemic được xác định từ việc so sánh
diện tíc pic của pic đồng phân (S)-atenolol trong hỗn hợp (R,S)-atenolol với
diện tích pic của đồng phân (S)-atenolol trong chuẩn đơn (S)-atenolol phân
tích trong cùng điều kiện điện di. Từ nồng độ của hai đồng phân trong hỗn
hợp racemic và nồng độ của đơn đồng phân (S)-atenolol, tính ra nồng độ của
đơn đồng phân (R)-atenolol trong chuẩn hỗn hợp.
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Nghiên cứu được thẩm định theo hướng dẫn của ICH [19] và ASEAN [3].
Độ phù hợp hệ thống
Các thông số được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của hệ thống bao gồm độ
phân giải R
s
giữa các pic của đồng phân (S)- và (R)-atenolol và độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) của các đáp ứ ng phân tích khi tiêm mẫu lặp lại. Yêu cầu các
giá trị thời gian di chuyển, diện tích pic của mỗi đồng phân có RSD ≤ 3 % [1],
R
s
> 2.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn atenolol racemic 100
ppm trong cùng điều kiện điện di.
Độ đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử và mẫu chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm, mẫu
chuẩn (S)-atenolol 50 ppm và tiến hành điện di với các điều kiện đã chọn
được ở trên. Yêu cầu trên điện di đồ pic của các đồng phân phải tách hoàn
toàn so với pic của chất tạp. Trên điện di đồ của mẫu placebo, tại thời điểm