Chiết tách tinh chế tạo chế phẩm protease từ chủng mucor hiemalis để ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng

Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
v ủ MẠNH
CHIÉT TÁCH TINH CHỂ TẠO CHÉ PHẨM
PROTEASE TỪ CHỦNG MUCOR
HIEMALIS ĐẺ ỨNG DỤNG TRONG Dược
VÀ THựC PHẨM CHỨC NĂNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Xuân Thành
2. ThS. Nguyễn Thị Loan
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn hóa sinh
2. Bộ môn công nghiệp Du’Ọ'c
HÀ NỘI - 2010
_________________
*
LỜI CẢM OfN
Với lòng kỉnh trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xỉn phép được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc tới các thầy cô:
PGS.TS. Nguyễn Xuân Thành
TS. Nguyễn Văn Rư
ThS. GVC. Nguyễn Thị Loan
Là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị
kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa sinh, bộ môn Vi sinh - Công nghiệp dược
- trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tội
trong quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo cùng toàn thể các cán
bộ trưòng Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình năm năm tôi được học tại đây.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những
người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 8 tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Vũ Mạnh
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cưong về protease 2
1.1.1. Khái niệm protease
2
1.1.2. Phân loại protease 2
1.1.3. Protease nguồn gốc động vật 4
1.1.4. Protease thực vật 5
1.1.5. Protease vi sinh vật 6
1.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và chiết tách, tinh chế protease
ngoại bào 13
1.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 13
1.2.2. Thu nhận và tinh chế protease ngoại bào 14
1.3. Tổng quan về Mucor hiemalỉs 18
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CÚXJ 20
2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị 20
2.1.1. Nguyên vật liệu 20
2.1.2. Dụng cụ máy móc 21
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.2.1. Nuôi cấy Mucor hiemalis 21
2.2.2. Tách chiết và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy

22
2.2.3. Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease dựa
trên nguyên tắc của phản ứng Biuret 22
2.3. Phương pháp thực nghiệm 22
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy
22
2.3.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường
nuôi cây Mucor hỉemalis 23
Chương 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

31
3.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein 31
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng họp protease của Mucor hỉemalis

32
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đến
khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis

33
3.4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease Mucor
hiemalis 35
3.5. Các giai đoạn chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy
Mucor hiemalỉs 37
3.5.1. Giai đoạn thu nhận protease từ dịch nuôi cấy bằng (NH4)2S04 ở
nồng độ 85% bão hòa
37
3.5.2. Giai đoạn tinh chế protease bằng cồn tuyệt đối 37
3.6. Bàn luận 39

3.6.1. Nuôi cấy Mucor hỉemalis 39
3.6.2. về chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor
hiemalis 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
VSV: Vi sinh vật.
PDA : Môi trường thạch khoai tây và dextrose.
SK: Sinh khối.
TT: Thuốc thử.
bh: Bão hòa.
C: Nồng độ.
[protein]: Nồng độ protein.
P: Khối lượng protein bị thủy phân.
HđP: Hoạt độ protease.
HđP riêng: Hoạt độ protease riêng.
K tb i Hệ số K trung bình.
HđP %: Hoạt độ protein tính theo %.
HđP riêng: Hoạt độ riêng của protein (nK/mg hoặc nK/ml).
Kat: Đơn vị hoạt độ protease (1 Katal = 1 mol/s).
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẲT
Bảng 1.1. Tên và nguồn gốc một số chế phẩm protease
Bảng 1.2. Một số tính chất của protease v sv
Bảng 1.3. Một số v sv có khả năng tổng hợp mạnh protease
Bảng 1.4. Những phương pháp sắc ký
Bảng 1.5. Hệ thống phân loại khoa học của Mucor hiemalis
Bảng 3.1. Ket quả xây dựng đượng chuẩn casein
Bảng 3.2. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy
trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau
Bảng 3.3. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy
trong các môi trường có nồng độ Saccharose khác nhau
Bảng 3.4. Hoạt độ protease ở các pH khác nhau

Bảng 3.5. Hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau
Bảng 3.6.Tóm tắt quá trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy
Mucor hiemalis
DANH MỤC CÁC BẢNG
Hình 2.1. Sơ đồ quy trinh chiết tách protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs
Hình 3.1. Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và mật độ quang
Hình 3.2. Ảnh hưởng cùa nồng độ NaCl đến khả năng sinh protease
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose đến khả năng sinh protease
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến HđP
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HđP
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ
ĐẶT VẤN ĐÈ
Protease là loại enzym đã và đang được dùng rất phổ biến trong các lĩnh
vực khác nhau của đời sống như: công nghiệp chế biến, nông nghiệp, y dược.
Khoa học càng phát triển thì càng tìm thấy nhiều ứng dụng của protease, vì
vậy việc nghiên cứu phát hiện thêm các protease mới có những đặc tính đặc
biệt phục vụ cho lợi ích của con người vẫn đang thu hút được sự quan tâm đặc
biệt của đông đảo các nhà khoa học.
Protease được thu nhận từ ba nguồn là: động vật, thực vật và vi sinh vật.
Trong các nguồn đó, nguồn vi sinh vật giữ vai trò đặc biệt quan trọng. Nguồn
enzym này đang dần dần thay thế enzym từ động vật và thực vật do hàng loạt
nhưng ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và kỹ thuật sản xuất [8]. Hiện nay, hầu hết
các enzym ứng dụng trong công nghiệp đều do vi sinh vật tạo ra [3\
Mucor hiemalis là chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng họp protease
ngoại bào mạnh. Protease của Mucor hỉemalis đã và đang cung cấp những giá
trị thưong mại to lớn. Để góp phần nâng cao khả năng sinh tổng hợp và thu
nhận, tinh chế protease từ Mucor hiemalỉs chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu chiết tách, tinh chế, tạo chế phẩm Protease của chủng Mucor
hiemalis ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng”, với các mục
tiêu:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến khả
năng sinh tống hợp protease ngoại bào của Mucor hiemalis.
- Chiết tách, tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalis.
- Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease thu
nhận được.
Chương 1. TỎNG QUAN
1.1. Đại cương về protease
1.1.1. Khải niệm protease
Ngày nay, danh từ Protease dùng để chỉ những enzym xúc tác phản ứng
thủy phân liên kết peptid (giữa các L - acid amin) trong chuỗi polypeptid
hoặc trong phân tử protein thành các peptid phân tử thấp và các L - acid
amin.
Protease còn gọi là proteinase hoặc peptidase hoặc c - N hydrolase.
Phản ứng thủy phân liên kết peptid có xúc tác của protease không cần cung
cấp năng lượng từ bên ngoài [10\
1.1.2. Phân loại protease
1.1.2.1. Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia protease thành 2
nhóm\
- Frotase nội bào (enzym ở trong tế bào) ví dụ cathepsin chứa trong các
bào quan (lysosom).
- Protease ngoại bào (enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường
xung quanh) như các enzym của đường tiêu hóa (pepsin, trypsin v.v ).
1.1.2.2. Dựa vào vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease cũng cỏ
thể chia thành 2 loại:
-Endopeptiđase: enzym thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch
polypeptid.
- Exopeptidase: enzym phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid.
1.1.2.3. Dựa vào pH tối ưu, người ta chia protease thành 3 loại:
- Protease trung tính: ví dụ như papain, bromelain, ficin.
- Protease acid: như pepsin, rennin.

- Protease kiềm: như trypsin, a - chymotrypsin.
1.1.2.4. Dựa vào nhỏm chức trong trung tâm hoạt động của enzym
Protease được chia ra thành 4 nhóm, tên của các nhóm này bao gồm tên
của acid amin hoặc kim loại có vai trò quan trọng xúc tác trong trung tâm hoạt
động:
- Protease serin: ví dụ như trypsin, substilopeptidase ( EC. 3. 4. 21).
-Protease cystein: ví dụ như papain, bromelain, ficin ( EC. 3. 4. 22).
- Protease aspartic; VÍ dụ như pepsin, rennin ( EC. 3. 4. 23).
- Protease chứa kim loại: ví dụ như carboxypeptidase, aminopeptidase.
1.1.2.5. Dựa vào nguồn thu enzym
- Protease động vật.
- Protease thực vật.
- Protease vi sinh vật.
-Protease nấm men [10].
Bảng 1.1. Tên và nguồn gốc một số chế phẩm protease [10]
Tên enzym Nguôn gôc
pH tối ưu
pH bền
A - Protease động vật
Pancreatin
Pepsin
Chymosin
Tụy lợn hoặc bò
Dạ dạy lợn hoặc bò
Màng mỏng dạ dày bê
8,0
1 ,5 -2,0
6,0 - 7,0
3,0 -5,0
5,5-6 ,0

B - Protease thực vật
Papain
Bromelain
Ficin
Đu đủ {Carica papaya)
Dứa {Ananas sp.)
Sung, vả {Ficus sp.)
7.0 - 8,0
7.0 - 8,0
6.0
- 8,0
4,5 - 6,5
c - Protease vi khuẩn
Protease kiêm
Subtilisin
Protease trung tính
Pronase
Bacillus subtilis
Bacillus
B. thermoprotealytỉcus
Streptomyces grỉseus
7.0-11,0
6.0 -9,0
7,5 - 9,5
6,0 - 8,0
D - Protease nấm sợi
Protease acid
Protease trung tính
Protease kiềm
Protease acid

Protease acid
Aspergillus oryzae
A.oryzae
A.oryzae
Mucor pusillus
Rhizopus chinensis
3,0 -4,0
5.5-7,5
6,0 - 9,5
3.5-4,5
5,0
5.0
7.0
7,0 - 8,0
3,0 -6,0
3,8-6,5
1.1.3. Protease nguồn gốc động vật
Protease nguồn gốc động vật bao gồm: nhóm protease serin (EC 3.4.21)
chẳng hạn trypsin, chymotrysin, nhóm protease aspartic (EC 3.4.23) như
pepsin, rennin, nhóm protease chứa kim loại (EC 3.4.24) carboxypeptidase,
aminopeptidase. Protease động vật có cả 2 loại endopeptidase và
exopeptidase.
ở môi trường thích hợp, các protease có nguồn gốc động vật như pepsin,
trypsin và chymotĩypsin là các endopeptidase có khả năng thủy phân protein
thành các polypeptid nhỏ hơn nhưng hầu như chưa phải là acid amin. Trong
một vài trường hợp có thể phải dùng loại protease khác thay thể hoặc hỗ trợ
để thủy phân protein thành sản phẩm thích hợp và hiệu quả hơn. về những
protease động vật dùng trong điểu trị tiêu hóa kém, trypsin ngoài tác dụng
trực tiếp thủy phân protein còn có vai trò hoạt hóa những enzym khác. Sau đó,
những enzym này hoạt động thủy phân protein thành acid amin ở giai đoạn

tiếp theo [10\
1.1.4. Protease thực vật
Protease thực vật hay được gọi là protease cystein vì chúng có chứa
nhóm thiol của cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm này có vị trí đặc biệt
trong chức năng của phân tử enzym vì có khả năng phản ứng cao, tham gia
nhiều loại biến đổi hóa học như acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa và alkyl
hóa. Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzym đa dạng: tạo phức chất trung
gian enzym - cơ chất; phức hợp cơ chất với cofactor; duy trì ổn định các cấu
dạng hoạt động của enzym [19\
Protease cystein thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc
hiệu rộng. Protease chỉ hoạt động được khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt
động không bị bao vây. Do đó các chất như cystein, acid ascorbic ở nồng độ
xác định thưòng có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzym này. Protease cystein
bị ức chế bởi một số muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân như
p - chloromecurybenzoat và các dẫn chất khác như iodoacetamid. Các
protease này còn bị oxy hóa dưới tác dụng của các chất oxy hóa như:
hydrogen peroxyd, iod. Acid ethylendiaminotetraacetic (EDTA) CÓ khả năng
kết hợp với các ion kim loại có trong dung dịch, vì vậy thường làm tăng độ
bền của protease cystein [10'.
Như vậy các enzym nhóm này có độ bền nhiệt khá cao, tính đặc hiệu cơ
chất rộng. So với các protease nguồn gốc động vật, protease thực vật có khả
năng thủy phân sâu hơn, vì vậy có thể được dùng để phân giải tiếp các liên kết
còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay Chymotrypsin.
1.1.5. Protease vi sinh vật
1.1.5.1. Đặc tính protease vỉ sinh vật
Các công trình nghiên cứu protease v s v ngày càng nhiều. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi v s v cũng có thể
khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động
thích họp các nhà khoa học đã phân loại các protease v s v thành 4 nhóm
như sau:

- Protease - serin.
- Protease - thiol.
- Protease - kim loại.
- Protease - acid.
Một so tác giả khác chia protease ra làm 3 nhóm dựa vào pH hoạt động
của chúng bao gồm:
- Protease - acid.
- Protease - trung tính.
- Protease - kiềm.
Trong 4 nhóm protease kể trên, các protease - serin và protease - thiol
có khả năng phân giải ester và liên kiết amid của các dẫn xuất acid của amio
acid. Ngược lại, các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt
tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid. Nhiều protease
ngoại bào cùa v sv đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một
số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng
lượng phân tử cùa các enzym này tương đối bé, nhất là các protease - serin.
Các protease - serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 -
27.000dalton. Tuy nhiên, cũng có một số protease - serin có trọng lượng phân
tử lớn hon như các enzym của Pénicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp
oryzae OUT 5038 (52000). Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn
hơn so với protease - serin (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease - thiol và
nhiều protease acid cũng có khối lượng phân tử vào khoảng 30000 - 40000
8].
Có thể tóm tắt đặc tính của nhóm protease này ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số tính chất của protease v s v [8]
Nhóm
Nguồn enzym
Chất kìm hãm
Đặc
điểm

pH
trung
tối
tâm hoat
•
thích
động
Protease
Serin
Bac.subtilỉs
Bac.pumỉlus
Str.grỉseus
Str.fradiae
Art hrobacter B22
Asp.oryzae
Asp.flavus
Asp.sojae
E. coli
DFP+
Serin
Kiềm
Streplococus lodoaxeta - mit -SH 7,5
8
Protease
thiol
Clostridium histoly - ticum
Ps.cloromer-
curbenzoat
7,0
Protease

kirn loại
Bac.subtilis
Bac.subtilis NRRL B3411
Bac.subtilisamy
losaccarilicis
Bac. megaterium
Pseudomonasaeruginosa
Atreptomyces naraensis
Asp.oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolyticum
EDTA++
l,10octa-
fenantrolin
Kim loại
hóa trị 2
Trung
tính
Protease
acid
Asp.niger
Asp.awamori
Asp.sailoi, Penỉcỉllium
Janthinellum
Rhizopus chỉnensỉs
Mucor pusỉllus
Endothỉa parasilica
Diazoaxetil
Dl norlox
inmetil este

COOH
Acid
1.1.5.2. Nguồn protease từ vỉ sinh vật
Nhiều v sv có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có thể
ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại
bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học [8].
Các loài VSVcó khả năng tổng mạnh protease được trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Một số v s v có khả năng tổng ho’p mạnh protease [8]
Vi sinh vât
Ghi chú
Vi
khuẩn
Bac.subtilispha
Bac.cỉreulans
Bac.sphaerỉcus
Bac. thermophỉlus
Bac. aerothermophilus
Bac. thermoacỉdurans
Bac. thermoproteolyticus
Bac.brevis
Bac.Ucheniformis
Bac. mesenlericus
Bac. megaterỉum
Bac.cereus
Bac.pumilus
Cl.perfringens
Cl.histolyticum
Cl.sporogens
Ps.aeruginosa

Protease trung tính, protease kiềm
(subtilizin)
Protease kiềm.
Protease trung tính.
Protease trung tính, protease acid.
Protease acid và protease kiềm.
{ Colagenase
Protease trung tính , protease kiềm
10
Xạ
khuẩn
Str.griseus
Str.rimosus
Str.fradiae
Str.faeca is
Str.reetus var.pro-teolyticus
Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ gôm
ít nhất là 11 enzym với cơ chất
procolagen phân giải 70% đến amino
acid có 5 protease, 2 peptidase
(lơxiamino-peptidase,
carboxypeptidase), 2 protease:
protease - serin.
Asp.oryzae
Protease - kim loại protease serin, có
Asp.satoy
3 loại protease acid, protease trung
tính, protease kiềm. Protease acid
(aspergilopepti-dase A)
Asp.awamori

Protease acid
Asp.niger
Hai protease acid
Asp.shirousami Protease acid
Asp.fumigatus Hai protease: protease acid và
Asp.tericola protease kiem
Nấm
Protease acid CÓ tác dụng làm đông
mốc sữa
Asp.Candidus Protease trung tính
Protease kiềm.
Asp.ochraceus
Hai protease: protease kiềm và
protease trung tính
Asp.sojae
Protease acid
Asp.ßavus Protease kiềm
Pen.janthinellum Protease acid có tác dụng làm đông
Pen.cyaneo fulvum sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế
Mucorpusillus cho rennin.
11
Rh.chinensis
Rh.delemar
Rh.niveus
Rh.nodous
Rh.pseudokinensis
Rh.peka
Phymatorrichum
omnivorum
1.1.5.3. ứng dụng của protease vi sinh vật

Các protease nói chung cũng như protease v sv nói riêng được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y
dược học, nghiên cứu khoa học
Trong công nghiệp, protease được sử dụng trong nhiều ngành công
nghiệp thực phẩm như: chế biến cá, thịt, sữa, trong quá trình làm bánh mỳ,
trong công nghiệp nước giải khát và trong một số ngành công nghiệp nhẹ như:
kỹ nghệ thuộc da, công nghiệp dệt
Trong quá trình chế biến cá: khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột
cá đưa thêm protease từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trỉnh thủy phân,
rút ngắn thời gian chế biến, quá trình loại mỡ, loại xuơng khỏi thịt cá (trong
sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượng mắm cốt thu được cũng nhiều hon
hẳn so với mẫu đối chứng, cho hiệu quả hơn hẳn là các protease vsv.
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được sử dụng để làm mềm thịt
và tăng hưong vị sau khi chế biến.Để làm mềm thịt có thể dùng nhiều phương
pháp khác nhau: a) Ngâm thịt vào trong dung dịch có chứa hỗn họp protease,
giữ pH và nhiệt độ xác định, b) Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease,
muối, mì chính), c) Tiêm dung dịch enzym vào mô thịt, d) Tiêm enzym vào
12
máu động vật trước khi chết. Người ta cũng dùng protease làm xúc xích, lạp
xường.
Trong quá trình chế biến sữa: chủ yếu sử dụng các protease có tác dụng
làm đông sữa như: rennin, pepsin và một số protease v sv khác trong quá
trình sản xuất phomat. Khi sử dụng protease, phomat sẽ nhanh chín, nâng cao
được chất lượng và có thể tạo ra được nhiều loại phomat khác nhau.
Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng làm trong quy
trình làm bia và nước hoa quả, ở đây nó sẽ phân giải các protein có tác dụng
kìm hãm amylase do đó sẽ làm tăng quá trình đường hóa tinh bột.
Trong kỹ nghệ phim ảnh, protease được sử dụng để tái sinh các nguyên
liệu như: phim điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen, hòa tan lớp nhũ tương
gelatin trên phim và giấy ảnh do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại

phim và giấy ảnh quý [5],[17],[22;.
Trong nông nghiệp, protease được sử dụng trong chăn nuôi để phân giải
sơ bộ protein trong thức ăn của động vật, hoặc sử dụng để sản xuất các dịch
thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong công nghiệp dược phẩm và y học, protease được sử dụng để sản
xuất các thuốc làm chữa nghẽn tĩnh mạch, tăng khả năng tiêu hóa protein của
những người bị bệnh tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình
thường, thiếu enzym. Protease cũng được sử dụng để phân giải mạnh các
protein đã bị chết, protease cũng được dùng để làm tiêu mủ vết thương, các ổ
viêm, làm thông đường hô hấp [13],[14]. Protease cũng được dùng để phân
giải các protein tạp lẫn với kháng thể trong huyết thanh miễn dịch mà không
làm giảm hoạt tính của kháng thể [6].
Trong nghiên cứu khoa học, protease được sử dụng để nghiên cứu cấu
trúc phân tử protein nhờ vào tính đặc hiệu của các protease. Dưới tác dụng
của protease v sv protein bị phân giải sâu sắc hơn tạo thành các acid amin.
13
Sử dụng các phương pháp khác nhau để tiến hành nghiên cứu cấu trúc phân tử
protein [18],[20].
1.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và chiết tách, tinh chế protease
ngoại bào
1.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
Để có chế phẩm protease từ v sv cũng như các enzym khác có thể dùng
hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi) và phương
pháp nuôi bề sâu (phương pháp cấy chìm). Phương pháp bề mặt thường dùng
để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp nuôi cấy chìm thường dùng đối với vi
khuẩn và xạ khuẩn [8].
1.2.1.1. Phương pháp bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh
vật phát triển trên bề mặt môi trường. Môi trường thường dùng là cám, có pH
từ 5,6 - 6,2 (đối với nấm sợi) hoặc từ 6,2 - 7,2 (đối với vi khuẩn). Cho môi

trưòmg vào những khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào
vi sinh vật, do đó đối với mỗi vi sinh vật cần lựa chọn thời gian thích hợp nhất
(thời gian mà lượng enzym trong môi trường là lớn nhất). Nói chung đối với
đa sổ nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32 - 42 giờ. Sau đó dùng nước hoặc
dung dịch nuôi để chiết rút enzym khỏi môi trường, loại bỏ những phần
không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ [4],[8].
1.2.1.2. Phương pháp nuôi bề sâu
Trong phương pháp nuôi cấy bề sâu, người ta thường sử dụng môi
trường lỏng và được thực hiện trong các thùng lên men [8]. Chuẩn bị môi
trường thích hợp ngay trong thùng lên men đã khử trùng. Sau khi làm lạnh
cấy vi sinh vật vào với tỉ lệ 1 - 10%. Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành
kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi trường nuôi cấy. Khi hoạt độ đã đạt đến
14
cực đại cần nhanh chóng tách enzym khỏi tể bào vi sinh vật bằng cách ly tâm
haylọc[l],[5],[18].
1.2.2. Thu nhận và tỉnh chếprotease ngoại bào
Enzym thường chứa ở các tế bào sinli vật gọi là các enzym trong tế bào
(intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường
sống. Đó là các enzym ngoài tế bào (extracellular). Enzym v s v thường chiết
là enzym ngoại bào [4].
Đe thu nhận enzym ngoại bào, nếu nuôi cấy v sv theo phương pháp nuôi
cấy chim, sau khi kết thúc giai đoạn nuôi cấy, thường lọc hoặc ly tâm để loại
sinh khối. Dịch lọc đem thu nhận enzym bằng các phương pháp khác nhau
[5].
1.2.2.1. Các phương pháp thu nhận chế phẩm emym thô
■ Làm khô trực tiếp từ dịch môi trường bằng phưoTig pháp sấy phun.
Trong trường hợp này chế phẩm enzym có chứa toàn bộ chất khô có trong
môi trường. Chế phẩm nhận được ở dạng bột khô.
■ Cô đậm dịch môi trường dưới áp suất giảm. Dùng phương pháp này
nhận được chế phẩm enzym ở dạng nước. Trong quá trình cô đặc, hoạt độ

protease có bị giảm một ít nhưng cũng loại được một số tạp chất [5], [22].
■ PhưoTig pháp kết tủa.
Kết tủa là phương pháp dựa trên nguyên tắc, enzym là một phức hợp
protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Trong quá trình kết tủa,
người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương.
Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong
dung dịch chứ không nằm trong phần tủa.
Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm
trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch [8].
15
Phương pháp kết tủa bằng muổỉ: Muối nồng độ cao có tác dụng với
phân tử nước bao quanh protein enzym và làm chuyển hóa điện tích làm thay
đổi tính hòa tan của enzym. Có thể dùng các muối NaCl, (NH4)2S04 , K 2 S O 4
để tủa protein - enzym. Tuy nhiên, trong công nghiệp enzym, người ta thường
dùng muối amoni Sulfat (NH4)2S04 [8],[10]. Nếu dùng (NỈỈ4)2S04 để kết tủa
enzym thường sử dụng ở nồng độ bão hòa 65%, chế phẩm nhận được có hoạt
độ khoảng 97% hoạt độ ban đầu [5],[22].
Phương pháp kêt tủa bằng dung môi hữu cơ: Khi cho dung môi hữu cơ
vào dung dịch enzym sẽ làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzym.
Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một
lượng lón nước, do đó protein - enzym bị kết tủa. Trong công nghiệp sản xuất
enzym, người ta thường sử dụng ethanol và aceton để kết tủa enzym. Khi tiến
hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý nhiệt độ. Do
enzym rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc
aceton, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzym phải làm lạnh cả dung
môi hữu cơ và dung dịch enzym. Người ta thường tiến hành kết tủa enzym
bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ 3 - 10°c. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi
hữu cơ dùng để kết tủa enzym được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại
enzym và từng nồng độ enzym có trong dung dịch enzym.
Phương pháp kết tủa enzym bằng polymer: Polymer được sử dụng rất

rộng rãi để kết tủa enzym cả trong nghiên CÚTJ và sản xuất theo quy mô công
nghiệp. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi
hữu cơ. Các polymer được sử dụng nhiều là polyethylenamine và
polyethylene glycol với những phân tử khác nhau. Trong công nghiệp người
ta thường sử dụng polymer khoảng 15 - 20% để kết tủa enzym [8].
16
1.2.2.2. Các phương pháp tinh sạch enzym
Enzym thường chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trong tế bào hoặc các cơ quan và
có lẫn nhiều tạp chất do đó việc tinh chế là rất cần thiết. Trong những trường
họp nhất định cần phải tinh chế enzym để sử dụng cho mục đích riêng như
papain tinh khiết để tách mô tế bào [7]; tinh chế Chymotrypsin để điều chế
thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù nề) hoặc dùng trong nghiên cứu [15’.
Protease có bản chất cấu tạo là protein do đó các phưoTig pháp tinh chế
enzym cũng là các phương pháp tinh chế protein. Nguyên lý tinh chế là dựa
vào tính chất lý hóa của enzym. Có ba phương pháp tinh sạch enzym đang
được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất:
- Phương pháp kết tinh.
- Phương pháp điện di.
- Phương pháp sắc ký.
■ Phưong pháp kết tinh
Bằng cách thay đổi mật độ điện tích, pH. Protein thường được tủa ở
điểm đẳng điện (pl) đặc trưng riêng của mỗi enzym hoặc kết họp dùng muối,
dung môi hữu cơ để kết tủa, tinh chế enzym. Thay đổi sự hydrad hóa cũng có
thể dẫn tới tủa enzym do làm thay đổi độ tan của protein, thường dùng các
muối vô cơ hay còn gọi là diêm tích.
■ Phương pháp điện di
Thường dùng để xác định độ tinh khiết của protein hơn là tinh chế. Dựa
vào sự khác nhau của mật độ điện, sự phân bố điện tích, hình dạng và kích
thước của các phân tử nên các protein khác nhau có độ di chuyển khác nhau.
Phương pháp này dùng để tách một protein ra khỏi protein khác [10 .

■ Phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhất để làm sạch
enzym. Các phương pháp sắc ký được tóm tắt trong bảng 1.4.
17
Bảng 1.4. Các phương pháp sắc ký
STT
Những phương pháp
Nguyên tăc
Mục đích tách
1
Sắc ký hấp thụ
Liên kêt bê mặt
Ai lực bê mặt
2 Săc ký phân bô
Phân bô cân băng
Phân cực
3
Săc ký trao đôi ion
Liên kêt ion Vật mang
4
Săc ký lọc gel
Khuêch tán qua lô lọc Kích thước phân tử
5 Săc ký kị nước
Hâp thụ đặc hiệu
Câu trúc phân tử
6
Săc ký đông hóa trị
Liên kêt đông hóa trị Phân cực
7
Săc ký tạo vòng kim loại

Tạo phức Câu tạo phân tử
8
Săc ký ái lực
Hâp thụ đặc hiệu
Câu trúc phân tử
Phương pháp sắc kỷ lọc gel: Theo phương pháp này, các gel được nạp
vào trong cột dùng để tách enzym. Trong lọc gel, các phân tử được tách ra
dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.
Phương pháp sắc ký trao đổi ỉon: Phương pháp này dựa trên sự tích điện
của phân tử protein [8]. Sử dụng các chất có khả năng trao đổi ion (cation
hoặc anion) làm chất giá. cần lựa chọn chất giá ưu nước có điện tích ngược
với điện tích trên protein. Rửa giải bằng cách thay đổi hàm lượng muối hoặc
pH của dung dịch, ưu điểm của phương pháp này là có thể dùng phân tách
riêng enzym trong một hỗn hợp protein. Có thể tái sắc ký để tăng độ tinh khiết
cho enzym [10].
Phương pháp sắc kỷ nước: Phương pháp này dựa trên sự tương tác của
các vùng kỵ nước của phân tử nước với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp
thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối. Phương pháp
này đặc biệt thích hợp đối với nhưng enzym đã được làm cô đặc trước đó
bằng phương pháp kết tủa với muối (NH4)2S0 4 .
,1 ' ì
18
Phương pháp sắc kỷ đồng hóa trị: Liên kết đồng hóa trị được tạo thành
giữa các protein ở trạng thái tĩnh [8’.
Phương pháp sắc kỷ ái lực: Tinh chế enzym dựa vào sự tạo phức hợp
hấp phụ lập thể. Đây là phương pháp đặc hiệu để phân biệt các enzym. Mỗi
enzym tạo phức họp hấp phụ với chất có tính đặc hiệu lập thể, phù hợp với
trung tâm hoạt động. Chất giá không tan gắn với nhóm đặc hiệu của enzym.
Khi di chuyển qua chất giá, vì tương tác với các nhóm đặc hiệu đó nên enzym
di chuyển chậm hơn các protein khác. Sau đó enzym được rửa giải khỏi cột

bằng cách thay đổi nồng độ ion, pH hoặc hằng số điện môi của dung môi rửa
giải [10].
Trong thực tế người ta đã sử dụng các phương pháp hòa tan - kết tủa,
hấp phụ, phương pháp trao đổi ion, lọc gel để thu các chế phẩm enzym:
papain, ficin, pancretin. Dùng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế trypsin,
Chymotrypsin [15].
1.3. Tổng quan về Mucor hiemalis
Bảng 1.5. Hệ thống phân loại khoa học của Mucor hiemalis
Giới
Nâm
Ngành
Zygomycota
Lớp
Zygomycetes
Phân lớp
Chưa xác định
Bộ
Mucorales
Họ
Mucoraceae
Giông
Mucor
Loài
M. hiemalis
- Phân lập: Thức ăn gia súc.
- Điều kiện nuôi cấy: