Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 4 (3 hydroxyimino 2 oxo 1 indolinyl) methylcinnamamid và một số dẫn chất

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



ĐÀO QUANG TÙNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA N-HYDROXY-4-(3-HYDROXYIMINO-2-
OXO-1-INDOLINYL)METHYLCINNAMAMID
VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2015









BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



ĐÀO QUANG TÙNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA N-HYDROXY-4-(3-HYDROXYIMINO-2-
OXO-1-INDOLINYL)METHYLCINNAMAMID
VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
DS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược




HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khoá luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành
với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám
ơn chân thành đến GS.TS. Nguyễn Hải Nam - Trưởng bộ môn Hóa Dược và
DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực
hiện khoá luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hoá -
Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã
luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.


Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên



Đào Quang Tùng

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 3
1.1.2. Phân loại các HDAC 3
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 5
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 7
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 7
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 9
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 10
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC . 10
1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 11

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17
2.1.1. Hóa chất 17
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.2.1. Tổng hợp hóa học 18
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 18

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.3.1. Tổng hợp hóa học 18
2.3.2. Thử tác dụng sinh học 19
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được 22
2.3.4. Nghiên cứu Docking 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. HÓA HỌC 23
3.1.1. Tổng hợp hóa học 23
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 30
3.1.3. Xác định cấu trúc 31
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 37
3.2.1. Thử hoạt tính sinh học 37
3.2.2. Đánh giá mức độ giống thuốc 39
3.2.3. Sơ bộ đánh giá khả năng tương tác với HDAC (docking) 41
3.3. BÀN LUẬN 40
3.3.1. Tổng hợp hóa học 41
3.3.2. Tác dụng sinh học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tuỷ cấp tính
AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ
13
C-NMR : Phổ cộng hưởng từ carbon (carbon nuclear magnetic
resonance)
CTCL : U tế bào lympho T dưới da (Cutaneous T cell lymphoma)
DCM : Dicloromethan
DHFR : Dihydrofolat reductase
DMF : Dimethylformamid
DMSO : Dimethyl sulfoxid
HAT : Histon acetyltransferase
HDAC : Histon deacetylase
1
H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic
resonance)
IC50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào giảm xuống một nửa
IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
MeOH : Methanol
MS : Phổ khối lượng
NSCLC : Ung thư phổi tế bào tế bào không nhỏ (non-small lung cell)
NST : Nhiễm sắc thể
PC-3 : Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt
SAHA : Acid sulberoylanillid hydroxamic
SRB : Sulforhodamin B
SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng

TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
T
o
nc
: Nhiệt độ nóng chảy
TSA : Trichosatin A

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng Trang

1
B
ả
ng 1.1:
Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm trên
lâm sàng 8
2
B
ả
ng 1.2:
Một số acid hydroxamic mới mang khung

benzimidazol 12
3
B
ả
ng
1.3:

Hoạt tính một số acid hydroxamic mang khung

3-oximisatin 13
4
B
ả
ng
1.4:
Cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC và DHFR của
2 dẫn chất acid hydroxamic khung acid folic (IC
50
, µM) 16
5
B
ả
ng 3.1
:
Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid
hydroxamic từ ester 29
6
B
ả
ng 3.2
:
Giá trị R
f
và nhiệt độ nóng chảy (t
o
nc
) cuả các chất

3a-d
30
7
B
ả
ng 3.3
:
Kết quả phân tích phổ IR của các chất
3a
-
d
31
8
B
ả
ng 3.4
:
Kết quả phân tích phổ MS của các chất
3a
-
d
33
9
B
ả
ng 3.
5
:
Kết quả phân tích phổ
1

H-NMR của các chất
3a
-
d
34
10
B
ả
ng 3.6
:
Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
3a
-
d
36
12
B
ả
ng 3.7
:
Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các chất
3a-d
38
13
B
ả
ng 3.8
:

Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
14
B
ả
ng 3.9
:
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất
3a
-
d

theo quy tắc Lipinsky 39
11
B
ả
ng

3.
10
:
Kết quả docking của các chất
3a
-
d
với HDAC2

41
15
B
ảng 3.11:

So sánh hoạt tính kháng tế bào ung thư 3a-d và
IIIa,d,f
44





DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình Trang

1
Hình
1.1
: Cấu trúc của lõi histon với các vị trí ε-N acetyl
lysin ở mạch nhánh 2
2
Hình 1.2:
Vai trò cân bằng động của HDAC và HAT 3
3
Hình 1.3:
Mô tả đặc điểm của các loại HDAC “kinh điển” 4
4
Hình 1.4:
Các chất ức chế HDAC và nồng độ ức chế HDAC 9
5
Hình 1.5:
Liên kết giữa SAHA và trung tâm hoạt động của

HDAC 10
6
Hình 1.6:
Cấu trúc một số dẫn chất N-hydroxy-3-phenyl-2-
propenamid 14
7
Hình 3.1:
Đánh giá mức độ ức chế HDAC theo phương pháp
Western blot 38
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT
Tên sơ đồ Trang
1
Sơ đ
ồ

3.1:
Quy trình tổng hợp chung 23
2
Sơ đ
ồ

3.2:
Sơ đồ tổng hợp chất
2a
23
3
Sơ đ
ồ

3.
3:
Sơ đồ tổng hợp chất
3a

24
4
Sơ đ
ồ

3.4:
Sơ đồ tổng hợp chất

2b

26
5
Sơ đ
ồ

3.5:
Sơ đồ tổng hợp chất

3b

26
6
Sơ đ
ồ

3.6:
Sơ đồ tổng hợp chất

2c

27
7
Sơ đ
ồ

3.7:
Sơ đồ tổng hợp chất

3c

28
8
Sơ đ
ồ

3.8:
Sơ đồ tổng hợp chất

2d

28
9
Sơ đ
ồ

3.9:
Sơ đồ tổng hợp chất

3d

29

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza
®
,
2006) là chất ức chế histon
deacetylase đầu tiên được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-
FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T. Sau đó, năm 2009
depsipeptid (Romidepsin
®
) một chất ức chế HDAC khác cũng được FDA cấp
phép trong điều trị ung thư tại Mỹ. Như vậy có thể thấy, HDAC là một mục
tiêu phân tử quan trọng trong điều trị ung thư và các chất ức chế HDAC là các
tác nhân chống ung thư đầy triển vọng.
Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội đã thiết
kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt
tính kháng tế bào ung thư tốt [1,2,4]. Các nghiên cứu gần đây tại bộ môn về
các acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy khi thiết kế nhóm
nhận diện bề mặt của của các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC bằng
vòng thơm như 3-hydroxyimino-2-oxoindolin cho hoạt tính in vitro rất khả
quan [4]. Hơn nữa, một số nghiên cứu cho thấy việc thay đổi cầu nối mạch
thẳng của acid hydroxamic bằng cầu nối có chứa nhân thơm mang lại hoạt

tính kháng tế bào ung thư cao đồng thời tạo được hợp chất có xu hướng ức
chế chọn lọc trên HDAC [9]. Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi thiết
kế các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin
với cầu nối 3-phenyl-2-propenamid và tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác
dụng sinh học của N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-
indolinyl)methylcinnamamid và một số dẫn chất” với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methyl
cinnamamid và 3 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp
được.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
Quá trình dịch mã ở tế bào eukaryota bị ảnh hưởng bởi trạng thái xoắn của
ADN [36]. Ở các tế bào trong pha nghỉ, ADN ở trạng thái đóng xoắn để ngăn
sự tiếp cận của các yếu tố dịch mã. ADN được gắn vào chromatin, một phức
hợp protein - ADN có cấu trúc động và tính tổ chức cao. Đơn vị cấu trúc cơ
bản của chromatin là nucleosom, gồm một octamer hình đĩa của bốn lõi histon
(1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) được bao quanh bởi 146 cặp ADN
[36,38] (hình 1.1):

Hình 1.1: Cấu trúc của lõi histon với những vị trí ε-N acetyl lysin ở mạch
nhánh
Sự có mặt của các phân tử lysin bị acetyl hóa ở đuôi histon dẫn đến việc
xuất hiện nhiều chromatin ở dạng tháo xoắn và kích hoạt quá trình dịch mã
gen, trong khi sự deacetyl hóa ở phần đuôi lysin sẽ tạo nhiều chromatin ở
trạng thái đóng xoắn và hạn chế quá trình dịch mã gen. Quá trình deactyl hóa

histon sẽ làm tăng tương tác ion giữa đầu amin tích điện dương của histon và
nhóm phosphat mang điện âm trên ADN khiến cho chromatin ở trạng thái
đóng xoắn và làm ức chế quá trình dịch mã gen và tổng hợp protein. Mức độ
acetyl hóa histon là kết quả của sự cân bằng trong hoạt động của hai enzym

3

histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC)
[18,20,31,35,40].
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase
HDAC là một nhóm các enzym được phát hiện ở nhiều loại sinh vật như vi
khuẩn, nấm, thực vật và động vật, có tác dụng xúc tác quá trình loại bỏ nhóm
acetyl từ ε-N-acetyl lysin amino acid của nhiều cơ chất protein, trong đó có
histon. HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT) - enzym
xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến ε-amino của lysin ở đầu
N của histon [12,45] (hình 1.2):

Hình 1.2: Vai trò cân bằng động của HDAC và HAT
1.1.2. Phân loại các HDAC
Có 18 loại HDAC ở động vật có vú đã được nhận biết và chia thành 4
nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc của chúng với HDAC của nấm men
(hình 1.3) [12,35,36]:
Nhóm I: gồm HDAC 1, 2, 3 và 8; có cấu trúc tương đồng với Rpd3 trong
nấm men và nằm trong nhân.
Nhóm II: gồm HDAC 4, 5, 6, 7, 9 và 10; có cấu trúc tương đồng với Hda1
của nấm men và có thể được chia thành hai phân nhóm:
Phân nhóm IIa: gồm HDAC 4, 5, 7 và 9.
Phân nhóm IIb: gồm HDAC 6 và 10.
Nhóm III: Gồm các protein điều hòa chuỗi truyền thông tin:

4

- Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7).
Nhóm IV: HDAC 11, có cấu trúc tương đồng với cả nhóm I và II.
Các HDAC nằm trong nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC “kinh điển”
trong khi các HDAC thuộc nhóm III được gọi là các sirtuin [36]. Các HDAC
“kinh điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau. Các enzym có bản chất
phụ thuộc Zn
2+
như cofactor (HDAC nhóm I, II và IV) đều có một vị trí xúc
tác với một ion Zn
2+
ở đáy túi. Vì vậy, các enzym này bị ức chế bởi các hợp
chất có khả năng tạo phức chelat với Zn
2+
như acid hydroxamic (vorinostat,
trichosatin A), thiol

Các sirtuin có cấu trúc tương đồng với protein Sir2 của
nấm men và chứa enzym phụ thuộc NAD
+
thay vì Zn
2+
nên chúng không nhạy
cảm với các hợp chất tạo phức chelat với Zn
2+
[35,36]. Thuật ngữ các chất ức
chế HDAC thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm mục tiêu vào các
HDAC kinh điển và những hợp chất này đang được đánh giá dựa trên các thử

nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau.

Hình 1.3: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC “kinh điển”

5

1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC
Sự thay đổi đuôi N tận của protein histon đóng vai trò quan trọng trong
việc quyết định mức độ xoắn của gen và quá trình biểu hiện gen. Trong số các
thay đổi đó, sự acetyl hóa có hồi phục ở gốc lysin được nghiên cứu nhiều
nhất. HAT xúc tác vận chuyển gốc acetyl đến gắn vào vị trí ε-N lysin của đuôi
histon nhờ acetyl-CoA dẫn tới việc trung hòa điện tích của protein histon, từ
đó làm cho NST được tháo xoắn và kích hoạt biểu hiện gen. Ngược lại,
HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ protein histon cũng như protein không phải
histon (p53, hsp90 hay tubulin) làm cho NST ở trạng thái đóng xoắn và ức
chế quá trình dịch mã. Vì vậy, việc acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai
trò quan trọng trong biểu hiện gen cũng như hoạt hóa quá trình dịch mã [42].
Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn tới những bất
thường về biểu hiện gen và có thể dẫn tới ung thư.
HDAC đã được xác định là rối loạn điều hòa trong ung thư. Qua những
nghiên cứu về vai trò của HDAC trong ung thư, nhiều cơ chế về hoạt động
của HDAC trong bệnh ung thư đã được phát hiện. Tuy nhiên, phần lớn nghiên
cứu tập trung vào sự huy động bất thường của HDAC vào chuỗi điều hòa của
gen đích thông qua sự tương tác với protein gắn kết, dẫn tới sự chuyển vị
nhiễm sắc thể và tạo ra những khối u ác tính huyết học, ví dụ như trong bệnh
bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL). Đặc điểm di truyền đặc trưng của APL là sự
chuyển vị nhiễm sắc thể dẫn tới việc sản xuất ra các protein gắn kết giữa α-
RAR (retinoic acid receptor-α) với PML (promyelocytic leukemia), PLZF
(promyelocytic zinc finger) hoặc một số protein khác. Các phức hợp protein
gắn kết này sẽ gắn với các yếu tố phản hồi retinoic acid (RAREs - retinoic

acid-responsive elements) và huy động phức hợp ức chế HDAC có ái lực cao,
từ đó tăng methyl transferase histon và ức chế tế bào tủy xương tăng sinh và
biệt hóa [23]. Vì vậy, HDAC là yếu tố quyết định trong việc phát triển của

6

APL. Phức hợp protein gắn kết AML1-ETO được tìm thấy trong bệnh bạch
cầu tủy bào cấp (AML) cũng có cơ chế tương tự phức hợp α-RAR/PML và α-
RAR/PLZF [43]. Trong bệnh u tế bào lympho B, gen BCL-6 (B-cell
lymphoma 6) bị hoạt hóa và tăng biểu hiện gen do huy động các phức hợp
chứa enzym HDAC. Sự tăng biểu hiện gen BCL-6 được phát hiện ở 40% số
trường hợp u lympho tế bào B lớn khuếch tán [30]. Những sự thay đổi được
mô tả ở trên không liên quan tới những thay đổi đặc trưng của biểu hiện gen
HDAC. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra một số thay đổi của các
HDAC nhất định trong một số mẫu khối u. Ví dụ, trong các bệnh ung thư
carcinom ở dạ dày, tuyến tiền liệt, đại tràng và vú có sự gia tăng biểu hiện
HDAC1 [8,15,44,48]. Sự gia tăng biểu hiện của HDAC2 được tìm thấy trong
ung thư carcinom ở dạ dày, cổ tử cung và đại trực tràng [17,37,49]. Một số
nghiên cứu khác tìm thấy nồng độ cao HDAC3 và HDAC6 lần lượt ở ung thư
đại tràng và ung thư vú [44,47]. Hơn nữa, tác dụng deacetyl hóa của HDAC
không chỉ giới hạn ở các protein histon mà còn có tác dụng trên các protein
không phải histon. Ví dụ như HDAC1 có khả năng tương tác và deacetyl hóa
yếu tố ức chế ung thư p53, làm giảm sự ổn định và hoạt hóa protein điều hòa,
từ đó gây ra các thay đổi trong các quá trình phân chia tế bào và chết tế bào
theo chương trình [21,26].
Các ví dụ trên cho thấy sự ức chế dịch mã của các gen ức chế ung thư
thông qua sự biểu hiện và huy động quá mức HDAC tới vùng điều hòa của
chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình khởi phát và phát triển của ung
thư. Ngoài ra, nghiên cứu của Peinado và cộng sự (2004), Christofori và
Semb (1999) và Hajra và Fearon (2002) trên yếu tố dịch mã Snail và yếu tố

điều hòa E-cadherin cho thấy việc huy động HDAC đến các yếu tố điều hòa
trên có thể đóng vai trò quan trọng trong việc xâm lấn và di căn các tế bào
ung thư [10,14,31].

7

Như vậy, sự gia tăng của HDAC ảnh hưởng tới quá trình phiên mã và dịch
mã các yếu tố điều hòa gây ra ung thư và có thể kiểm soát bằng cách ức chế
hoạt động của HDAC. Các chất ức chế HDAC đã và đang được các nhà khoa
học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc
từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư.
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Quá trình phát triển các chất ức chế HDAC tổng hợp được bắt nguồn từ
việc phát hiện sự ức chế tăng trưởng và biệt hóa tế bào trên chuột của
dimethyl sulfoxid (DMSO) từ trước khi hoạt động của HDAC được tìm ra
[12,27,28]. Cho đến nay, nhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC đã được
tìm ra, trong đó chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất là Trichosatin A
(TSA), một sản phẩm lên men của nấm men Streptomyces. TSA thuộc nhóm
acid hydroxamic và có tác dụng ức chế HDAC in vitro ở nồng độ cỡ nano
mol. Tuy nhiên, do việc sản xuất TSA lại tốn kém và đạt hiệu suất thấp (20
bước, hiệu suất 2%) nên việc tổng hợp các chất ức chế HDAC mới là rất quan
trọng [36]. Hiện nay, đã có 2 chất ức chế HDAC được FDA cấp phép lưu
hành trên thị trường để điều trị u lympho tế bào T dưới da là SAHA
(vorinostat, Zolina
®
) và Romidepsin (Istodax
®
). Ngoài ra, còn 1 số hợp chất
khác đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng ở các pha khác nhau (hình

1.4) và được chia làm 4 nhóm theo cấu trúc (bảng 1.1) [12].







8

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm trên lâm sàng
Hợp chất Pha IC
50
in
vitro
Loại ung thư
Acid hydroxamic
Vorinostat
II-III (p.o)

µM/nM NSCLC, ung thư phần đầu, cổ.
Pabinostat
(LBH589)
I-III
(IV, p.o.)
nM
CTCL, u lympho không phải
Hodgkin, bệnh hồng cầu hình
liềm, ung thư tuyến tiền liệt, ung
thư phổi tế bào nhỏ

Belinostat
(PXD101)
I-II
(IV, p.o.)
nM ung thư buồng trứng, CTCL.
PCI-24781 I-II (p.o.) µM/nM Sarcoma, u lympho.
Givinostat I-II (p.o.) nM
U lympho Hodgkin, bệnh bạch
cầu hoặc u tủy xương tái phát.
Resminostat II (p.o.) nM
U lympho Hodgkin, u carcinom
tế bào gan, ung thư đại trực
tràng.
Benzamid
Etinostat I-II (p.o.)
µM
(thời
gian bán
thải dài)
U lympho Hodgkin, ung thư da,
ung thư phổi, ung thư vú.
Mocetinostat I-II (p.o.) µM nhiều loại ung thư
Chidamide II (p.o.) nM
NSCLC, ung thư vú, ung thư
tuyến tiền liệt
Peptid vòng
Romidepsin II-III (IV) nM
u tế bào vỏ tái phát, u tế bào
lympho không phải Hodgkin
Acid béo mạch ngắn

Acid valproic
II-III
(p.o.)
mM/µM
ung thư buồng trứng, cổ tử cung,
bệnh bạch cầu, u lympho, ung
thư đầu, cổ, u tuyến giáp
natri
phenylbutyrat
II (p.o.) mM u lympho, u rắn.
Pivanex (AN-9) I-II (IV) mM
bệnh bạch cầu, u lympho, ung
thư da.
Nhóm khác
ACY-1215 I (p.o) Đa u tủy xương.
Ghi chú: IV: đường tiêm tĩnh mạch, p.o.: đường uống, NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ,
CTCL: u lympho da tế bào T.

9

Các hợp chất có cấu trúc khác nhau sẽ ức chế các HDAC khác nhau: các
acid hydroxamic ức chế không chọn lọc trên tất cả các nhóm HDAC, các hợp
chất benzamid như etinostat (MS-275) ức chế nhóm I và các hợp chất acid
béo mạch ngắn như acid valproic hay butyrat ức chế 2 nhóm I và IIa. Ngoài
ra, các hợp chất có cấu trúc chọn lọc như tubacin, mocetinostat, và PC-34501
có khả năng ức chế chọn lọc lần lượt HDAC6, -1 và -8.

Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC và nồng độ ức chế HDAC của chúng
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC gồm 3 phần chính [12]:

- Nhóm liên kết với Zn (Zinc-binding group - ZBG): tương tác với Zn
2+
ở
trung tâm hoạt động của HDAC như acid hydroxamic, dẫn chất benzamid,
thiol, sulfamid, triflouromethyl ceton hay trithiocarbonat.
- Vùng cầu nối sơ nước: có thể là alkyl mạch thẳng, gốc vinyl hoặc gốc aryl
có chức năng liên kết nhóm khóa hoạt động với nhóm liên kết với Zn
2+
. Vùng

10

cầu nối sơ nước giúp hợp chất có khả năng nằm trong kênh enzym và tương
tác với các thành phần nằm trên kênh enzym.
- Nhóm khóa hoạt động (capping group): đặc trưng cho việc ức chế chọn
lọc HDAC, vùng này không chỉ gắn với HDAC mà còn gắn với các phức hợp
gần vị trí hoạt hóa.
- Một số cấu trúc còn chứa một nguyên tố xoắn (đơn vị liên kết -
connecting unit) để liên kết vùng cầu nối sơ nước với nhóm khóa hoạt động.
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế
HDAC
Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đã
được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA (hình 1.5).

Hình 1.5: Liên kết giữa SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC
Hiện nay, các cấu trúc tương tự SAHA đều gồm 3 phần chính có liên quan
đến tác dụng như sau [7,9]:
- Nhóm khóa hoạt động: liên quan tới hiệu lực của enzym HDAC, thường

là các aryl hoặc các vòng thơm khác. Nghiên cứu cho thấy vòng thơm lớn cho

11

tác dụng tốt hơn vòng nhỏ và việc gắn các nhóm thế kỵ nước vào vị trí para
của vòng benzen trên nhóm khóa hoạt động có thể làm tăng mức độ hoạt động
ức chế enzym HDAC của các chất.
- Cầu nối: liên kết nhóm khóa hoạt động với nhóm liên kết với Zn
2+
về mặt
cấu trúc và có ảnh hưởng tới hiệu lực và mức độ đặc hiệu của enzym HDAC.
Nhóm cầu nối thường là các hydrocarbon mạch thẳng với nhiều độ dài khác
nhau hoặc có thể là các mạch hydrocarbon chưa bão hòa và có thể được gắn
thêm nhân thơm hoặc vòng cyclohexyl. Nghiên cứu cho thấy độ dài tối ưu của
cầu nối này là từ 6 đến 8 nguyên tử [9].
- Nhóm liên kết với Zn
2+
: là acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để
có tác dụng ức chế HDAC. Khi tiến hành thử hoạt tính ức chế HDAC, dẫn
chất acid carboxylic có hoạt tính rất thấp trong khi các dẫn chất acid
hydroxamic đều cho hoạt tính tốt.
1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới
1.3.2.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
- Các acid hydroxamic mang khung benzimidazol và khung tương tự MS-
275
Các acid hydroxamic tương tự SAHA được thay thế nhóm khóa hoạt động
bằng khung benzimidazol và các vòng thơm 4-((2-aminophenyl)carbamo-
yl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-
carbamoyl)phenyl tương tự MS-275, một chất thuộc nhóm benzamid đang
được tiến hành thử nghiệm trên lâm sàng, đã được nhóm nghiên cứu Zhang

Q.W và cộng sự (2013) tổng hợp và thử hoạt tính in vitro thành công. Kết quả
cho thấy các chất tổng hợp được đều có tác dụng ức chế enzym HDAC mạnh
hơn SAHA và MS-275 (bảng 1.2) [46].




12

Bảng 1.2: Một số acid hydroxamic mới mang khung benzimidazol
N
H
N
NH
OH
O
R
NH
OH
O
NH
O
NH
O
R
I
II

Chất R
% hoạt động HDAC bị ức chế in vitro

31,25 µM 1,95 µM 0,49 µM
Ia
H 100,10 96,41 87,92
Ib
OCH
3
99,94 97,36 89,77
Ic
Cl 99,96 98,88 94,39
Id
NO
2
100,22 97,32 90,72
Ie
NH
2
97,72 95,07 88,44
IIa
NH
2

97,53 79,83 54,44
IIb
N
NH
2

96,97 80,86 57,75
IIc
N

NH
2

96,96 76,44 49,45
MS-275
53,98 25,69 8,51
SAHA
94,86 59,32 28,62

Các kết quả trên cho thấy khi thay nhóm khóa hoạt động của SAHA bằng
các nhân thơm khác có khối lượng phân tử lớn đặc biệt là các vòng thơm có
chứa dị tố đều làm tăng hoạt tính ức chế HDAC mạnh hơn SAHA nhiều lần.

13

Trong nghiên cứu trên, khi thay thế nhóm khóa hoạt động phenyl của SAHA
bằng các khung 4-((2-aminophenyl)carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-
carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-carbamoyl)phenyl tương tự MS-275
tác dụng ức chế enzym HDAC in vitro đã được tăng lên đáng kể. Điều này
cho thấy có thể các dẫn chất acid hydroxamic có khả năng ức chế enzym
HDAC cao hơn benzamid do cấu trúc của nhóm gắn kẽm. Tuy nhiên, do các
dẫn chất benzamid có tác dụng kéo dài (thời gian bán thải dài) nên các hợp
chất acid hydroxamic vẫn chưa thể hiện sự vượt trội so với benzamid.
- Các acid hydroxamic với khung 3-oximisatin và cầu nối mạch thẳng
Nhóm nghiên cứu của Nam N.H. và cộng sự (2013) đã thiết kế và tổng hợp
thành công các acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là bộ khung 3-
hydroxyimino-2-oxoindolin và cầu nối heptanamid có độ dài 7 carbon. Bảy
chất tổng hợp được tiến hành thử tác dụng ức chế enzym HDAC và hoạt tính
kháng các dòng tế bào ung thư in vitro. Kết quả thử hoạt tính 7 chất trong
nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.3 [29].

Bảng 1.3: Hoạt tính một số acid hydroxamic mang khung 3-oximisatin
N
NH
OH
O
N
O
OH
R
III

Chất R
Hoạt tính
ức chế
HDAC
Độc tính tế bào (IC
50
, µM)
SW620 PC-3 AsPC-1
IIIa -H + 0,64 0,98 1,10
IIIb 5-F + 0,11 2,73 1,72
IIIc 5-Cl + 0,65 0,85 1,86
IIId 5-Br + 0,29 2,21 0,08
IIIe 5-NO
2

+ 3,39 19,69 4,68
IIIf 5-CH
3
+ 0,99 0,62 2,44

IIIg 7-Cl + 1,05 1,57 1,82
SAHA + 3,70 4,31 3,66
Ghi chú:
1
Khả năng ức chế hoàn toàn hoạt động deacetyl hóa của enzym HDAC ở nồng độ 10
µg/mL;
2
Nồng độ tối thiểu của các chất để có tác dụng ức chế 50% sự phát triển của tế bào.

14

Kết quả trên cho thấy bảy chất tổng hợp được đều ức chế HDAC ở nồng độ
10 µg/mL cũng như có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh trên các dòng tế
bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1 so với chất đối chiếu là SAHA. Điều
này cho thấy việc thay thế khung 3-hydroxyimino tại vị trí khóa hoạt động đã
mang lại hoạt tính tốt cho các dẫn chất acid hydroxamic mới.
1.3.2.2. Thay đổi cầu nối
Các nghiên cứu về tổng hợp các chất ức chế HDAC chủ yếu tập trung vào
thay đổi nhóm khóa hoạt động. Cầu nối của các chất được tổng hợp trong
những năm gần đây đều có xu hướng giữ cầu nối là carbon mạch thẳng với 5-
6 carbon như của SAHA. Một số hướng nghiên cứu mới bao gồm gắn các
nhóm thế như methyl, ω-alkoxy, β-lactam vào các vị trí trên nhóm thế hay tạo
các amid ngược của SAHA đã mang lại nhiều chất có tác dụng sinh học tốt
[9,16,39]. Một hướng nghiên cứu khác là thay thế cầu nối mạch thẳng bằng
cầu nối có chứa nhân thơm tương tự PXD-101 - một acid hydroxamic đang
được thử nghiệm lâm sàng.
- Nghiên cứu của Remiszewski và cộng sự (2003) về tổng hợp các dẫn chất
N-hydroxy-2-propenamid
N
R

1
R
2
NH OH
O
N
NH OH
O
NH
OH
NVP-LAQ824

Hình 1.6. Cấu trúc một số dẫn chất N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid
Các tác giả đã tổng hợp được 1 dãy các chất N-hydroxy-3-phenyl-2-
propenamid có tác dụng ức chế enzym HDAC. Các chất này đều có tác dụng
mạnh trên enzym HDAC (IC
50
< 0,4 µM). Hơn nữa các chất này đều có tác
dụng mạnh trên 2 dòng ung thư carcinom ở người (IC
50
< 0,75 µM). Đặc biệt,

15

khi được tiến hành thử nghiệm liều - đáp ứng trên dòng tế bào ung thư đại
tràng HCT116 và ung thư phổi A549, chất NVP-LAQ824 thể hiện tác dụng
tốt và đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng vào năm 2002 [34].
1.3.3.3: Thay đổi cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt
- Các chất ức chế HDAC có cấu trúc acid folic-acid hydroxamic
Nghiên cứu của Carrasco M.P. và cộng sự (2011) đã thiết kế và tổng hợp

thành công các dẫn chất acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là
methotrexat (MTX) và acid folic đồng thời thay đổi phần cầu nối dài có chứa
mạch thẳng và nhân thơm. Các chất tổng hợp được có tác dụng ức chế không
chỉ enzym HDAC mà còn có thể kháng dihydrofolat reductase (DHFR), 2
enzym đích đóng vai trò quan trọng trong phát triển thuốc chống ung thư. Cấu
trúc và hoạt tính trên HDAC và DHFR của 2 chất có tác dụng mạnh nhất
được trình bày trong bảng 1.4 [6].
Hai chất khác mang khung folat khác cũng được tổng hợp trong nghiên cứu
trên, tuy nhiên hoạt tính kháng HDAC và DHFR của hai dẫn chất này không
cao. Nghiên cứu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới là thay thế các
nhóm thế đã có sẵn tác dụng ức chế tế bào ung thư trên đích khác HDAC vào
vị trí nhóm khóa hoạt động cùng với cấu trúc của HDAC.













16

Bảng 1.4: Cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC và DHFR của 2 dẫn chất acid
hydroxamic khung acid folic (IC
50

, µM)
N
N
N
NNH
2
NH
2
N
CH
3
NH
O
NH
(CH
2
)
5
NH
OH
O
OH
COOH
IV
N
N
N
NNH
2
OH

N
H
NH
O
NH
(CH
2
)
5
NH
OH
O
OH
COOH
V

Chất
IC
50
(µM)
(1)

HDAC8
người
HDAC chiết
từ HeLa
L. casei
DHFR
PC-3
Methotrexat-caproic

hydroxamic acid (IV)
29 ± 5 5,7 ± 0,2 0,25 0,6
Folat-pABA-caproic
hydroxamic acid (V)
6,6 ± 0,8 0,88 ± 0,08 20 7
TSA
1 0,005 - -
Methotrexat
- - 0,005 0,0001
Ghi chú:
1
Nồng độ tối thiểu các chất ức chế 50% sự phát triển của tế bào.
Các nghiên cứu trên có thể mở ra xu hướng mới là thay thế nhóm cầu nối
mạch thẳng bằng cầu nối có chứa nhân thơm bên cạnh việc tìm kiếm các
nhóm khóa hoạt động có cấu trúc mới, đặc biệt là các nhóm đã được nghiên
cứu có hoạt tính kháng ung thư cao, để tạo ra các dẫn chất acid hydroxamic có
tác dụng sinh học tốt và là các thuốc kháng ung thư trong tương lai.
Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy acid hydroxamic là nhóm chất có
khả năng ức chế HDAC tốt, một số chất có khả năng gây độc tế bào ở nồng
độ rất thấp. Tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC
đang là một hướng nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tìm kiếm
các hợp chất có tác dụng kháng tế bào ung thư chọn lọc và có hiệu quả điều
trị cao.

17

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất

Các hóa chất dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này
được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
 Các isatin
- isatin
- 5-methylisatin
- 5-methoxyisatin
- 7-cloroisatin
 methyl 3-[4-(bromoethyl)
phenyl]prop-2-enoat
 hydroxylamin hydroclorid
Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF), aceton,
dicloromethan, acid acetic, ethanol, methanol, NaOH, HCl, nước cất, FeCl
3
.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 mL có nút mài,
bình nón, pipet, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-200.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.
- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm.
- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ
Agilent 6310 Ion Trap
để ghi phổ MS.
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ
1

H-NMR và
13
C-NMR.