Tổng quan về asparaginase ứng dụng làm thuốc điều trị ung thư

p
B ộ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
m
LÊ ANH TUẤN
TỎNG QUAN VÈ ASPARAGINASE
ỨNG DỤNG LÀM THUỐC ĐIÈU TRỊ
UNG THƯ
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2005-2010)
Người hướng dẫn : 1. GVC. Nguyễn Duy Thiệp
2. TS. Nguyễn Văn Rư
Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa sinh
\
HÀ NỘI-2010
m
LỜI CẦM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
Giảng viên chỉnh Nguyễn Duy Thiệp bộ môn Hóa sinh trường đại học
Dược Hà Nội.
Tiến sĩ Nguyễn Văn Rư Chủ nhiệm bộ môn Hóa sình trường Đại học
Dược Hà Nội.
Là hai người thầy đã tận tâm dìu dắt em trong học tập và nghiên cứu
cũng như trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xỉn trân trọng cảm ơn:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Lập và Dược sĩ Nguyễn Xuân Bẳc đã giúp đỡ,
truyền đạt kỉnh nghiệm để em cỏ thể hoàn thành luận văn này.
Em xỉn chân thành cảm ơn:
Toàn thể các thầy cô giảo trường đại học Dược Hà Nội cũng như các
thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện cho em
trong suốt quá trình nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè những người đã giúp đờ, động

viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Lê Anh Tuấn
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ề 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 .Đặc điểm nguồn gốc, cấu trúc và vai trò 3
1.1.1 .Tên và vị trí trong hệ thống phân loại enzyme của Asparaginase

3
1.1.2.Nguồn gốc tự nhiên của Asparaginase

4
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của Asparaginase 7
1.1.4. Một số tính chất và vai trò của Asparaginase

12
1.2. ứng dụng Asparaginase trong điều trị ung thư bạch cầu cấp tính dòng
lympho (acute lymphoblastic leukemia - ALL)
13
1.2.1. Sơ lược về hệ thống tế bào m áu 13
1.2.2. Khái quát về bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho 14
1.2.3. Các thuốc điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng lympho

22
1.2.4. Một số thông tin lâm sàng của Asparaginase dược dụng

24

1.3. Tạo chế phẩm Asparaginase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

34
1.3.1. Giới thiệu khái quát về công nghệ DNA tái tổ hợp

34
1.3.2. Tóm tắt quy trình sản xuất Asparaginase bằng công nghệ DNA tái
tổ hợp 36
CHƯƠNG 2: BÀN LUẬN 43
2.1. về ứng dụng Asparaginase trong điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng
lympho 43
2.1.1. u ’u nhược điểm của Asparaginase trong hiệu quả điều trị ung thư
bạch cầu cấp dòng lympho 43
2.1.2. So sánh Asparaginase tự nhiên và Asparaginase được polyethylene
glycol hóa 45
2.2. về sản xuất Asparaginase và công nghệ DNA tái tổ họp
50
2.3. HưÓTig ứng dụng công nghệ DNA để sản xuất các protein, enzyme trị
liệu ở Việt Nam 52
KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55
DANH MỤC
Aa
ADR
ALL
Asparaginase
BAL
BMT
BN
CSF
DNA

FDA
GI
GST
IM
IPTG
IU
IV
MCS
MLL
NCI
NMCT
PBSCT
CHŨ VIÉT TẮT
: Acid amine
; Adverse Drug Reaction (Tác dụng không mong
muốn)
: Acute Lymphoblastic Leukemia (Ung thư bạch cầu
cấp dòng lympho)
: L-asparaginase
: Biphenotypic acute Leukemia (Bạch cầu cấp có
kháng nguyên bề mặt của cả lympho B và T )
; Bone marrow transplant (Cấy tủy xương)
: Bệnh nhân.
: Cerebrospinal Fluid (Dịch não tủy)
; Deoxyribonucleic acid
: Food and Drug Administration (Cơ quan giám sát
dược phẩm và lương thực Hoa Kỳ)
: Gastrointestinal
; Glutathion sulfur transferase.
: Intramuscular (Tiêm bắp)

: Isopropylthio- ß- galactoside
: International Unit (Đơn vị quốc tế)
: Intravencular (Tiêm tĩnh mạch)
: Multicloning sites. (Điểm sao chép đa dòng)
; Mixed lineage Leukemia
; National Cancer Institute (Viện nghiên ung thư quốc
gia Hoa Kỳ)
: Nhồi máu cơ tim
: Peripheral blood stem cell transplant (Cay te bào
SEER
WHO
x-gal
Yeu tố đông
máu IX
Yếu tố đông
máu V
Yếu tố đông
máu VII
Yếu tố đông
máu VIII
RNA
gốc máu ngoại vi)
: Ribonucleic acid
: The Surveillance, Epidemiology, and End Results
(TỔ chức điều tra dịch tễ học Hoa Kỳ)
; World Health Organisation (Tổ chức Y tế thế giới)
: 5-bromo 4-cloro 3-indolyl P"D galactopyranoside
: Christmas
: Proaccelerin
: Proconvertin

: Yếu tố chống hemophilia A
DANH MỤC BẢNG
•
Bảng 1.1 : Tỷ lệ mắc ALL và tỷ lệ tử vong theo độ tuổi
15
Bảng 1.2 : Sự phân loại của FAB theo hình thái tế bào 16
Bảng 1.3 : Các type ALL và tỷ lệ mắc 17
Bảng 1.4 : So sánh giữa 3 loại Asparaginase 46
Bảng 1.5: So sánh giữa 3 loại Asparaginase về thời gian bán thải 47
và thải trừ ! 47
Bảng 1.6: So sánh tỷ lệ gặp ADR của Pegaspargase và Asparaginase tự nhiên
49
Bảng 1.7 : Các mức độ phản ứng dị ứng 49
Bảng 1.8; Một số sản phẩm được sản xuất theo công nghệ

52
DNA tái tổ họp 52
Bảng 1.9: Một số sản phẩm đã hết hạn patent
54
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 : Phản ứng Asparaginase cắt liên kết nhóm amino và carbon của
Asparagin 3
Hình 1.2: Phân loại Asparaginase 4
Hình 1.3 :Sơ đồ sinh vật có Asparaginase type vi khuẩn

1
Hình 1.4; Sơ đồ sinh vật có Asparaginase type thực vật

1

Hình 1.5; Chuỗi acid amin của Asparaginase
8
Hình 1.6 : Sơ đồ mô tả cấu trúc của EcA II (hình ảnh từ NCBI)

9
Hình 1.7 ; a.cấu trúc phân tử Asparaginase.b. cấu trúc đầu tận N và c

10
Hình 1.8 : Cơ chế xúc tác của Asparaginase với cơ chất L-asparagin

12
Hình 1.9 : Phân nhóm các tế bào máu 14
Hình 1.10; Kỹ thuật DNA tái tổ hợp

36
Hình 1.11 : Đặc điểm Vector pGEX-2T
38
Hình 1.12: Tóm tắt các bước sản xuất Asparaginase

38
ĐẶT VẤN ĐÈ
•
Ung thư đang trở thành vấn nạn lớn của xã hội. Trên thế giới, mỗi năm có
khoảng 11 triệu người bị ung thư và 6 triệu người tử vong do ung thư. Hiện
nay, ung thư đang ngày càng nguy hiểm hơn và con người có thể mắc ung thư
ở bất kỳ giai đoạn nào trong thời gian sống của mình.
Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho là căn bệnh phổ biến nhất trong tất cả
các loại ung thư ở trẻ em. Hàng năm ở Hoa kỳ có khoảng 2400 trẻ em và
thiếu niên dưới độ tuổi 20 được chẩn đoán mắc căn bệnh này. ớ Việt nam,
năm 2009 có khoảng 1163 ca. số lượng bệnh nhân đang tăng nhanh trong

những năm gần đây trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Asparaginase được nghiên cứu phát triển như một tác nhân hóa trị liệu hữu
hiệu. Thuốc được sử dụng trong điều trị giai đoạn tấn công trong cho các bệnh
nhân mắc ung thư bạch cầu cấp dòng lympho. Asparaginase thủy phân L-
asparagin, triệt tiêu nguồn dinh dưỡng của các tế bào ung thư khiến nó bị tiêu
diệt. Hiện nay, Asparaginase đã được nghiên cứu và sản xuất bằng công nghệ
DNA tái tổ hợp cho hiệu suất cao hon và tương đương sinh học với
Asparaginase tự nhiên. Các hãng dược phẩm hàng đầu đã cho ra sản phẩm
Pegasparagase (polyethylen glycol Asparaginase) ưu việt hơn Asparaginase tự
nhiên.
ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư bạch cầu cấp dòng lympho đang gia tăng
nên3 nhu cầu sử dụng Asparaginase để điều trị cũng tăng theo. Nhưng cho tới
nay, nước ta chưa sản xuất được Asparaginase mà chỉ sử dụng L-aspargainase
của nước ngoài.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tổng quan về Asparaginase,
ứng dụng làm thuốc điều trị ung thư” với mục tiêu:
• Tìm hiểu đặc điểm cấu trúc phân tử, nguồn gốc, vai trò, tính chất của
Asparaginase.
• Hướng ứng dụng của Asparaginase làm thuốc điều trị ung thư bạch
cầu cấp dòng lympho
• Tóm tắt quy trình sản xuất Asparaginase dược dụng bằng công nghệ
DNA tái tổ hợp.
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN
1.1.Đặc điểm nguồn gốc, cấu trúc và vai trò
1.1.1.Tên và vị trí trong hệ thống phân loại enzyme của L - Asparaginase
• Tên gọi quốc tế:
L-asparagine amidohydrolase hay L-asparaginase. Đây là enzym thuỷ
phân L- Asparagine.
• L-asparaginase trong hệ thống phân loại enzym theo lUB:
EC 3 - Hydrolase

EC 3.5 - Phân cắt liên kết carbon và nitrogen.
EC 3.5.1 - Vị trí cắt gần nhóm Amide.
EC 3 5.1.1 - L - Asparaginase
L - Asparaginase thuộc nhóm enzym thuỷ phân (Hydrolase,có ký hiệu EC
3) có khả năng cắt các liên kết giữa carbon và nitrogen (có ký hiệu EC 3.5).
L-asparaginase thuỷ phân L-Asparagine, cắt liên kết carbon nitrogen ở vị trí
nhóm amid nên có ký hiệu là EC 3.5.1. L-asparaginase có ký hiệu là EC
3.5.1.1.
L-Asparaginase L-Asparaginase
L-Ằsparaginase Nuc
p
L-asparagine
Betã-acyl-enzyme
NH3 intermediate ^2 0
Hình 1.1 : Phản ứng L-Asparaginase cắt liên kết nhóm amino và carbon
của Asparagin
I asparaginase tbuỷ phân L-asparagine cho sản Dhẩm là L-aspartat và
ammoniac. Đây là phản ứng 1 chiều và không đảo ngược. L-asparaginase
cũng thủy phân L-Glutamine nhưng với 1 tỷ lệ rất thấp [50].
1.1.2.Nguồn gốc tự nhiên của Asparaginase
Asparagmase có nguồn gốc từ rất nhiều các loại vi khuẩn và cơ thể động
thực vật.
ASPAMGIXASES
))laitt-typeaspara^ii)is«$ JÌkÌHÌii»iâ^iipnỊginM
Hình 1.2: Phân loại Asparaginase [25]
Enzym có hoạt động Asparagmase được chia làm 3 họ:
■ Họ ứiứ nhất tương ứng với Asparaginase type vi khuẩn.
■ Họ thứ hai tưoíng ứng với Asparaginase của Rhibizium elti.
■ Họ thứ ba tương ứng với Asparagmase type thực vật.
-V Jt

ỉlíị':iĩv’i A-í-r^vụị.'. Aí> »ÍI. .* J ’ .í.ỉửr **■’< •.
( ÿ«lV^ ,' -r*ì*ộjt ^ ÿ 1 ' «.»«.»¿Ỳ
i*^í •«-•/'Í!Ù«s ««'•SrtAựSí.iV»' ^*1. ; x'í ' ,
iíĩ*'»>v* »’-AíVm *sí ¡tÍík.'^í', Vfcv«/"»- .’2
f :cí*rtvrẠi-írtíí,?;:,?r i'«-"* >
ỉ 11 í I » « Vi r:*.i? i'JHi i»« M.* •: ^'í ' ^ ■< V -f ’■■'v
jfe,jịỂ^ÂmVJ^^ iíìTjệ*. m : ĩ 79
£%I jy « OỈ3 ". H r LI>L9JJ J(Ỉ. Ĩ2MS~9J
l ’iArw rJbmWaií' ^í ĩhíỉ f s 5 ?? V.—

■V>urïi*55i»r^ 'íM iinal''I*.' /ÄlC’.V "' ' " '' ' ""
Aế I < Y> iỄMrrỂK Rtu m
Afí-vBi&ítóiÉi-iiíii# i^ặ\* ứ r jỉi.4M » Ỉ J 2
A ịỉr t> ề íỉtT t^m m m a ý ^ ^ ịtm
Jftíiv*>am»i í : *a¡ I »^¡•►¿aiïiÈSc- ậù ĩ2J4ềẬề
.S áitJra.f t*>nTíti'i ìííre t íaĩàũè ậ ù S ỉ ũ ĩ íi'S
S cM í^ ^ t m r rh a ritm r f ’é'-^ prim Jî* jỊịì t ‘*ừtí ^ îft
S titiĩiKt:đ íế .'Ã.h»rữmf i v t KỉiuinAr »íí.íW7Ây!«JiÂ
t ^ í í 0 t H m s 3 $
\» M ệ ỉjm ế 4 m
S í í ỹ ê ịị;.^22 ờ '> 4ĩ
SW»*w*a Wirnm«»iííl* f «r/
\ / *V.vl25«^5r
' / V-miVi«V w«r a'A>"S.‘ïl Jfí• :^ií*» lüVA
ỉ í' .<» i’ ,í- 7%«r;»tiặi:iỉá»;mũt afc*irfícự?.feáli*iar ¡ỀÌ: ỉ.6f*4^7;§7
4<^rK^»,rwd*i ÍUI H1Ỷ
i Ai »r*ViTt\AH à^ì'
r*>y^.s |IJ 1,^ * HP>| w M
.
jV(r*ỉMHìfcií jiV

i^rí*A'^rt0rAíviwi»'»Aí'íai,«‘<^ 0 .I Ỉ Ì I Ỉ :’VJ
:•<?• rr/Aiirn^^-rA:«,?:/iiíj^iíhtJf. ÍỆX IÚỈPTĨI
f ^ ^ ^ t é ^ ^ m jỉỷ^fíỉẠặjị;<ỊA
^ r r jf .r m ỉ f ? 0 Ỉ2 ^
ữ m (m * Aí»iWí»m«v 0 ^ m i y w i
>a:«vwt)ĩint*KV ìnùi^<f72 ?7
A rlm f mhiOirtJ^ ra/rA O /ểr^ru « 4jrV?■»♦<»y ■»
BtíiffíuH xùm iỈA ítụ 24Ĩ S /J V
ram ịVrÌA^ a rter/rỷđnri ÿiV s í lA
ữ . I
■jatrir^.sv'Æ'ïiÆi».» ị'!sviir«u«t«:tni^đir.)^i: î tÎi'T M ^ à
SềT)ể^mri*rfWTMỉ f'ỈA \\fí.: f M 2 M ỉứ
r ịm t n đ i u m ACé^&iiuửỉéưrum ^ . 'ỉ
/(ỉỊỊị-^ĨỈẬMỊ: ỈAMfrtự<)Ịĩrmis 0;<sịị''if7'
í • ĩ ; * £ w -ñ rr
ị : ị , m
,ị ỉ. f * Mifüz a é^efir^ ftyỉi*n M i
fỉrỉtrữ h\er3f r jpjÍKxrf JV if jptir J
- r . infíéf^tt íü ^ ^ i. ỈJỳ-4ặĩíÌf
; '^* f> ñV rtr*Ai m il
ỉ ì ĩ . v ^ ỉ ĩ i . ỉ í ^ ỉ ĩ m
t ¡ m j i u i 0 £ » m 4
Hình 1.3; Sơ đô sinh vật có L-asparagỉnase tip vi khuân
íẻA DAqạ diị 3SBUiSBJBdsB-T Ọ3 ậẻA quỊS op JOS : ỳ 'l quỊH
mĩj:s»ỉ6
ỉ ^ f t ỉ f f ỉ ĩ ỉ - ỉ ^ *i* ^P^/>^ưỉmềũtiụ> jtỊjữiỊỉ> j^y < ÿ ^w iii i i i ' ß
, • w /Ặ‘í ỉ í í - f Z Ĩ Ị 3Ỉ ĩ ỉ ỉ^
#f :ịì^Iẩ iii" swí^í^í»;
-».»/yiyẩix^irií/^ííí« pftỊfdtífxaí{j
s« w w ; viftf/JísT

rối *«iMítì?Â7
í t ' ỉ ề ỉ -0 m«ftí/i»7
a^fmt »rAcí«fif-v«wr
»-<ta
mimịỉá^0 mm4^
£ u W M £Ẳ ‘ĩ ^ -ifiÿmiûfd
ÍMifW
U iỉế í J ^ ỉ : ỉ'ế t ĩ Ị i t.ĩ m i^ m ịệ ịi '
m r ừ ĩ :í«^ i^ĩỉ^ésỉm tĩm ữ j i
¿ 9£ i'íỉ^fỉ 'ỉ ^ m m j : M "^da x îfiÆ m t f ^ m t i ^
Ỉ>n .ĩjư.mj-Q
ítWiTí:'!^ y«.x?rA:íơJV
ị.UZẸmPÌ^-ỉf^W*
ểMfííMí '0
ửmfệĩỉ0 ĩ-ữMM m»ftềmẹứim
0 ZftSfi-ß tu v iuiữ^ Ị m
§ỈỈỆ-ìfị.Ị^}tíỉỉ^ \u£ (ỉỉjỊjf y ỉiỊpự » ^Ậ i)ím t?} ^ I ; I \ ể ^ H * í‘£ ã ’0
Mfí$muffém ^ - p r ỊĩiỊiim m iỉ
Z i z s m - ỉ ^ » p ^ đ 0»iiựítijĩđ^ịđữpmi^* -
7
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của Asparaginase
1.1.3.1. Một vài nét về lịch sử tìm ra Asparaginase
Asparaginase lần đầu tiên được phát hiện bởi Lang (1904), ông đã xác
định được hoạt động của Asparaginase trong mô thịt bò. 6 năm sau, 2 nhà
khoa học Fürth và Friedmann (1910) đã chứng minh kết quả đó do tìm ra sự
thủy phân L-asparagine ở ngựa và chuột lang. Họ kết luận Asparaginase có ở
tất cả các động vật có vú với cùng mức hoạt động. Trái với các kết luận đó,
Clemanti chỉ ra với động vật ăn tạp, Asparaginase chỉ xuất hiện trong gan.
Trong khi các cơ quan của động vật có vú ăn thịt, các loài lưỡng cư, bò sát
hoàn toàn không có Asparaginase. Chỉ trong các loài động vật ăn

cỏ,Asparaginase mới có ở tất cả các mô(1922). 1953, Kidd đã dần tìm ra được
hoạt động chống ung thư của Asparaginase, sau đó 8 năm Broome (1961) đã
chứng minh được Asparaginase tiêu diệt được tế bào ung thư ở chuột lang.
Sau đó Asparaginase cũng được tìm thấy trong E.colỉ và các loại vi khuẩn
khác. Tuy nhiên, Mashbur Wriston (1964) và Broome (1965) đã chứng minh
được Asparaginase của các loại vi khuẩn khác kém hoạt động hơn hoặc không
có hoạt tính kháng ung thư [24]. Do vậy, Asparaginase chiết từ Escherichia
coli đã trở thành liệu pháp trong điều trị ung thư , nhất là ung thư bạch cầu
cấp dòng lympho (acute lymphoblastic leukemia - ALL) [43],[26 .
1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của Asparaginase
Asparaginase có nguồn gốc đa dạng, phong phú có ở nhiều loại vi khuẩn
như Proteus vulgaris, Acỉnetobacter glutaminasificans, Pseudomonas putỉda,
Wolinella succinogenes. Với mỗi nguồn gốc khác nhau, Asparaginase có cấu
trúc phân tử và tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Tuy nhiên, chỉ có L-
asparginase chiết xuất từ Escherichia coỉỉ, Erwinia chrysanthemy được sử
dụng trong điều trị ung thư, nhất là Asparaginase chiết tách từ Escherichia
CO li [23], [2 7]. Đe tài chỉ tập trung mô tả cấu trúc của phân tử Asparaginase
chiết xuất từ Escherichia colỉ.
Escherichia coli gồm có 2 type Asparaginase. Asparaginase Type I
(Km=3,5 mM) được định vị trong cytosol, Asparaginase Type II
(Km=l 1,2 juM) được định vị trong vùng periplasmic của vi khuẩn và tính đặc
hiệu với L-asparagine cao hơn Asparaginase type I [34]. Do vậy,
Asparaginase Typ II được sử dụng để điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng
lympho [41].
Asparaginase Typ II có khối lượng phân tử khoảng 140 kDa, là 1
homotetramer gồm có 4 tiểu phân có cấu trúc giống nhau (A,B,C,D) và có
222 cấu trúc đối xứng, mỗi tiểu phân có khoảng 340 acid amin. Các tiểu phân
tương tự về mặt cấu trúc. Trình tự các acid amin được thể hiện ở hình dưới:
10 20 30 40 50 60
MEFFKKTALA ALVMGFSGAA LALPNITILA TGGTIAGGGD SATKSNYTVG KVGVENLVNA

70 80 90 100 110 120
VPQLKDIANV KGEQVVNIGS QDMNDNVWLT LAKKINTDCD KTDGFV1THG TDTMEETAYF
130 140 150 160 170
LDLTVKCDKP VVMVGAMRPS TSMSADGPFN LYNAVVTAAD KASANRGVLV
180
VMNDTVLDGR
190 200 210 220 230 240
DVTKTNTTDV ATFKSVNYGP LGYIHNGICID YQRTPARKHT SDTPFDVSKL NELPKVGIVY
250 260 270 280 290 300
NYANASDLPA KALVDAGYDG IVSAGVGNGN LYKSVFDTLA TAAKTGTAVV RSSRVPTGAT
310 320 330 340
TQDAEVDDAK YGFVASGTLN PQKARVLLQL ALTQTKDPQQ IQQIFNQY
Hình 1.5: Chuỗi acid amỉn của Asparaginase
L-aparaginase type II có 4 trung tâm hoạt động hoạt động độc lập với
nhau. 2 tiểu phân A,c và B,D tạo thành 1 dimer, mỗi dimer tạo nên 2 trung
tâm hoạt động. L-aparaginase type II hoạt động như 1 dimer của tetramer và
cấu trúc tetramer là một điều kiện thiết yếu để enzyme hoạt động [43].
Hình 1.6 : Sơ đồ mô tả cấu trúc của EcA II (hình ảnh từ NCBI)
• Đặc điểm của tiểu phân
Mỗi tiểu phân gồm 2 vùng ct/p: đầu N tận và đầu c tận được kết nối bởi 1
vòng 20 aa. Vùng N-tận gồm các chuỗi xoắn a và các phiến p xếp đối song
với vùng c tận gồm những phiến p xếp song song.
Cấu trúc vùng N tận: giữa Npl và Np3 có một điểm chuyển đổi nằm ở nơi
kết tíiúc vùng c tận của những phiến p kế bên ở hướng đối diện. Sự chuyển
đổi này tạo nên 1 kẽ nứt - nơi gắn ligand - đây là đặc điểm của tất cả các cấu
ữúc o/p.
Giữa Np4 và Np5 là 1 chuỗi xuyên chéo trái rất hiếm gặp ở trong cấu trúc
của proteùi.
Np7 và Np8 không nằm trong miền chính mà tạo thành dạng “cái lược”
hướng vào tetramer, có lẽ đóng vai trò trong chức năng kết nối các tiểu phân.

10
Vùng N-tận gồm 4 chuỗi xoắn a. Nal và Na4 nằm gần mép bên phiến p.
Na2 V à Na3 nằm ữên bờ đôí diện, gần bề mặt miền.
Vòng linh hoạt nằm ngay đoạn đầu của đầu tận N (tìr acid amine 15 tới
30), tạo thành một cấu trúc bao xung quanh tnmg tâm hoạt động.
Một cầu disuMde đặc trưng cho Asparaginase ở ecoli nằm giữa Cys77 và
Cysl05 định vị trên bề mặt N-terminal, nối phần cuối của đầu c tận của Na2
với vòng nằm giữa Na3 và Np4.
Vùng c có 4 phiến p nằm song song và 4 chuỗi xoắn a. Ca3 và Ca4 nằm
ứên vùng trung tâm của phiến p trong khi đó Cal và Ca2 nằm ừên ngoại vi
bề mặt miền [50],
Vòng linh hoạt
Tiểu phân A
Tiểu phân c
L-aspartate
Tiéu phân D
Hình 1.7 : a.cấu trúc phân tử Asparaginase, b. cấu trúc đầu tận N và c
• Trung tâm hoạt động:
Trung tâm hoạt động được hình thành tò những acid amữi của vùng N tận
tiếp xúc với vừng c tận của tiểu phân kề bên. Trung tâm hoạt động có các
acid amũi chúih là Thr 12, Thr 89, Asp90 và Lys 162. Trung tâm hoạt động
được xác định bởi vị trí của các chất gắn như L-asparagm, D-Asparagin, L-
aspartat chất ức chế; 5-diazo-4-oxo-L-norvaline [20][39][45][48]. Khi vắng
11
mặt cơ chất, trung tâm hoạt động thường xuất hiện các ion như ion sulfate.
Trung tâm hoạt động được bao bọc bởi túi kết nối nằm giữa 2 tiểu phân của 1
dimer (A và c, B và D). Túi kết nối bao gồm các aa của cả 2 tiểu phân. Đối
với A và c, các acid amin họp thành túi kết nối của tiểu phân A là Thrl2,
Tyr25, Ser58 Gln59, Thr89, Asp90, Alal 14 và Lysl62, các acid amin của tiểu
phân c là Asn248 and Glu283 [38],[44^.

• Cơ chế phản ứng xúc tác :
Cơ chế hoạt động của Asparaginase chưa rõ ràng.Các nghiên cứu cho thấy
có thể giống như cơ chế của Serin protease, phụ thuộc vào “bộ ba xúc tác”
Ser-His-Asp. Chức năng của từng aa trong bộ ba xúc tác :1 aa ái nhân(Ser), 1
base (His), 1 acid (Asp). 3 acid amin của Asparaginase tạo thành “bộ ba xúc
tác” là Thr(T) 89,Lys(K) 162, Asp(D)90 . Tất cả được liên kết với nhau bởi
liên kết Hidro. Cơ chế phản ứng xúc tác của Asparaginase như sau:
• Bước 1: Tác nhân ái nhân của enzym hoạt hoá qua 1 liên kết hidro
OH B với 1 aa cơ bản kế bên, tấn công vào nguyên tử c của nhóm amid rồi
qua trạng thái chuyển tiếp phức hợp tứ diện tới sản phẩm trung gian là acyl-
enzym. Sự tích điện âm tăng lên trên nguyên tử o của nhóm amid trong trạng
thái chuyển tiếp được ổn định bởi sự tương tác giữa những liên kết hidro của
aa cho. Phân tử oxy lúc này tíchb điện âm.
• Bước 2: Tương tự với bước 1 nhưng sự tấn công vào nguyên tử c
của nhóm ester được khởi đầu bởi phân tử nước.
12
Các acid amin có tiềm năng ái nhân gồm: Thr-12, Tyr-25 ,Ser-58 và Thr-
89 [43].
Hình 1.8 : Cơ chế xúc tác của Asparaginase với tác nhân L-asparagin
1.1.4. Một số tính chất và vai trò của Asparaginase
1.1.4.1. Tỉnh chất của Asparaginase
■ Khối lượng phân tử 140 kDa
■ Cơ chất: L-asparagine hon 90%, L-Glutamine 2-5%, D-Asparagine 5%
■ Chất ức chế: 5-diazo-4-oxo-L-norvaline
■ Khoảng nhiệt độ hoạt động :20 ”c đến 60 °c .
■ Nhiệt độ làm bất hoạt: 70°c.
■ Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 50 °c.
■ Hoạt độ: 300-400 Ịimol cơ chất trong 1 phút với 1 mg enzyme
■ Khoảng pH hoạt động: 6 đến 8,6 pH tối in i: 8
■ Số lần quay vòng phản ứng trong 1 giây đối với cơ chất L-asparagine ở

ở 25 °c, pH7:24 lần.
■ Giá trị Km đối với cơ chất L-asparagin ở 25 ‘’c, pH 7 : 0,0125 mM
[661.
13
1.1.4.2. Vai trò của Asparaginase
Asparaginase thủy phân Asparagine thành acid Aspartic và ammonia. Đây
là acid amine quan trọng cho việc tổng hợp DNA và các protein thiết yếu có
liên quan tới sự tồn tại của tế bào. Các tế bào ung thư không có khả năng tổng
hợp Asparagine. Ngược lại, các tế bào bình thường tổng hợp được Asparagine
nên chúng ít bị tác động bởi liệu pháp Asparaginase. Tuy nhiên, một số mô
tổng hợp protein nhiều vẫn cần nguồn Asparagin ngoại bào. Vì vậy,
Asparginase ảnh hưởng tới những mô này. Ngoài ra, Asparaginase còn ly giải
Glutamine mặc dù với mức hoạt động yếu nhưng đôi khi vẫn gây ra tác dụng
phụ trên các tế bào bình thường khác. Chúng có thế dẫn đến ức chế tổng hợp
DNA [33].
1.2. ứng dụng Asparaginase trong điều trị ung thư bạch cầu cấp tính
dòng lympho (acute lymphoblastic leukemia - ALL)
1.2.1. Sơ lược về hệ thống tế bào máu
Tủy xương sản sinh ra các tế bào máu gốc, sau đó các tế bào này được biệt
hóa theo từng giai đoạn và phát triển thành các tế bào máu trưởng thành. Tế
bào máu gốc được chia làm 2 nhóm là myeloid và lymphoid.
Nhóm tế bào myeloid gốc được biệt hóa thành: hồng cầu, tiểu cầu, bạch
cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa base. Trong đó các tế
bào myeloblast gồm bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ưa base, bạch cầu
ưa acid.
Nhóm tế bào lymphoid gốc được biệt hóa thành; lympho B, lympho T và
các tế bào diệt tự nhiên (natural killer).
14
TB máu gốc "
TB mveiold aốc TR Ivmnho nốr

/ ,
/ Myeloblast Lymphoblast
/ \ . / \
r Granulocytes / \
„ 1 - JP ^
••
Tiểu cầu Bạch cầu
Hình 1.9 : Phân nhóm các tế bào máu
1.2.2. Khái quát về bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho
1.2.2.1. Khái niệm về bệnh ung thư
ưng thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân
sinh ung thư, tế bào tăng sinh một cách vô hạn độ, vô tổ chức không tuân thủ
theo các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể [11],
L2.2,2, Mô tả về bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho
Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho là một bệnh cấp tính trong đó các tế
bào bạch cầu chưa trưởng thành (lymphoblast hay leukemia blast) tăng sũứi
nhanh chóng và phát triển vượt mức trong máu hoặc tủy xương. Chúng có thể
di chuyển vào máu và tuần hoàn trong cơ thể.
Acute lymphoblastic leukemia còn được gọi là acute lymphocytic
leukemia (ALL).
Các tế bào lymphoblast tăng sũứi nhanh chóng trong máu và tủy xương
dẫn đến hậu qu ả:
• Các tế bào lymphoblast tăng sinh không kiểm soát và tích lũy.
15
• Số lượng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu trong máu giảm (đặc biệt là
bạch cầu đa nhân trung tính ) do các tế bào lymphoblast chiếm chỗ.
Tình hình mắc ALL trên thế giói và một số khu vực.
Ung thư bạch cầu cấp tính chiếm khoảng 80% số ca mắc ung thư bạch cầu
ở trẻ em và là loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em. Theo thống kê của SEER
từ năm 2002-2006 (The Surveillance, Epidemiology, and End Results

(SEER): Ở Hoa kỳ, hàng năm có 2400 trẻ em và thiếu niên dưới 20 tuổi mắc
ALL. Năm 2005 có tổng số 3970 trường họp mắc ALL, tới năm 2008 con số
này lên tới 5760.
Bảng 1.1 : Tỷ lệ măc ALL và tỷ lệ tử vong theo độ tuối
Đô tuổi
•
Tỷ lệ mắc(%)
Tỷ lệ chết (%)
Dưới 20 tuổi
63,6 %
22,2 %
20 tới 34 tuổi
9,7 %
15,7%
35 tói 44 tuổi
5,8 %
9,6 %
45 tới 54 tuổi
6,1 % 10,7%
55 tói 64 tuổi.
5,3 %
11,1 %
65 tới 74 tuổi.
4,5 %
12,9 %
75 tói 84 tuổi.
3,4 %
12,4%
Trên 85 tuổi
1,5 %

5,6 %
Độ tuổi mắc trung bình là 13 tuổi, độ tuổi tử vong trung bình là 47 tuổi. Độ
tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất là từ 2-5 tuổi. Tỷ lệ mắc của khu vực châu Á Thái
Bình Dương là 1,6 trên 100000 người mỗi năm.
ở Việt nam, năm 2009 được ước tính có 1163 trường hợp mắc ALL [59 .
16
1.2.2.3. Nguyên nhân dẫn đến mắc ALL
Nguyên nhân chính xác dẫn đến mắc ALL vẫn chưa được xác định. Một số
ý kiến cho rằng nó là do đột biến gene điều khiển sự phát triển của tế bào
máu. Một số yếu tố được xác định như:
• Sự tiếp xúc liều cao với phóng xạ ngẫu nhiên hay có chủ đích trong việc
điều trị các bệnh ung thư khác.
• Sự tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp như benzene, thuốc trừ sâu hay
các tác nhân hóa học trong điều trị các bệnh ung thư khác.
• Đặc biệt những người có một số gene sắp xếp không đúng trật tự như
những người mắc hội chứng Down hay bệnh thiếu máu Fanconi có nguy
cơ mắc cao hơn những yếu tố nguy cơ khác.
1.2.2.4. Phân loại ALL
Vào những năm 1970, FAB (nhóm chuyên gia Pháp -French , Mỹ -
American, Anh -British) đã phân loại ALL thành 3 nhóm dựa trên hình thái tế
bào.
Bảng 1.2 : Sự phân loại của FAB theo hình thái tế bào
fAD Approximate ,
___
__
, •
% of Adult '■»"’“"» '« g i' H ì„h .h ái
A LL Patients Type
LI 30% ^ Te bào vẫn nhỏ
pre-B cell

L2 65% ^ Te bào biến đổi to hơn
pre-B cell
L3 5% B cell
Te bào biến đổi to với các
không bào.
Hiện nay sử dụng phương pháp immunophenotype, WHO phân loại ra
các type ALL dựa trên kháng nguyên bề mặt tế bào. Các type này cho biết
nguồn gốc (từ tế bào T hay B) cũng như mức độ trưởng thành của tế bào
bạch cầu.
17
Bảng 1.3 : Các type ALL và tỷ lệ mắc
Type B Tỷ lệ mắc (%) Type T Tỷ lệ mắc (%)
pro B 20 % Pre-T 5-10%
Common pre B cell 50% Mature T 10%
PreB 10%
Mature B (Burkitt) 4%
Ngoài ra còn một số loại Mixed lineage leukemia khác, ở một số bệnh
nhân, tế bào bạch cầu mang cả đặc điểm của tế bào lymphocytic và myeloid.
Những trường hợp này được gọi là mixed lineage leukemia (MLL), ALL với
myeloid markers ( ALL + My) và AML với lymphoid markers hay
biphenotypic acute leukemia (BAL). Những trường họp này thường có tiên
lượng xấu hơn các type ALL hoặc AML. Không có phương pháp điều trị
chuẩn nào cho các loại ung thư bạch cầu.
Ngoài việc phân loại dựa trên kháng nguyên bề mặt, người ta còn phân
loại dựa trên kỹ thuật gene di truyền nhằm xác định nhiễm sắc thể hoặc gene
bất thường trong tế bào.
Việc xác định rõ type của ALL là cơ sở cho việc sử dụng các biện pháp
điều trị và kết họp thuốc trong hóa trị liệu [54],[55],[59],[62].
1.2.2.5. Triệu chứng của bệnh ALL
Bệnh ALL không có triệu chứng đặc trưng mà chúng thường xuất hiện

trong tất cả các type ALL. Một số type cụ thể có một sô ít triệu chứng đặc
hiệu hơn.
• Triệu chứng phổ biến: Bệnh nhân mắc ALL thường có những triệu chứng
không đặc trưng như giảm cân, sốt, mồ hôi đêm, mệt mỏi, chán ăn
• Giảm tế bào máu; Thiếu hồng cầu gây ra mệt mỏi, ốm yếu, hoa mắt chóng
măt, lanh, hơi thở ngắn. / . (
.;SA
A