Tổng hợp một số dẫn chất của glutaramid mang khung benzothiazol hướng ức chế histon deacetylase

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
v ủ ĐÌNH CHINH
TỎNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA
GLUTARAMID MANG KHUNG
BENZOTHIAZOL HƯỚNG ức CHẾ
HISTON DEACETYLASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam
2. Ths. Đào Thị Kim Oanh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược
TRƯỜN'(Ì m DƯỢC HÀ NỘI
T H ìS VIỆ:i%í
Ngày íhána i:, năm 20Al
So ĐKCB:


I
HÀ NỘI-2011
Lòi cảm ơn
L
ời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu
sắc đến PGS.TS Nguyễn Hải Nam, Ths. Đào Thị Kim Oanh -Bộ
môn Hóa Dược - Trưòoig Đại học Dược Hà Nội. Những người đã tận tình
hưóng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Thầy,
GÔ đã mở ra
cho em những vấn đề khoa học rất lý thú, hưóng em vào nghiên cứu các lĩnh
vực hết sức thiết thực và vô cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho

em học tập và nghiên cứu.
Em cũng xin gửi lời cảm 0fn đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của bộ môn Hóa dược, Khoa Hóa - Đại học KHTN Hà Nội, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk đã
luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện khóa
luận tốt nghiệp này.
Nhân đây, con xin gửi lời cảm on sâu sắc đến Bố, Mẹ và những người
thân trong gia đình, cảm ơn những tình cảm và những lời động viên con trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 5/2011
VÛ Đình Chinh
ĐẶT VẤN ĐÈ 1
PH ẦN 1. T Ỏ N G Q U A N

3
1.1. HISTON DEA CETYLA SE (H DA C) 3
1.1.1. Định nghĩa 4
1.1.2. Phân loại 4
1.1.2.1. Các HDAC nhóm 1
6
1.1.2.2. Các HDAC nhóm II 7
1.1.2.3. HDAC 11 8
1.1.3. HDAC và sự hình thành khối u 9
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HD A C 10
1.2.1. Các hydroxamat 11
1.2.2. Các acid béo mạch ngắn 13
1.2.3. Các peptid vòng ;

13
1.2.4. Các benzamid 14

1.2.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) 14
PHẢN 2. NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

.

16
2.1.1. Hóa chất 16
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN cứ u
17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17
23.1. Tổng hợp hóa học
.
17
2.3.2. Xác định cấu trúc 17
MỤC LỤC
2.3.3. Thử tác dụng ức chế HD AC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất
tổng họp được 18
PH Ả N 3: T H ự C N G H IỆ M , K É T QUẢ, BÀN L U Ậ N

22
3.1. HÓA H Ọ C 22
3.1.1. Tổng hợp hóa học 22
3.1.1.1. Tổng hợp dẫn chất của acid 5-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5-
oxopentanoic (CHa)
22
3.1.1.2. Tổng hợp methyl 2-(5-(benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5-oxopentan
amido)acetat và dẫn chất (CHb) 27

3.1.1.3. Tổng hợp N‘-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-(2-(hydroxyamino)-2-
oxoethyl)glutaramid và dẫn chất (CHc)
32
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 37
3.1.3. Xác định cấu trúc 38
3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHa 38
3 .1.3.2. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHb 39
3.1.3.3. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHc 40
3.2. THỬ TÁC d ự ng ứ c c hế ENZYM HISTON
DEACETYLASE 45
3.3. BÀN LU ẬN 45
3.3.1. Tổng họp hóa học 45
3.3.2. Tác dụng ức enzym histon deacetylase và đốc tính tế bào 46
4. KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 47
4.1. KẾT LUẬN 47
4.2. KIẾN NGHỊ 47
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALL
AML
CDI
CLL
CTCL
CTCT
CTPT
DCM
DMF
DMSO
GADPH
HSP90
KLPT

MDS
MEF2
NSCLC
SAR
TLC
(Acute lymphoblastic leukemia) Bệnh tiền nguyên bạch cầu
thể cấp
(Acute myoloid leukemia) Leukima cấp thể tủy
1,1 -Carbonyldiimidazol
(Chronic lymphocytic leukemia) Bệnh lympho mãn tính
(Cutaneous T cell lymphoma) Té bào lympho T dưới da
Công thức cấu tạo
Công thức phân tử
Dicloromethan
N,N-dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase
(Heat shock protein 90) Protein sốc nhiệt-90
Khối lượng phân tử
(Myelodysplastic Syndromes) Hội chứng dị sinh tủy
(Myocyte enhancer factor-2) Yeu tố tăng sinh tế bào cơ-2
(Non-small lung cell) Ung thư phổi tế bào không nhỏ
Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng
Sắc ký lớp mỏng
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1
Cấu tạo nhiễm sắc thể.
Trang 3
Hình 2 Cấu trúc của nucleosome.
Trang 4

Hình 2
Biểu đồ mô tả các loại HDAC khác nhau.
Trang 9
Hình 4
Chức năng của HDAC.
Trang 10
Hình 5
depsipeptid (FK228).
Trang 14
Hình 6
MS-275.
Trang 14
Hình 7
HDACi điều hoà sự phát triển của tế bào.
Trang 15
Hình 8 Tác dụng ức chế HDAC của các chất CHc.
Trang 46
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảngl
Phân loại các HDAC
5
Bảng 2
Các chât ức chê HDAC đang thử nghiệm lâm sàng
12
Bảng 3
Hiệu suât và chỉ sô hóa lý của acid 5-(benzo[d]thiazol-2-
ylamino)-5-oxopentanoic và dẫn chất
26
Bảng 4
Hiệu suất và chỉ số hóa lý của methyl 2-(5-(benzo[d]thiazol-

2-ylamino)-5-oxopentanamido)acetat và dẫn chất
31
Bảng 5
Hiệu suất và chỉ số hóa lý của N^-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-
(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)glutaramid và d/c
36
Bảng 6
Giá trị Rf và t^nc của CHa
37
Bảng 7 Giá trị Rf và t"nc của CHb và CHc
38
Bảng 8
Kêt quả phân tích phô hông ngoại của dãy chât CHa
39
Bảng 9
Kêt quả phân tích phô khôi lượng của dãy chât CHb
39
Bảng 10
Kêt quả phân tích phô hông ngoại của dãy chât CHc
40
Bảng 11
Kêt quả phân tích phô khôi lượng của dãy chât CHc
41
Bảng 12
Kết quả phân tích phổ ’H-NMR của dãy chất CHc
41
Bảng 13
Kết quả phân tích phổ ’^C-NMR của dãy chất CHc
44
Bảng 14

Độc tính trên tê bào ung thư đại tràng SW620 của các chât
CHc
46
ĐẶT VẤN ĐÈ
Tổ chức Y tế Thế giới ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 11
triệu trường hợp mới mắc ung thư. Các ung thư hàng đầu trên thế giới ở nam
giới là ung thư phổi, dạ dày, đại - trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; ở nữ giới là
ung thư vú, đại - trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi [5'.
Tổ chức Y tế Thế giới cũng ước tính mỗi năm có khoảng trên 6 triệu
người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong số các
nguyên nhân gây tử vong ở người [5].
Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên
thế giới. Năm 2008, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 20 triệu
người đang sống chung với bệnh ung thư. Neu không có các biện pháp can
thiệp kịp thời thì con số này sẽ lên tới 30 triệu vào năm 2020[5’.
ở các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng
thứ hai sau bệnh tim mạch, ở các nước đang phát triển ung thư đứng hàng thứ
ba sau bệnh nhiễm trùng/ ký sinh trùng và tim mạch[5].
Đe giảm thiểu tỉ lệ tử vong do ung thư thì việc nghiên cứu thuốc chống
ung thư có vai trò quan trọng hàng đầu.
Trong những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đang trở
thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid
hydroxamid(Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã
được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da. Vorinostat là
một chất ức chế HD AC có chứa nhóm chức acid hydroxamic trong phân tử.
Đây là một trong số các chất được nghiên cứu phát triển từ TSA- là một
chất ức chế HDAC tự nhiên cũng có chứa nhóm chức acid hydroxamic
trong phân tử. Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa nhóm
chức acid hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư. Vì vậy,
chúng tôi tiến hành đề tà i:

“ Tổng hợp một số dẫn chất của glutaramid mang khung
benzothiazol \ hướng ức chế histon deacetylase”
Với 2 mục tiêu chính :
Tổng hợp N ’-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)
glutaramid và 5 dẫn chất.
Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và độc tính tế bào ỉn vitro của các
chất tổng họp được.
PHÀN 1: TỎNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC).
Trong sinh học, các nhiễm sắc thể được cấu tạo nên từ các đơn vị cơ
bản, các đơn vị đó được gọi là nucleosome (hình 1). Mỗi nuleosome được cấu
tạo từ 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi histon (hinh 2).
CHROMATIN
i
ế
\ \ nuc eosomes
Hình 1; cấu tạo nhiễm sắc thể
Histon là các protein kiềm mạnh có vai trò tạo thành bộ khung để phân
tử ADN quấn xung quanh. Lõi của một nucleosome là một octomer hình đĩa
gồm 4 cặp histone H3 và H4, H2A và H2B. Do các histon là các protein kiềm
mạnh nên đầu amin của histon mang nhiều điện tích dương , điện tích dưofng
ừêĩi histon tirơng tác với phần điện tích âm của nhóm phosphat frên phân tử
ADN để tạo nên cấu trúc của một nucleosome, và sự mạnh yếu của liên kết
này quy định quá trình biểu hiện gen. Khi histon tích điện dương lớn, tương
tác này mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và
tổng hợp protein, làm ức chế sự biểu hiện của gen. Ngược lại khi tương tác
điện tích này yếu nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra.
đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính trạng. Điện tích fren histon
mạnh hay yếu thông quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon.
Acetyl hóa trung hòa điện tích dương của histon làm yếu tuơng tác của nó với

ADN trong khi đó deacetyl hóa có tác dụng ngược lại. Trong tế bào, enzym
histon acetylase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) là 2 enzym điều hòa
quá trinh acetyl hóa này từ đó quyết định sự biểu hiện của gen[ 17,22,24],
' 4 ^ i ị-i4 H.2A »'ỉ -í' 'M« Wií?

Ỵ


.

I
i

T
í
f
r,.ÍA-íu’B
ị
ỉ :>
-
«ft;
r‘s- :í;„
Hình 2: cấu trúc của nucleosome
1.1.1 Định nghĩa
Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tách cho quá
ứinh loại bỏ nhóm acetyl từ c-N-acetyl lysin amino acid của phần histon.
HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase.
1.1.2 phân loại:
Dựa trên sự tương đồng về cẩu trúc HDAC được chia làm 4 nhóm như
ở Bảng 1[4,10,12,13,16,21,24]:

Bảng 1 : Phân loại các HDAC
Các thành viên
Cơ chât
Thành phân liên kêt
Phân bô trong mô
Nhóm
I
HDAC 1 (N)
p53, MyoD, E2F1, Stat3, androgen
Sin3, Mi-2/NuRD, CoREST
Các mô
HDAC 2 (N)
Bcl-6, Stat3, receptor glucocorticoid,
YY-1
Sin3, Mi-2/NuRD, CoREST
Các mô
HDAC 3 (N/C)
GATA-1, RelA, Stat3, MEF2D, YY-1,
SHP
N-CoR/SMRT
Các mô
HDAC 8 (N/C)
Không có dữ liệu
ESTIB
Các mô
Nhóm
II A
HDAC 4 (N/C) GCMa, GATA-1, HP-1
ANKRA, RFXANK
Tim, cơ trơn, não

HDAC 5 (N/C)
Smad7, HP-1, GCMa
REA, receptor estrogen
Tim, cơ trơn, não
HDAC 7 (N/C)
FLAG1 và 2
HIFla, Bcl-6
Tim, nhau thai, tụy, cơ trơn
HDAC 9 (N/C)
Không có dữ liệu
F0X3P
Cơ trơn, não
Nhóm
II B
HDAC 6 (C) a-Tubulin, HSP90, SHP, Smad7
Không có dữ liệu
Thận, gan, tim, tụy
HDAC 10 (C)
HSP90 ?
Không có dữ liệu
Lá lách, thận, gan
Nhóm
IV
HDAC 11 (N/C)
Không có dữ liệu
HDAC6 ?
Tim, cơ trơn, thận, não
N: Nhân ; C: bào tương; N /C : nhân và bào tương
L l.Z L Các HDAC nhóm I
Các HDAC 1, 2 và 3 là những đon vị nhỏ của những phức hợp đa

protein trong nhân, có vai trò quyết định trong sự ức chế quá trình phiên mã.
*HDAC1 và HDAC2: HDACl và HDAC2 là những enzyme rất giống nhau,
tỷ lệ tương đồng về cấu trúc của chúng là 82%. Vùng xúc tác ở phía đầu N là
phần chính của các enzym này. HDAC 1 và HDAC2 chỉ có tác dụng khi chúng
nằm trong một tổ họp protein. Các tổ hợp này bao gồm các protein cần để
điều chỉnh hoạt động deacetyl hóa và để liên kết với ADN, cũng như các
protein làm trung gian cho sự thâm nhập của HDAC vào các chất xúc tác gen.
Ba tổ hợp protein đã được xác định là chứa đồng thời cả HDACl và HDAC2
là: Sin3, NuRD và Co-REST[21,24].
* HDACS: HDACS có cấu trúc giống với HDACS và HDACS có chung cấu
trúc khu vực như các HDAC nhóm I khác. Khu vực đầu c của HDACS là cần
thiết cho cả hoạt động deacetyl hóa và hoạt động ức chế sự phiên mã. Ngoài
NLS (tín hiệu định vị trong nhân) mà tất cả các HDAC nhóm I khác đều có,
HDACS còn chứa một NES (tín hiệu truyền ra ngoài nhân). Tín hiệu này cho
phép HDAC3 đi từ nhân vào bào tương. Sự cân bằng giữa 2 tín hiệu này phụ
thuộc vào loại tế bào và điều kiện môi trường [21]. HDAC3 tồn tại trong một
số phức hợp khác với các phức họp HDAC khác đã được biết tới. Điều này
cho thấy mỗi HDAC có những chức năng riêng biệt do đặc tính phức tạp của
chúng. SMRT và N-CoR là những cofactor cần thiết cho hoạt động của
HDACS(SMRT và N-CoR là 2 protein riêng biệt nhưng có cấu trúc và chức
năng tương tự nhau, cả 2 đều là chất ức chế tương ứng). Cả SMRT và N-CoR
đều có một khu vực hoạt hóa deacetylase dành cho HDACS [21,2A\.
*HDAC8: HDAC8 có cấu trúc tương tự HDAC3. HDAC8 có cấu trúc với
phần chính là vùng xúc tác với một NLS ở trung tâm [21]. Theo những nghiên
cứu gần đây nhất, người ta vẫn chưa xác định được liệu chức năng của
HDAC8 có bị điều chỉnh bởi 1 phức hợp ức chế của các protein hay không.
1.1.2.2. Các HDAC nhóm II
*HDAC4, HDAC5 và HDAC7: HDAC4, HDAC5 và HDAC7 có cấu trúc
tương tự nhau. Cả 3 HDAC này đều có vùng xúc tác nằm ở đầu c của protein
và NLS nằm ở gần đầu N. Các HD AC này liên kết với CtBP, MEF2 ở đầu N

của chúng. HDAC5 có một NES ở khu vực xúc tác, giúp nó có khả năng vận
chuyển giữa nhân-tế bào chất. HDAC4, HDAC5 và HDAC7 có khả năng
tưoTig tác với SMRT và N-CoR, BCoR và CtBP. Đầu N của HDAC4,
HDAC5 và HDAC7 liên kết đặc hiệu và ức chế yếu tố phiên mã myogen
MEF2. MEF2 là yếu tố phiên mã liên kết ADN trong sự phân hóa cơ.Khi
MEF2 liên kết với HDAC4,5 hoặc 7, chức năng của MEF2 bị ức chế, dẫn đến
các tế bào cơ không phân hóa được[21,24].
*HDAC9: Vùng xúc tác của HDAC9 nằm ở đầu N, tương tự các HDAC
nhóm II khác. Người ta đã biết 3 biến thể kết hợp của HDAC9: HDAC9a,
HDAC9b và HDAC9c/HDRP. HDAC9c/HDRP thiếu vùng xúc tác và có 50%
tương đồng với đầu N của HDAC4 và HDAC5. Tương tự với HDAC4/5/7,
HDRP có khả năng thu nạp HDAC3, do đó khắc phục được sự thiếu hụt vùng
xúc tác. Thêm vào đó, ÍỈDAC9 còn có thể tương tác với MEF2. Điều này chỉ
ra rằng HDAC9 có thể có chức năng quan trọng trong sự phân hóa cơ.
*HDAC6: HDAC6 có cấu trúc giống với HD AC 10. HDAC6 là một enzym
khá độc đáo trong các họ HD AC CO điển, do nó có chứa 2 vùng xúc tác được
sắp xếp nối đuôi nhau. Một đặc điểm độc đáo khác của HDAC6 là sự có mặt
của một vùng HƯB(HDAC6-, USp3- và Brap2-related zinc finger motif) ở
đầu C. Vùng này là tín hiệu cho sự ubiquitin hóa, gợi ra rằng HD AC này hơi
nghiêng về phía thoái hóa. Chức năng của HDAC6 là deacetyl hóa tubulin,
điều chỉnh sự vận động tế bào phụ thuộc microtubu. Mặc dù chúng tập trung
chủ yếu trong tế bào chất (do có một NES) để thực hiện chức năng của mình,
HDAC6 còn được tìm thấy ở nhân trong một phức hợp với HDACl 1 [21].
*HDAC10: HD AC 10 là thành viên được phát hiện gần đây nhất trong số các
HD AC nhóm II. Hai loại mARN, với sự khác biệt rất nhỏ về chiều dài đã
được tìm thấy, gợi ra sự tồn tại của 2 biến thể của HD AC 10 [21]. HDACIO có
một vùng xúc tác ở đầu N , một NES và một vùng xúc tác thứ 2 ở đầu c. Hai
vùng được coi là liên kết với Rb cũng được tìm thấy ở HD AC 1 o, gợi ra vai
trò trong việc điều hòa chu trình tế bào. Hơn nữa, HD AC 10 có khả năng liên
kết với HD AC 1,2,3 (và/hoặc SMRT) và HDAC4,5,7, nhưng ko tương tác với

HDAC6. Khả năng liên kết của HD AC 10 với nhiều loại HD AC khác nhau chỉ
ra rằng, có thể chức năng của nó là một chất tiếp nhận hơn là một chất
deacetyl hóa. Tuy nhiên, ÍĨDACIO khi đứng 1 mình vẫn thể hiện hoạt tính
deacetyl hóa[
21].
I.1.23. H D AC ll
HDACl 1 có vẻ như có cấu trúc tương tự với HDAC3 và HDAC8, gợi
ra rằng nó có thể có liên quan mật thiết hon với HD AC nhóm I so với nhóm
II. Tuy nhiên sự phân loại của HDACl 1 vẫn chưa được xác định do sự tương
đồng của nó với các HD AC khác còn hạn chế. HDACl 1 chứa vùng xúc tác ở
đầu N với tác dụng deacetyl hóa đã được chứng minh và bị ức chế bởi
trapoxin(dẫn chất của TSA). HD AC 11 ko được tìm thấy trong bất kỳ phức
hợp nHDAC nào, điều này gợi ra chức năng sinh hóa riêng biệt của
HDAC 11 [21],
-DAC • -82 aa II
__________

-JAC 2 -88 aa It r !
-D/^C '3 -23
aa
- JAC 5 3 a?, n
3 a a f l iz z z ill l
00
3
o
"D “ 06- aa L
-DAC 5 -'^22 aa r
I T
3''9 aa
s

ci
c z m :
>69 aa 11
ecc
— f _
Hình 3: Biểu đồ mô tả các loại HDAC khác nhau
Những thanh ngang mô tả chiều dài của các protein.
Phần màu xanh là vùng xúc tác. Phần màu đen là NLS. N ỉà đầu N, c là đầu
C
1.1.3 HDAC và sự hình thành khối u.
HAT xúc tác cho phản ứng acetyl hóa nhóm S-NH2 trong phân tử ly sin
ở phần đuôi của histon làm hoạt hóa quá trình phiên mã, trong khi đó, chức
năng của HDAC là xúc tác cho phản ứng deacetyl hóa lysin tạo ra nhóm
ở phần đuôi của histon (hình 3). Nhóm này mang điện tích dương sẽ liên kết
với nhóm mang điện âm trên nhiễm sắc thể gây đóng xoắn nhiễm sắc thể, làm
giảm sự tiếp xúc của các yếu tổ phiên mã với nhiễm sắc thể gây ức chế quá
trình phiên mã. Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những
nguyên nhân dẫn tới sự hình thành khối u[19]. Cụ thể, mối tương quan giữa
hoạt động của HDAC và sự tạo u được thể hiện rõ ràng nhất trong bệnh ung
thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính {APL). Những nghiên cứu trên phạm vi
rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã không thích hợp của HDAC là cơ chế
phổ biến tạo ra các protein gây ung thư {oncoprotein). Sự biến đổi trong cấu
trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình biệt hóa các tế bào bình
thường, kết quả dẫn tới sự hình thành khối u.
Lysine CH 3
co
NHÎ NH
I I
9^ 2 A cétylatio n 9^2
CH2 HATs

I '

^ I '
Ç H 2 ^
Ç H 2
Deacetylation ¿ịỊ
\ ^ by HDs I ^
ÁCL Áa,
H 5 H O
Hình 4: Chức năng của HDAC
1.2 Các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng
trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên trên cấu
trúc[4,8,14,18,23,24]:
Các hydroxamat: TSA, SAHA, CBHA
Các peptid vòng: depsipeptid, CHAPs
10
Các acid béo mạch ngắn: butyrat, phenylbutyrat, valproic acid.
Các benzamid như: N-acetyldinalin, MS-275.
1.2.1. Các hydroxamat.
Trichostatin A (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được
phát hiện có tác dụng ức chế HDAC. TSA là một sản phẩm lên men của
Streptomyces. Ban đầu, TSA được sử dụng làm chất chống nấm, nhưng sau
đó người ta đã phát hiện ra khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh các tế bào ung
thư của nó. TSA có tác dụng in vitro ngay ở mức nồng độ nanomol. Do việc
sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp( 20 giai đoạn, với hiệu suất là 2%)
nên việc tìm kiếm một HDACi thay thế nó đang được tiến hành và rất quan
trọng. Ngày nay, TSA được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc tìm
kiếm các các HDACi mới. Rất nhiều hợp chất tương tự nó thuộc nhóm
hydroxamat đã được tìm ra, nhưng trong đó chỉ có oxamflatin là có tác dụng

ỉn vitro tương tự TSA.
SAHA có cấu trúc tương tự TSA và là chất ức chế HDAC nhóm I và II
ở nồng độ nanomol. Cả SAHA và TSA đều không ức chế HDAC nhóm III.
acid bishydroxamid M-carboxycinnamic (CBHA) là một chất ức chế HDAC
mạnh khác, nó là cơ sở cấu trúc của nhiều dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và
I dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai chất này đều ức chế HDAC nhóm I và
II ở nồng độ nanomol.
Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng
tưong tác với vị trí xúc tác của HDAC, do đó chúng ngăn không cho cơ chất
tiếp xúc với ion Zrĩ^ tại vị trí của nó[4,18]. Nhược điểm của các hydroxamat
là bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC.
11
Bảng 2 ; Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng
Hợp chất
CTCT
IC50 in
vitro
Pha Loại ung thư
Trichostatin A (TSA)
—
0
nM
I, II
Acid Suberoyl anilid
hydroxamic (SAHA)
II c
0 1
nM
Đã c/m
I,II

CTCL, thể rắn,
ung thư máu
PXDIOI
0
o' b 1,
IliM
II
ưng thư máu
LBH589
0
1 N
\ ^OH
VXj
/ V nh
nM
II, III
Thể rắn, AML,
ALL, MDS
12
Ngoài các chất đang được thử nghiệm trên lâm sàng còn có các
hydroxamat khác được nghiên cứu và có hoạt tính.
L2.2. Các acid béo mạch ngắn.
Nhóm các acid béo mạch ngắn, như phenylbutyrat và các dẫn chất, acid
valproic, có tác dụng ức chế ÍỈDAC tương đối yếu, có tác dụng ở khoảng
nồng độ micromol và ảnh hưỏng đến sự biểu hiện của nhiều gen với các chức
năng tế bào khác nhau. Những tác nhân này đã được đánh giá trong lâm sàng,
nhưng có chu kỳ bán hủy ngắn trong huyết tưong và cần phải có nồng độ
tương đối cao (cỡ milimol) cho các hoạt động của chúng. Gần đây, một hợp
chất có cấu trúc ghép giữa phenyl butyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận
là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp. Cả valproic acid và

phenylbutyrat đều đã được sử dụng làm thuốc trên thị trưÒTig từ lâu, không
phải với tác dụng chống ung thư. Cho đến gần đây chúng mới được phát hiện
là có khả năng ức chế ÍĨDAC.
1.2.3. Cácpeptid vòng
Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các
HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên(FK228), apicidin và các phân tử
thuộc nhóm các CHAP (các dẫn xuất của acid tetrapeptidehydroxamic vòng).
Hầu hết các hợp chất này là sản phấm của vi khuấn hoặc nấm, tuy nhiên
apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa hydroxamic acid và cyclic
peptid. Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng
độ nanomol.
13
o
, ĩỉ
HìnhS: depsipeptid (FK228)
1.2.4. Các benzamid
Nhóm HDACi thứ tư bao gồm tập hợp các tác nhân trong cấu trúc có
chứa nhóm chức benzamid. Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm
nhập vào vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động. Các chất thuộc
nhóm này gồm; MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ
micromol) và CI-994(N-acetyldinalin) -có tác dụng ức chế HD AC theo cơ
chế chưa được xác định.
Hìnhó: MS-275
1.2.5 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HD AC (HDACi)
Khả năng chống ung thư của các chất ức chế HD AC bắt nguồn từ khả
năng tác động lên nhiều giai đoạn chu trình tế bào đã bị biến đổi ở các tế bào
ung thư. Trong hầu hết các trường họp, sự hoạt hóa các chương trình biệt hóa,
ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào theo chưoTig trình là chìa
14
khóa cho tác dụng chống ung thư của HDACi. Thêm vào đó, sự hoạt hóa của

chuỗi phản ứng miễn dịch và sự ức chế tạo mạch cũng đóng vai trò quan trọng
ừong tác dụng ức chế khối u in vivo của HDACi[4,2l].
i'’ t
s ỉ H.r
« v.ị;:
«Ị
¥
c
•••
Hình 7: HDACi điều hoà sự phát triển của tế bào
Các HDACi tác động tới tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu:
1. HDACi tác động lên tế bào ung thư, gây ra sự nghỉ ở pha Gl của chu
ừình tế bào, từ đó dẫn tới sự biệt hóa tế bào ung thư.
2. HDACi tác động lên cả tế bào ung thư và tế bào thường, gây ra G2
checkpoint (vị frí mà tại đó chu ừình tế bào tạm thời bị dừng lại, chờ đến khi
các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục). Các tế bào thường sẽ
frải qua G2 checkpoint này rồi tiếp tục phát ừiển bỉnh thưòfng. Trong khi đó,
các tế bào ung thư biến đổi ADN thành 4nADN. Sự biến đổi này sẽ khiến cho
các tế bào ung thư phải trải qua sự chết tế bào theo chu trình.
3. HDACi hoạt hóa phiên mã các yếu tố tăng cường đáp ứng miễn dịch đối
với các tế bào ung thư.
15
PHẢN 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại
dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Bao
gồm:
- Hydroxylamin hydroclorid.

- Anhydrid glutaric.
- Methylglycin hydroclorid.
-CDL
- Các 2-aminobenzothiazol gồm:
2-aminobenzothiazol
2-amino-6-ethoxybenzothiazol
2-amino-6-methylbenzothiazol 2-amino-6-methylsulfonylbenzothiazol
2-amino-6-nitrobenzothiazol
2-amino-6-methoxybenzothiazol
- Các hóa chât và dung môi khác cân cho tông hợp: NaOH, DCM,
DMF, MeOH, HCl, aceton, TEA
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt,
sinh hàn hồi lưu, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích,
cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lóp mỏng (SKLM), cân phân tích, chị thị màu
vạn năng.
- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Nhiệt độ nóng chảy (t°nc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng
chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
16
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer - USA tại bộ
môn Hóa vật liệu - Khoa hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của
Viện hóa học Việt Nam và Khoa hóa - Trường đại học KHTNHN
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và carbon - NMR) được
ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN cứ u
Tổng hợp N'-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-(2-(hydroxyamino)-2-
oxoethyl)glutaramid và 5 dẫn chất.
- Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.

- Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế bào ung thư ỉn vitro
của 6 chất tổng hợp được
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.3.1. Tổng hợp hóa học
- Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ
để tổng hợp các dẫn chất thiết kế. Dùng phản ứng N - acyl hóa để tổng hợp,
khảo sát điều kiện phản ứng để thu được hiệu suất tối ưu.
- Kiểm tra nhanh phản ứng bằng TLC
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy
2.3.2. Xác định cấu trúc
Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: Phổ hồng
ngoại (IR), Phổ khối (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (‘H - NMR), Phổ
cộng hưởng từ carbon (’^c - NMR).
* Phổ hồng ngoại (IR); Phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa hóa, Trưòng
đại học KHTN Hà Nội, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr
trong vùng 4000-600cm'\ Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô
TRUỒNG Đrỉ mọc ÍIA Nộỉ
T H Ì/V iỆ M
Ngày Ậ tháng ^.'năiTi 2q(Ẩ
Số ĐKCB:

2J r r Z ị

L
17
với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút
chân không để loại bỏ hơi ẩm[l,7’ .
* Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng các chất được ghi tại Khoa hóa
Trường đại học KHTN Hà Nội với chế độ đo ESI, dung môi acetonitril
[1,2,3,6,7].

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (^H - NMR), Phổ cộng hưởng từ carbon
(*^C - NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công
nghệ Việt Nam dùng DMSO làm dung môi, lấy mốc là pic của chất chuẩn nội
tetramethylsilan (TMS).
2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất
tổng hợp được
* Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase
Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hơp được đánh
giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3,H4 trong
rVSMCs. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng
của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3 khi so sánh với
mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công
bố trước đây[ 12,20'.
Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:
xế bào cơ trơn động mạch chuột chủng Wistar-Kyoto (WKY) và tế
bào động mạch người được nuôi cấy đến khoảng 70% bão hòa trong môi
trưòng nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) có bổ sung
2mM glutamine, 10% huyết thanh bào thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt
(heatinactivated fetal calf serum (Gibco BRL)) cùng với 50ư/ml penicillin và
50)ig/ml streptomycin (được gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete
medium (CM)). Tất cả tế bào được ủ ở 37°c với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v)
không khí. Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan
18