Chiết tách và xác định hoạt tính của ribonuclease từ trứng cóc (bufo sp , bufonidae) và trứng ếch (rana rugolusa , ranidae)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






LÊ THỊ TÌNH





CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG
CÓC (Bufo sp., Bufonidae) VÀ TRỨNG
ẾCH (Rana rugolusa., Ranidae)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ







HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







LÊ THỊ TÌNH


CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG
CÓC (Bufo sp., Bufonidae) VÀ TRỨNG
ẾCH (Rana rugolusa., Ranidae)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ






Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Rư
Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa Sinh




HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo, TS.
Nguyễn Văn Rư – bộ môn Hoá Sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của anh Nguyễn Quốc Toản đã
cùng tôi hoàn thành đề tài này, đặc biệt là sự giúp đỡ tạo điều kiện của các
thầy cô, các chị kỹ thuật viên của bộ môn Hoá Sinh, Trường Đại học Dược
Hà Nội.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo, các
phòng ban, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại nhà trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè
đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình.



Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Tình

MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1. ĐẶC ĐIỂM VỀ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ 2

1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ RNASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ 3

1.2.1. Một số nghiên cứu RNase từ trứng động vật lưỡng cư 3
1.2.2. Cấu trúc phân tử của RNase từ trứng động vật lưỡng cư 5
1.2.3. Cơ chế xúc tác của RNase từ trứng động vật lưỡng cư 6
1.2.4. Hoạt tính gây độc tế bào của RNase từ trứng ếch 8
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của RNase 9
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ RNASE 12

1.3.1. Các phương pháp chiết tách enzym RNase 12
1.3.2. Các phương pháp xác định hoạt độ của RNase 14
1.4. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE 14

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 16

2.1.1. Nguyên liệu 16
2.1.2. Hoá chất 16
2.1.3. Thiết bị 16
2.2.2. Kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein - enzym 17
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein 19
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ RNase 22

3.1. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH RNASE TỪ TRỨNG ẾCH VÀ TRỨNG CÓC 24

3.1.1. Chiết RNase từ trứng ếch 24
3.1.3. Chiết RNase từ trứng cóc 24
3.1.4. Nhận các phân đoạn protein từ dịch chiết mô trứng cóc bằng kỹ thuật tủa phân đoạn
với (NH
4
)
2
SO
4
25
3.3.1. Kết quả xác định sự phân bố hoạt độ RNase từ trứng ếch 26

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35

Kết luận 35

Đề xuất 35




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axid Deoxiribonucleic
ARN Axid ribonucleic
Amph Amphinase
BS – RNase Bovine seminal ribonuclease
C

pr
Nồng độ protein
DC Dịch chiết
dd Dung dịch
đvE Đơn vị enzym
HđR Hoạt độ enzym Ribonuclease
HđR
riêng
Hoạt độ riêng của enzym Ribonuclease
MW Khối lượng phân tử
OD Mật độ quang học
ONC Onconase
PCR Polymerase Chain Reaction
PBS Phosphate buffered saline
pH
opt
pH tối ưu
Phđ Phân đoạn
Pr Protein
RNase Ribonuclease
TC Trứng cóc
TE Trứng ếch
TT Thuốc thử
TTHĐ Trung tâm hoạt động




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Tỷ lệ pha các dung dịch để xây dựng đường chuẩn

protein……………19
Bảng 2.2 Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng
độ…… …….21
Bảng 3.1 Hàm lượng protein từ các phân đoạn dịch chiết trứng
ếch…………….25
Bảng 3.2 Hàm lượng protein từ các phân đoạn dịch chiết trứng
cóc…………….26
Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ
DCTE
a
……………………………………………………… … 27
Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ
DCTE
b
……………………………………………………………28
Bảng 3.5 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ
DCTC
a
…………………………………………………… 29
Bảng 3.6 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ DCTC
b

……………………………………………… ………… 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Trứng động vật lưỡng cư … ………………………………… 2
Hình 1.2 Cấu trúc không gian của RNase A … ……………………… 5
Hình 1.3 Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase ………………………… 6
Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thuỷ phân RNA của RNase theo 2 giai đoạn
[17]………………………………………………………………………….7
Hình 1.5 Cơ chế xúc tác kiềm – acid có sự tham gia của His – 12 và His –
119
[26]………………………………………………………………………… 7
Hình 1.6 Hoạt tính cytotoxin của RNase [26]……………………………… 8
Hình 1.7 Cấu trúc ba chiều của RI (màu đỏ) và RNase A (màu xanh) [2611
Hình 2.1 Sơ đồ các giai đoạn chiết tách RNase từ trứng ếch và trứng
cóc 18
Hình 2.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và độ hấp thụ
quang………………………………………………………………….….21
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế
giới đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Năm 2012, có 8,2 triệu người trên
thế giới chết vì ung thư. Với chi phí điều trị cao, hiệu quả điều trị thấp, ung
thư trở thành gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội. Sự phát triển
không ngừng của khoa học đã đem đến cho nhân loại những thành tựu vượt
bậc, giúp chất lượng cuộc sống ngày một nâng cao. Trong lĩnh vực điều trị

ung thư – căn bệnh vốn được coi là nan y – cũng đang có những bước đột phá
đem lại cho người bệnh những hy vọng mới.
Gần đây, các nhà nghiên cứu thuộc trường Đại học Bath và tổng công
ty Alfacell đã phân lập thành công enzym Onconase và Amphinase thuộc
nhóm Ribonuclease từ tế bào trứng ếch (loài Rana pipiens). Các enzym này
đã và đang được tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng trong điều
trị ung thư đặc biệt là ung thư não. Tại Việt Nam, một số bài thuốc Đông y
dùng cóc để chữa bệnh ung thư [1]. Trong khi đó, cóc và ếch đều thuộc lớp
động vật lưỡng cư sinh sống ở nhiều vùng trong cả nước tạo nên nguồn
nguyên liệu dồi dào cho nghiên cứu enzym. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có các
nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử về Ribonuclease từ trứng ếch và trứng cóc.
Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Chiết tách và xác định hoạt tính của
Ribonuclease từ trứng cóc (Bufo sp., Bufonidae) và trứng ếch (Rana
rugolusa., Ranidae)” với các mục đích sau:
- Chiết tách được chế phẩm RNase từ trứng cóc (Bufo sp., Bufonidae) và
trứng ếch (Rana rugolusa., Ranidae) có mức độ tinh sạch khác nhau.
- Xác định được hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết của 2 loại
trứng cóc và trứng ếch.
2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM VỀ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ
Ếch và cóc phân bố ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, chúng sinh
sống ở nhiều vùng tạo nên nguồn nguyên liệu phong phú cho nghiên cứu.
Trứng đóng vai trò quan trọng trong sinh sản, chứa bộ nhiễm sắc thể
mang thông tin di truyền. Bởi vậy, trong tế bào trứng có nhiều loại enzym -
protein tham gia vào các quá trình chuyển hóa, sao chép, phiên mã, dịch mã
và tổng hợp protein duy trì bộ gen của loài. Enzym RNase từ tế bào trứng ếch
được đặc biệt chú ý trong thời gian gần đây với hoạt tính gây độc tế bào (hoạt

tính cytotoxin) đã được chiết tách và tiến hành các thử nghiệm hướng tới điều
trị ung thư.
Ếch và cóc thuộc lớp động vật lưỡng cư. Do đó, cấu tạo của trứng đều
có các đặc điểm chung của lớp lưỡng cư gồm năm phần như hình vẽ sau:

Hình 1.1 Trứng động vật lưỡng cư
1. Lớp vỏ nhầy 4. Nhân trứng
2. Màng Vitellin 5. Phôi
3. Chất lỏng Perivitellin
3


Lớp vỏ nhầy bảo vệ phôi khỏi tác động từ môi trường bên ngoài. Màng
vitellin bao quanh trứng có bản chất protein. Không gian giữa màng vitellin
và phôi được chứa đầy chất lỏng perivitellin. Nhân trứng nuôi dưỡng phôi.
Tế bào trứng của động vật lưỡng cư có enzym RNase và nhiều loại
enzym khác phục vụ cho chứa năng sinh sản và dinh dưỡng của trứng.
1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ RNASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG
CƯ
RNase thuộc nhóm enzym thủy phân [9], có cơ chất đặc hiệu là ARN.
Hiện nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 100 thành viên thuộc siêu họ RNase
A và 9 loại RNase ở người [19], [21], [22], [23], [38], [43], [45]. Các nhà
khoa học đã phân lập được RNase từ tế bào trứng ếch (Rana pipiens) có hoạt
tính gây độc tế bào [14], [17],[33].
1.2.1. Một số nghiên cứu RNase từ trứng động vật lưỡng cư
Từ những năm 1960 – 1970, RNase A, EC 3.1.27.5 trở thành mô hình
mẫu trong các công trình nghiên cứu enzym học nhờ ưu thế về nguồn tiếp
cận, khả năng tinh chế dễ dàng cũng như kích thước phân tử nhỏ ~14 kDa.
RNase A là enzym đầu tiên được xác định trình tự acid amin và là enzym thứ
ba được xác định cấu trúc sau Lysozyme và Carboxypeptidase A [17], [26],

[37].
Onconase và Amphinase là hai RNase lưỡng cư đầu tiên được phân lập
và xác định trình tự bởi tổng công ty Alfacell có hoạt tính gây độc tế bào[51].
Onconase (ONC) còn gọi là Ranpirnase được chiết tách từ tế bào trứng
ếch loài Rana pipiens với hoạt tính gây độc tế bào (hoạt tính cytotoxin) [11],
[27], [29], [44]. Onconase chủ yếu tấn công vào giai đoạn G1 ức chế chu kỳ tế
bào [12].
Tổng công ty Alfacell đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I
Ranpirnase ở bệnh nhân u trung biểu mô ác tính và ung thư phổi không phải
4


tế bào nhỏ. Hoàn thành giai đoạn III thử nghiệm đơn độc Ranpirnase ở bệnh
nhân u trung biểu mô ác tính vào tháng Tư năm 1999 [32]. Giai đoạn II thử
nghiệm lâm sàng Ranpirnase trong điều trị ung thư vú và ung thư thực quản
hoàn thành vào năm 2006 [31]. Alfacell đang tiếp tục thử nghiệm lâm sàng
giai đoạn IIIb Ranpirnase cộng với doxorubicin [29], [35]. Các thử nghiệm
cho thấy nhiều dòng tế bào ung thư nhạy cảm với Onconase [30]. Alfacell đã
nhận được chín bằng sáng chế ở Mỹ và bốn bằng sáng chế ở châu Âu về
ranphirnase.
Amphinase là enzym thứ hai được công ty Alfacell phân lập và thử
nghiệm thành công sau Onconase, một phiên bản của enzym ONC từ tế bào
trứng ếch Northern Leopard (Rana pipiens) có triển vọng rất lớn trong điều trị
ung thư, đặc biệt là ung thư não. Liệu pháp mới này đang được thử nghiệm
tiền lâm sàng [14], [40].

5


1.2.2. Cấu trúc phân tử của RNase từ trứng động vật lưỡng cư

Onconase và amphinase thuộc siêu họ RNase A có cấu trúc phân tử gần
tương đồng với RNase A.

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của RNase A [48]

RNase A có khối lượng phân tử nhỏ ~14 kD với 124 gốc acid amin, 19
trên tổng số 20 loại acid amin trong protein có mặt ở cấu trúc này trừ
Trytophan. Công thức phân tử dạng không tích điện là C
575
H
907
N
171
O
192
S
12
với
MW = 13 686 Da. Về hình dạng, RNase A giống quả thận, các gốc của trung
tâm hoạt động nằm trong vùng hốc - là vùng lõm của quả thận. Cấu trúc bậc hai
điển hình của RNase bao gồm bốn phiến cấu trúc đối song song ngược chiều kề
bên cạnh ba chuỗi xoắn ngắn. Trong phân tử có bốn cầu nối disunfid được hình
thành từ tám gốc cystein ở các vị trí 26 – 84, 40 – 95, 58 – 110 và 65 – 72. Các
cầu nối này có thể bị phá vỡ bởi mercaptoethanol, tạo thành tám nhóm - SH tự
do làm phân tử enzym bị duỗi ra và mất hoạt tính xúc tác [37].

6

Hình 1.3 Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase

Màu xanh là nhóm amin, màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng
trung tâm hoạt động.
Onconase được tinh sạch từ trứng ếch loài Rana pipiens có hoạt tính
chống ung thư. Protein này còn được kí hiệu là P 30 [13], cấu tạo từ một
chuỗi polypeptid với 104 acid amin, MW = 12 000 Da, điểm đẳng điện
khoảng 9,5 [11], [51]. Onconase khá tương đồng với RNase A3, giống nhau
tới 30% trình tự axid amin và tương tự về cấu trúc không gian 3 chiều.
Amphinase (Amph) có bốn biến thể đã được phân lập, chứa 114 acid
amin trong chuỗi polypeptid và được N-glycosyl hóa ở hai vị trí. Trình tự acid
amin tương đồng giữa các biến thể là 86,8-99,1% và giữa các biến thể với
ONC là 38,2-40,0% [41].
1.2.3. Cơ chế xúc tác của RNase từ trứng động vật lưỡng cư
Giống như RNase khác, cơ chất của RNase từ trứng ếch là ARN và có
tính đặc hiệu pyrimidin. Nó phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau pyrimidin mà
không phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau purin để tạo thành dẫn xuất
7


pyrimidin - 2’,3’ - phosphat vòng. RNase cũng xúc tác thủy phân tạo nên các
phosphat vòng cytidin - 2’,3’- phosphat và uridin - 2’,3’- phosphat [18], [37].
Phản ứng sinh hóa do RNase xúc tác là phản ứng thuỷ phân liên kết
phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thuỷ phân ARN do
RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm – acid với sự
tham gia của 2 gốc His-12 và His-119:


Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thuỷ phân RNA của RNase theo 2 giai đoạn [17]

Hình 1.5 Cơ chế xúc tác kiềm – acid có sự tham gia của His – 12 và His –
119 [26]

8


Giai đoạn 1: Phản ứng diễn ra nhanh và có thể đảo ngược, phân cắt chuỗi
polymer tạo ra sản phẩm trung gian là 2’, 3’ – nucleotid mà không giải phóng
nhóm acid. Trong giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm nhận
proton H
+
ở vị trí 2' còn His-119 đóng vai trò là acid proton hoá nhóm đi khỏi
RNA-O
Giai đoạn 2: Diễn ra chậm hơn và giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc
gốc phosphat trong quá trình thuỷ phân dẫn xuất phosphat vòng. Trong giai
đoạn này vai trò của 2 gốc His-12 và His-119 ngược lại: His-119 tương tác
với H
2
O theo cơ chế xúc tác kiềm nhận proton còn His-12 đảm nhận việc
proton hoá nhóm đi khỏi sản phẩm ở vị trí C-2' [18], [37], [44].
1.2.4. Hoạt tính gây độc tế bào của RNase từ trứng ếch
RNase đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trinh sinh học. RNase 1
giúp tiêu hóa thủy phân ARN trong thức ăn [43]. RNase H tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp AND và ARN [46]. BS – RNase tham gia ức chế miễn
dịch [24]. Các RNase có nguồn gốc từ tế bào bạch cầu ưa acid có hoạt tính
kháng khuẩn [39], chống virus [38], chống ký sinh trùng [21] và tham gia vào
hệ thống miễn dịch của cơ thể [45]. Đa số các RNase đều bị ức chế bởi RI, chỉ
có một số RNase có khả năng thoát khỏi sự ức chế của RI gây độc tế bào.

Hình 1.6 Hoạt tính cytotoxin của RNase [26]
9


Giai đoạn I: RNase tương tác với các receptor trên bề mặt tế bào.
Giai đoạn II: RNase xâm nhập vào bên trong tế bào.
Giai đoạn III: RNase thoát khỏi RI và thủy phân ARN.
Cơ sở của hoạt tính cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của
protein ức chế (RI) trong bào tương [20], [27], [37] nhờ đó RNase dễ dàng
phân cắt cơ chất ARN đặc hiệu trong tế bào.
Onconase không bị ức chế bởi RI có ở tế bào chất. Onconase bám trên
bề mặt tế bào nhờ các thụ thể, xâm nhập vào bên trong tế bào và thủy phân
ARN của tế bào đó. Do đó, ONC ức chế quá trình tổng hợp protein và gây
chết tế bào [44].
Amphinase có khả năng nhận biết và gắn vào một loại đường trên
màng tế bào ung thư, qua đó xâm nhập được vào bên trong tế bào ung thư,
phá hủy ARN, ngăn cản quá trình nhân lên của tế bào ung thư [18].
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của RNase
RNase là một protein nên hoạt động của RNase cũng phụ thuộc vào các
yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chung của một protein enzym.
Nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng xúc tác của
enzym tăng. Khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt
cực đại. Thời điểm này enzym bão hoà cơ chất. Cơ chất ARN dễ bị thủy phân
đặc biệt trong môi trường kiềm, gây sai lệch trong xác định hoạt độ enzym
[9].
Nồng độ enzym: Tốc độ phản ứng xúc tác enzym tỷ lệ thuận với hàm
lượng enzym. Khi tăng cao nồng độ enzym thì tốc dộ phản ứng không tăng
10

nữa do các sản phẩm tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzym
làm cho phản ứng đạt bão hoà [9].
Tác dụng của pH: Các nghiên cứu trước đây về RNase cho thấy hầu
hết các enzym này thể hiện hoạt tính cao nhất ở vùng pH 6 đến pH 9, pH thích
hợp nhất cho RNase hoạt động là từ 7 đến 8. Nếu pH quá cao hay quá thấp
hoạt tính RNase đều bị giảm hay biến mất. Ví dụ, RNase nấm men rượu có
pH
opt
= 7,6 [18], [44]. Tuy nhiên pH
opt
của RNase từ nọc rắn hổ mang đen
Việt Nam có giá trị rất acid pH
opt
= 2,62 ± 0,16 khác với tất cả các RNase đã
được biết đến cho tới nay [8], [9].
Tác dụng của nhiệt độ: Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phản
ứng thuỷ phân ARN của enzym. Hầu hết các RNase có nhiệt độ thích hợp cao
khoảng 40-70
0
C. Một số enzym rất bền với nhiệt nhưng hoạt tính không tăng
tuyến tính với nhiệt độ như RNase nọc rắn hổ mang đen của Việt Nam: ở 25-
49
0
C hoạt tính enzym được tăng cường, từ 59-90
0
C thì hoạt độ enzym giảm
đáng kể và tới 100
0
C thì hoạt tính lại cao nhất [7]. Một số enzym khác thì

kém bền nhiệt, ví dụ: RNase trong nọc rắn hổ mang vùng Trung Á Liên Xô
(Naja oxiana) bị mất 50% hoạt tính khi đun cách thuỷ 5 phút ở 50
0
C và mất
hoàn toàn hoạt tính khi xử lý như vậy ở 70
0
C [15], [42].
Tác dụng của ion kim loại: Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì
nó tương tác với TTHĐ và cơ chế xúc tác của enzym [9]. Ví dụ Mg
2+
ở nồng
độ 10mM làm tăng hoạt tính RNase trong rắn hổ mang (Naja oxiana) lên đến
10 lần [15] còn ở nồng độ nhỏ hơn 2mM hầu như không gây ảnh hưởng đến
hoạt tính nhưng ở nồng độ 4mM lại ức chế 50% hoạt tính của RNase ở rắn hổ
mang đen Việt Nam [7].
11


Tác dụng của chất hoạt hoá: Các chất hoạt hoá giúp tăng cường hoạt
tính thuỷ phân của RNase trong giới hạn nồng độ xác định và thường có bản
chất hoá học khác nhau:
- Các hợp chất hữu cơ như 5,6-dimethylbenzimidazole, benzynimidazole,
các chất tẩy rửa tích điện dương cũng có khả năng làm tăng hoạt tính RNase.
- Các acid amin tự nhiên có trong cơ thể như glycin, histidin… cũng
hoạt hoá RNase.
Các chất trên hoạt hoá RNase theo những cơ chế khác nhau nhưng
cùng thống nhất ở khả năng kết hợp trực tiếp với phân tử RNase, làm thay đổi
cấu trúc không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc giúp
loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản ứng [43].
Tác dụng của chất ức chế: Vai trò của các protein kìm hãm RNase

(RI) còn chưa được phát hiện toàn bộ. Các nhà nghiên cứu đưa ra nhiều giả
thiết cho vai trò sinh học của RI: điều hoà hoạt động của RNase, bảo vệ tế bào
khỏi độc tính của các RNase, theo dõi trạng thái oxy hoá tế bào với các nhân
tố như tuổi tác, stress…


Hình 1.7 Cấu trúc ba chiều của RI (màu đỏ) và RNase A (màu xanh) [26]
12


RI có khối lượng phân tử khoảng 50 000 Da, chiếm 0,01 – 0,1% tổng
số protein trong bào tương. Riêng ở nhau thai và não tỉ lệ này lớn hơn, tương
ứng là 0,1% và 0,08% [20], [37]. Cấu trúc ba chiều đặc trưng bởi các đơn vị
xoắn α và sợi β. Phân tử RI có ái lực mạnh với RNase, chúng tạo phức với
nhiều thành viên thuộc siêu họ RNase A theo tỉ lệ 1:1. Mỗi phân tử RI chứa từ
30 – 32 gốc Cys dạng khử nên môi trường khử như dịch bào rất phù hợp để
duy trì hoạt tính RI. Việc oxy hoá một gốc Cys sẽ kéo theo sự oxy hoá các
gốc còn lại. Khi bị oxy hoá, RI mất khả năng liên kết với RNase và nhanh
chóng bị thuỷ phân bởi protease trong tế bào [16], [25].
Tuy nhiên, khả năng bảo vệ tế bào của RI cũng bị hạn chế bởi một số
enzym. Hầu hết các thành viên thuộc siêu họ RNase A có cấu trúc sợi đơn đều
bị kìm hãm bởi RI có trong dịch bào, ngoại trừ ONC và Amph.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ
RNASE
1.3.1. Các phương pháp chiết tách enzym RNase
RNase là một protein do đó ta có thể áp dụng các phương pháp chiết
tách protein.
RNase trong tế bào trứng là enzym nội bào nên cần phá vỡ tế bào giải
phóng enzym. Các phương pháp có thể dùng để phá vỡ tế bào như: phương
pháp cơ học (nghiền, dùng sóng siêu âm…), sử dụng chất tẩy rửa, dùng

enzym…[2], [4], [10].
 Một số phương pháp chiết xuất enzym
- Phương pháp tủa phân đoạn: dựa trên khả năng tủa của enzym – protein ở
những nồng độ muối khác nhau hoặc tủa trong một số dung môi hữu cơ như
alcol, ceton…[6].
13


 Dùng muối vô cơ: dựa trên khả năng tủa khác nhau của protein ở các
nồng độ bão hòa khác nhau. Các muối có thể sử dụng như: (NH
4
)
2
SO
4
,
Na
2
SO4…trong đó (NH
4
)
2
SO
4
thường được sử dụng nhiều nhất do độ
hòa tan trong nước cao (720g/l ở 25
o
C), ít độc với enzym trong nhiều
trường hợp còn giúp ổn định enzym mà giá thành lại rẻ [3], [5].
 Dùng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: dung môi hữu cơ có khả năng

trộn lẫn với nước thêm vào dịch chiết sẽ làm thay đổi hằng số điện môi
giảm độ tan của enzym - protein tạo kết tủa. Thường sử dụng: aceton,
ethanol…[2], [4].
- Phương pháp gây biến tính chọn lọc: dựa trên pH và nhiệt độ, thường áp
dụng với enzym bền nhiệt hoặc bền trong môi trường acid. Theo một số kết
quả nghiên cứu, RNase khá bền nhiệt nên có thể áp dụng được phương pháp
này.
- Một số phương pháp khác: có thể sử dụng polymer [2], [36], kết tủa enzym
tại điểm đẳng điện…
 Một số phương pháp tinh chế enzym
- Phương pháp sắc ký:
 Sắc ký lọc gel: dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thước của
enzym. Thường sử dụng gel Sephadex với nhiều loại kích thước mắt
lưới khác nhau. Phương pháp này tiến hành nhanh có thể tinh chế
enzym từ chế phẩm thô, không cần thể tích dịch chiết lớn, khá phù hợp
trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm tuy nhiên lại làm loãng chế phẩm
[3], [5], [36].
 Sắc ký trao đổi ion: dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa enzym -
protein với nhựa trao đổi ion. Phương pháp này có thể tách ra nhiều
14


phân đoạn protein nhưng đối với enzym chưa biết các tính chất thì việc
lựa chọn chất mang và dung dịch phản hấp phụ sẽ khó khăn [3], [5],
[36].
- Phương pháp kết tinh: thường sử dụng (NH
4
)
2
SO

4
. Phương pháp này thực
hiện dễ dàng tuy nhiên enzym - protein thu được bị lẫn muối do đó phải tiến
hành loại muối bằng các phương pháp như: thẩm tích, lọc gel… [5], [36].
- Các phương pháp khác: phương pháp thẩm tích, phương pháp siêu ly âm,
phương pháp điện di…
1.3.2. Các phương pháp xác định hoạt độ của RNase
Về nguyên tắc có hai phương pháp chính sau:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một
thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ
chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzym xác định.
Có thể xác định hoạt độ cho mỗi enzym bằng cách sử dụng cơ chất đặc
hiệu. RNase có cơ chất đặc hiệu là ARN nên có thể sử dụng phương pháp này
để xác định hoạt độ enzym.
1.4. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE
Hiện nay, RNase đã và đang được ứng dụng nhiều trong công nghệ
sinh học. Ví dụ như chế phẩm enzym NZY RNase H (E. coli) trên thị trường
được sử dụng trong: tạo dòng phân tử bằng cách xúc tác cắt đặc hiệu ARN
của thể lai ARN:ADN mà không cắt ADN hoặc ARN không ở trong thể lai;
dùng để phá huỷ khuôn mẫu ARN sau khi tổng hợp ADN
C
thứ nhất; việc xử
lý trước ADN với enzym giúp cải thiện độ nhạy và bảo vệ mối liên kết với
mồi trong phản ứng PCR…
15


Không chỉ dừng lại trong công nghệ sinh học, với việc phân lập và phát
hiện hoạt tính gây độc tế bào của RNase từ tế bào trứng ếch đã đặt ra triển

vọng lớn trong điều trị ung thư đặc biệt là ung thư não và các loại ung thư ác
tính.
Onconase đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I, giai đoạn II và giai
đoạn III để điều trị các khối u rắn, bao gồm ung thư phổi và ung thư tuyến tụy
[30], [31], [32], [34]. Trong các thử nghiệm, ONC có tác động tích cực đến
thời gian sống trung bình của bệnh nhân. Tuy có độc tính trên thận ở liều
thấp, nhưng có thể đảo ngược sau khi ngưng điều trị. Onconase còn ức chế
virus HIV type 1 ở người [46].
Amphinase cũng đang được tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng. Đặc
biệt, amphinase được báo cáo có khả năng tìm kiếm, xâm nhập rất cao vào
các tế bào ung thư do nhận ra lớp đường đặc thù trên bề mặt tế bào ung thư và
bám chặt vào đó. Sau đó, Amphinase xâm nhập vào bên trong tế bào, thủy
phân ARN gây độc tế bào [40]. Tính chọn lọc và xâm nhập vào bên trong tế
bào ung thư ở các vị trí sâu mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư não –
một loại ung thư được biết đến là khó điều trị. Những năm gần đây, các nhà
khoa học còn tập trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính
chống ung thư nhờ việc vận dụng các kĩ thuật công nghệ sinh học hiện đại ở
mức độ phân tử. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một
hay vài gốc acid amin cần cho tương tác protein – enzym hoặc tạo thêm liên kết
disunfid làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự nhạy cảm với chất ức
chế hay các protease trong tế bào. Các biến thể của RNase cũng được tạo ra
bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase những phân tử protein liên kết đặc hiệu với
những tế bào nhất định cho phép tạo ra những chất độc chọn lọc hiệu quả [28].

16


CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên liệu
- Trứng ếch (Ranna rugulosa., Ranidae) và trứng cóc (Bufo sp.,
Bufonidae) thu mua ở chợ Vĩnh Tuy - Hà Nội, sau đó được mang về bảo quản
trong ngăn đá tủ lạnh.
2.1.2. Hoá chất
- ARN nấm men mua của hãng Sigma
- Dung dịch đệm PBS pH = 7,4
- Dung dịch acid sufuric 0,25 N
- Dung dịch casein 1%
- Thuốc thử Gornal
- Muối (NH
4
)
2
SO
4
2.1.3. Thiết bị
- Cân kỹ thuật TE412, Sartorius
- Cân phân tích TE214S, Sartorius
- Máy ly tâm lạnh Z 32 HK
- Máy đo pH Mettler Toledo
- Máy đo quang phổ hấp thụ Spectro UV – VIS Double Beam PC
Scaning Spectrophotometer UVD – 2960
- Dụng cụ thuỷ tinh khô và sạch
17


2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết tách enzym
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hòa tan enzym của dung dịch H

2
SO
4
0,25 N và dung dịch đệm PBS pH 7,4 sau khi tiến hành phá vỡ tế bào. Dung
dịch H
2
SO
4
0,25N có tác dụng vô hiệu hoá các enzym thuỷ phân có trong
lizosom tế bào động vật. Dung dịch đệm PBS pH 7,4 có pH và thành phần ion
(chứa K
+
, Na
+
) gần giống với điều kiện trong tế bào.
Tiến hành: Trứng ếch 25g hoặc 10g trứng cóc được nghiền nhỏ trong
cối với 60 ml – 80 ml dung dịch H
2
SO
4
0,25N hay dung dịch đệm PBS pH 7,4
lạnh và để 18 – 20h ở ngăn mát tủ lạnh. Ngày hôm sau, đem ly tâm với tốc độ
6000 vòng trong 1h ở 4
0
C để loại cặn và thu dịch li tâm, gọi là dịch chiết mô.
2.2.2. Kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein - enzym
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở khác nhau về khả năng tủa protein ở các
nồng độ muối bão hòa khác nhau. Khi thêm muối vào dung dịch protein
enzym, tính tan của protein enzym thay đổi, ở nồng độ muối thấp độ tan tăng
nhẹ và giảm mạnh ở nồng độ muối cao. Sự giảm độ tan của protein enzym

dẫn tới kết tủa.
Tiến hành:
Từ các DC thu được ở trên, chia DC thành bốn phần bằng nhau. Thêm
từ từ muối (NH
4
)
2
SO
4
vào DC lần lượt đạt độ bão hòa 20%, 40%, 60%, 80%.
Khuấy đều, để kết tủa qua đêm trong ngăn mát tủ lạnh. Ngày hôm sau, đem ly
tâm lạnh 1h ở 4
0
C để thu tủa. Tủa thu được đem hòa tan lại trong dung dịch
H
2
SO
4
0,25N hay dung dịch đệm PBS pH 7,4 lạnh.

18




- Nghiền nhỏ trứng trong cối đá.

- Thêm dd PBS pH = 7,4 hoặc dd H
2
SO

4

0,25N để 18 – 24h trong tủ lạnh.
- Ly tâm lạnh 4
o
C trong 1h, thu dịch.

- Chia DC làm 4 phần bằng nhau.
- Thêm muối (NH
4
)
2
SO
4
vào DC lần lượt đạt
bão hòa 20%, 40%, 60%, 80%, để kết tủa qua
đêm.
- Ly tâm lạnh 4
o
C trong 1h, thu tủa.

- Hòa tan với PBS pH 7,4 hay H
2
SO
4
0,25N.



Hình 2.1 Sơ đồ các giai đoạn chiết tách RNase từ trứng ếch và trứng cóc

Phân đoạn tủa
enzym protein
Phá vỡ tế bào trứng
Thu trứng
Dịch chiết mô
16 loại DC