Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




TRẦN THỊ HẰNG AN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ
CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU
TRÊN THỊ TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HẰNG AN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ
CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU
TRÊN THỊ TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn
2. TS. Phương Thiện Thương
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn
Viện Dược liệu


HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Hoàng Tuấn và TS.
Phương Thiện Thương, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho
tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật
viên trong bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài; các anh, chị trong khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược
liệu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm
.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa
luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô,

bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2013.
Sinh viên

TRẦN THỊ HẰNG AN


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương I. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Phân bố, sinh thái 3
1.1.3. Cách trồng 3
1.1.4. Thu hái và chế biến 3
1.2. Thành phần hóa học 3
1.2.1. Các diterpenoid 4
1.2.2. Các alkaloid 5
1.2.3. Các flavonoid 6
1.2.4. Các triterpenoid 7
1.2.5. Các steroid 7
1.3. Tác dụng dược lý 8
1.3.1. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn 8
1.3.2. Tác dụng chống viêm 8

1.3.3. Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư 8
1.3.4. Tác dụng ức chế SIRT1 9
1.3.5. Tác dụng trên tế bào tạo xương 9
1.4. Công dụng 10
1.4.1. Công dụng 10
1.4.2. Bài thuốc 10
1.5. Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển
Việt Nam IV 11
1.5.1. Định tính 11
1.5.2. Chất chiết được trong dược liệu 12
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13
2.1.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.2. Hóa chất và dung môi 14
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học 15
2.3.2. Chiết xuất, phân lập 15
2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran
diterpenoid đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá. 16
2.3.4. Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả 18
Chương III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 19
3.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 19
3.1.1. Định tính alkaloid 19
3.1.2. Định tính flavonoid 19
3.1.3. Định tính coumarin 20
3.1.4. Định tính tanin 20
3.1.5. Định tính saponin 21
3.1.6. Định tính glycosid tim 21

3.1.7. Định tính chất béo, sterol, caroten 22
3.1.8. Định tính acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid, acid amin 23
3.2. Chiết xuất, phân lập 24
3.2.1. Chiết xuất 24
3.2.2. Phân lập 25
3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học chất CT-1 27
3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 từ lá và cành cây
Khổ sâm cho lá 29
3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc kí
lớp mỏng 29
3.3.2. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao 31
3.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng chất CT-1 trong dược liệu Khổ
sâm cho lá bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 32
3.4. Bàn luận 38
3.4.1. Định tính các nhóm chất chính 38
3.4.2. Định tính và định lượng hoạt chất CT-1 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Một số ent -kauran phân lập được từ C. tonkinensis 4

Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng 13

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Khổ sâm cho lá 23

Bảng 3.2: Số liệu phổ
1
H- và
13
C-NMR chất CT-1 28

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 33

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 34

Hình 3.5: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 35

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36

Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 36

Bảng 3.8: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu lá và cành
Khổ sâm cho lá

37










DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 2

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on 4

Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá 5

Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7

Hình 1.5: Các steroid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7

Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá 13

Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao lá Khổ sâm cho lá 25

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1

27

Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CT-1 29

Hình 3.4: Sắc ký đồ chất CT-1, lá và cành cây Khổ sâm cho lá 30

Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 (Hình A), lá Khổ sâm cho lá
(Hình B), cành Khổ sâm cho lá (Hình C)
32

Hình 3.6: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 34





DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EtOAC

Ethyl acetat
EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

Hex

Hexan

SKLM

Sắc ký lớp mỏng
R
f

Hệ số lưu

UV

Phổ tử ngoại (Ultra violet)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
MS Phổ khối (Mass Spectroscopy)
NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
DĐVN Dược điển Việt Nam
M Khối lượng phân tử ( Mass)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard devition)
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
RAW 264,7 Dòng tế bào bạch cầu mono của chuột bị bệnh bạch cầu
(Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line)

1


ĐẶT VẤN ĐỀ


Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm
Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức
khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều. Tuy nhiên, hệ thống quản
lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các
cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức. Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn
kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm
như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết.
Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn
ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1].
Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây
Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm ent-kauran có tác dụng
chống ung thư và chống viêm rất mạnh [21]. Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về
dược liệu Khổ sâm cho lá. Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định
tính, định lượng ent-kauran [3].
Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần
hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên
thị trường”. Với 3 mục tiêu:
- Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá.
- Chiết xuất, phân lập 01 ent-kauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm
chất đối chiếu trong định tính, định lượng.
- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng ent-kauran phân lập được
trong dược liệu Khổ sâm cho lá.

2


Chương I. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., thuộc
họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Hình 1.1) [1], [4], [5], [7].
Tên khác: Khổ sâm cho lá, Cù đèn, Co chạy đón (Thái) [1].











Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)
Khổ sâm cho lá là cây nhỏ, mọc thành bụi cao từ 1-2 m [1], [7].
Lá mọc so le, gần như mọc đối 3-6 lá chụm lại thành kiểu vòng giả. Lá hình
mũi mác hẹp, hơi tù ở gốc, đầu nhọn, dài và có mỏ, mép nguyên dài 5-9 cm, rộng 1-
3 cm, cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót), dày
hơn ở mặt dưới. Ba gân chính tỏa ra từ gốc lá cùng với hai tuyến dạng răng nhỏ,
cuống phủ lông hình khiên, có cuống lá kèm rụng sớm. Khi phơi khô mặt lá ở dưới
có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen [1], [7].
Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành tạo thành chùm dài 2-7 cm, gồm cả hoa

đực và hoa cái hoặc hoa đực và hoa cái riêng. Hoa đực có cuống màu bạc, 5 lá đài
3


hình bầu dục, tràng 5 cánh hoa, thuôn hình dải có lông mịn ở mép, 12 nhị, chỉ nhị
có lông tơ ở phần dưới. Hoa cái có 5 lá đài hình bầu dục-mũi mác, bầu hình cầu,
thuôn dần ở đỉnh. Ba vòi nhụy xẻ đôi đến tận giữa, tỏa rộng ra [1], [7].
Quả nang hình cầu, khi khô nứt thành 3 mảnh, trên đỉnh mỗi mảnh có một
bướu nhỏ, màu hung đỏ, có lông ánh bạc [1], [7].
Hạt hình trứng, màu nâu hung, có mỏ ở đỉnh, mồng rất bé. Cây ra hoa và kết
quả từ tháng 5 đến tháng 8 [1], [7].
1.1.2. Phân bố, sinh thái
Khổ sâm cho lá được trồng ở khắp nơi, trong các vườn gia đình hoặc vườn
thuốc, chủ yếu các tỉnh phía Bắc Việt Nam [5].
Khổ sâm cho lá thuộc loại cây bụi, ưa sáng và có thể hơi chịu hạn. Cây rụng
lá hàng năm về mùa đông, sinh trưởng mạnh vào mùa hè thu, ra quả nhiều, tái sinh
tự nhiên chủ yếu bằng hạt và cây chồi sau khi chặt [1].
1.1.3. Cách trồng
Khổ sâm cho lá được trồng rải rác ở nhiều nơi để làm thuốc và làm cảnh.
Trồng bằng cành hoặc bằng hạt vào tháng 2-3. Cây không kén đất, chỉ cần không
úng ngập. Trồng ở vườn với khoảng cách 1-1,5 m hoặc trồng trong chậu. Cây có
khả năng chịu hạn tốt, không bị sâu bệnh [1].
1.1.4. Thu hái và chế biến
Thu hoạch lá và ngọn non quanh năm, rửa sạch, cắt thành từng đoạn dài
khoảng 1 cm đến 3 cm, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. Khi dùng sao vàng [3].
Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng
[1], [4], [5], [7].
1.2. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Khổ sâm cho lá cho biết
thành phần hóa học chính của C. tonkinensis là các diterpen thuộc nhóm ent-kauran.

Ngoài ra có các nhóm chất khác như flavonoid [13], alkaloid [12], steroid,
triterpenoid [10].
4


1.2.1. Các diterpenoid
Đến nay đã xác định được cấu trúc của rất nhiều diterpen phân lập từ cây C.
tonkinensis, hầu hết chúng là các chất thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung ent-
kaur-16-en-15-on (Hình 1.2). Một số crotonkin chính đã phân lập được gọi tên
(Bảng 1.1) và công thức cấu tạo (Hình 1.3).

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on
Bảng 1.1: Một số ent-kauran phân lập được từ C. tonkinensis
STT Tên khoa học CTPT M Tài liệu
1
ent-18-acetoxy-7β-hydroxy kaur-
16-en-15-on
C
22
H
32
O
4
360 [11], [23]
2
ent-1α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy
kaur-16-en-15-on
C
22
H

32
O
5
376 [31]
3
ent-7β,14α-dihydroxy kaur-16-en-
15-on
C
20
H
30
O
3
318 [25]
4
ent-18α-acetoxy-7β,14α –
dihydroxy kaur-16-en-15-on
C
22
H
32
O
5
376 [25]
5
ent-7β,18α-dihydroxy kaur-16-en-
15-on
C
20
H

30
O
3
318 [32]
6
ent-18α-acetoxy-7β-hydroxy
kauran-15-on
C
22
H
34
O
3
346 [26]
7
ent-7β,18α-diacetoxy kauran-15-
on
C
24
H
36
O
5
404 [28]
8
ent-11α,18α-diacetoxy-7β -
hydroxy kaur-16-en-15-on
C
24
H

34
O
6
418 [28]
9
ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxy
kaur-16-en-15-on
C
24
H
34
O
6
418 [26]
10
ent-1α,7β-diacetoxy-14α-hydroxy
kaur-16-en-15-on
C
24
H
34
O
6
418 [26]
5



ent-18-acetoxy-7β-hydroxy
kaur-16-en-15-on

ent-1α-acetoxy-7β,14α-
dihydroxy kaur-16-en-15-on


ent-7β,14α-dihydroxy kaur-
16-en-15-on


ent-18α-acetoxy-7β,14α-
dihydroxy kaur-16-en-15-on


ent-7β,18α-dihydroxy kaur-
16-en-15-on


ent-18α-acetoxy-7β-hydroxy
kauran-15-on


ent-7β,18α-diacetoxy kauran-
15-on


ent-11α,18α-diacetoxy-7β -
hydroxy kaur-16-en-15-on

ent-1α,14α-diacetoxy-7β-
hydroxy kaur-16-en-15-on


ent-1α,7β-diacetoxy-14α-
hydroxy kaur-16-en-15-on


Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá [21]
1.2.2. Các alkaloid
Cho đến nay đã phân lập và nhận dạng được 4 nhóm alkaloid chính từ C.
tonkinensis với bộ khung rất phong phú đó là:
6


N
H
3
CO
R
1
H
3
CO
R
2
R
3
 Alkaloid khung berbin: corytenchin, corytenchirin [9], [12].

R Tên chất
-H Corytechin
-CH
3
Corytenchirin
 Alkaloid khung protoberberin: dehydrocorytenchin [14].

 Alkaloid khung benzyltetrahydroisoquinolin: laudanidin [14].

 Alkaloid khung aporphin: corunnin, oxoglaucin [15].





1.2.3. Các flavonoid
Các flavonoid đã phân lập được từ cây C. tonkinensis là kaempferol, vitexin,
và isovitexin (Hình 1.4) [9], [13]. Kaempferol là một flavonol gặp rất phổ biến
trong giới thực vật, có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá. Vitexin
chỉ có hoạt tính yếu với nấm Aspergillius niger, còn isovitexin thì không có hoạt
tính [9].
R1 R2 R3 Tên chất
=O -O-CH
3
-CH
3
Corunnin
-O-CH
3

-O-CH
3
Oxoglaucin

N
H
R
OH
OCH
3
H
3
CO
H
3
CO
7


R
1
O
R
2



Kaempferol
(3,4’,5,7-
tetrahydroxyflavon)

Vitexin
(apigenin-8C-β-D-
glucopyranosid)
Isovitexin
(apigenin-6C-β-D-
glucopyranosid)
Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá
1.2.4. Các triterpenoid
Hai hợp chất triterpenoid được phát hiện từ C. tonkinensis đó là α-Amyrin
acetat và Acetyl aleuritolic acid [10].
AcO

AcO

α-Amyrin acetat
(urs-12-en-3β-yl acetat)
Acetyl aleuritolic acid
(3β-hydroxy taracer-14-en-28-oic acid)
1.2.5. Các steroid
Nhóm chất steroid tìm thấy trong dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của C.
tonkinensis, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3β-ol, Δ5-pregnan, có mạch
nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau. Đó là các β-sitosterol, poriferasterol, β-
sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosyl (Hình 1.5) [9].



R1 R2 Tên chất
H

β-sitosterol

H

Poriferasterol
C
6
H
12
O
5


β-sitosterol-3-
O-β-D-
glucopyranosyl

Hình 1.5: Các steroid phân lập từ
cây Khổ sâm cho lá
8


1.3. Tác dụng dược lý
1.3.1. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn
Phân đoạn alkaloid toàn phần chiết từ lá C. tonkinensis có tác dụng kháng ký
sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và P. berghei trên in-vitro và trên chuột
[19]. Một số dịch chiết (cồn, aceton, ethyl acetat và nước) và các phân đoạn
alkaloid, flavonoid có tác dụng kháng một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, E.
coli, Klebsiella, Staphylococcus aureus, nhưng không có tác dụng đến hai chủng
Samonella typhy và Shigella [19]. Năm 2006, Phan Minh Giang và cộng sự đã cho
biết tác dụng kháng tụ cầu khuẩn (S. aureus) của các ent-kauran diterpen phân lập
từ lá C. tonkinensis [29]. Các chất 1, 4 (Hình 1.3) cho tác dụng mạnh nhất trên S.

aureus và S. aureus đã kháng methicillin [29].
1.3.2. Tác dụng chống viêm
Những kết quả nghiên cứu đã khẳng định rằng các ent-kauran diterpenoid có
tác dụng chống viêm mạnh. Năm 2003, bốn diterpen 1-4 (Hình 1.3) được phát hiện
có tác dụng ức chế quá trình kích thích NF-κB và ức chế tổng hợp ra nitric oxid
(NO) trên tế bào RAW 264,7 được kích hoạt bởi lypopolysachrid (LPS), mạnh hơn
nhiều hai chất đối chứng là parthenolid và aminoguanidin [25]. Chúng còn ức chế
sự hoạt động của enzym NADPH oxidase (NOX), một tác nhân quan trọng trong
quá trình gây viêm. Hai grayanan diterpenoid tách từ Khổ sâm cho lá cũng thể hiện
tác dụng chống viêm khi ức chế sự hóa enzym Cyclooxygenase 2 (COX-2), tuy
nhiên, cả hai chất đều có tác dụng ức chế COX-2 kém hơn chất 1 (Hình 1.3) [21],
[34]. Như vậy, 1 là chất có tác dụng chống viêm mạnh nhất trong dược liệu Khổ sâm
cho lá.
1.3.3. Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư
Dịch chiết phân đoạn dicloromethan từ Khổ sâm cho lá có tác dụng ức chế sự
phát triển của các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư màng tử cung người
(FI), ung thư biểu mô (KB), ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCI-H460, SF-268
[34]. Phân lập các hoạt chất theo định hướng thử hoạt tính. Kết quả thu được cho
9


thấy cấu trúc 16-en-15-one (O = C − CH = CH −), nhóm OH ở vị trí số 7, và nhóm
acetyl ở vị trí số 18 rất quan trọng đối với tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư [33], [36]. Cơ chế của tác dụng chống ung thư có thể là ức chế NF-B, ức chế sự
tăng sinh mạch máu, hay theo cơ chế apoptosis [21]. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ
ra rằng 1 không có độc tính đối với các nguyên bào sợi. Điều này có nghĩa khi điều
trị bằng 1 tế bào bình thường ít bị ảnh hưởng hơn so với các tế bào khối u, do cơ
chế chống ung thư tạo ra bởi 1 tập trung vào các tế bào khối u [36].
1.3.4. Tác dụng ức chế SIRT1
Các chất 1-5, 9 và 10 (Hình 1.3) có tác dụng ức chế Sirt1 mạnh hơn chất đối

chiếu dương là nicotinamid. Giống ba tác dụng trước, cấu trúc 16-en-15-one
(O=C
−CH=CH−) k
ết hợp với nhóm thế (OH hoặc OAc) tại vị trí số 7 đặc biệt quan
trọng cho tác dụng ức chế Sirt1. Có nhiều chất tự nhiên và tổng hợp ức chế Sirt1 đã
được tìm thấy, nhưng việc tìm ra các diterpen nhóm ent-kauran có tác dụng mạnh hơn
so với nicotinamid đã đưa ra một nhóm chất mới có tác dụng ức chế protein Sirt1 [25].
Sirt1 (hay sir2

) là một thành viên của Sirtuin được tìm thấy trong tế bào của người, đó
là một nhóm protein chứa các enzym histone deacetylase hoặc mono-ribosyl
transferase. Sirtuin đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh học
trong sinh vật, có ảnh hưởng đến các quá trình sao chép, lão hóa, apoptosis. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất có ức chế Sirt1 có thể có tác dụng chống ung
thư. Như vậy, tác dụng ức chế Sirt1 có thể gợi ý một cơ chế tác dụng chống ung thư
mới của các ent-kauran diterpen phân lập từ C. tonkinensis [21].
1.3.5. Tác dụng trên tế bào tạo xương
Các diterpenoid ent-kauran từ Khổ sâm cho lá còn có tác dụng kích thích
trực tiếp vào nguyên bào xương. Đó là các phân tử điều trị tiềm năng chống lại các
bệnh về xương như loãng xương [35].
Phương Thiện Thương và cộng sự đã chứng minh ent-7

-hydroxy-15-oxo
kaur-16-en-18-yl acetat (1) là chất thường có tác dụng tốt nhất đối với tất cả các
nghiên cứu về kháng khuẩn, ức chế các enzym nitric oxide synthetase và NADPH
10


oxidase (NOX), ức chế sự hoạt động của các protein NF-B và Sirt1, và độc đối với
các tế bào ung thư [21]. Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng

hàm lượng 1 trong các mẫu Khổ sâm cho lá trên thị trường là rất cần thiết.
1.4. Công dụng
1.4.1. Công dụng
Khổ sâm cho lá được dùng trị ung nhọt, sang lở, chốc đầu (sắc uống và rửa
ngoài), đau bụng khó tiêu, lỵ, viêm loét dạ dày, tá tràng. Ngoài ra, Khổ sâm cho lá
còn được dùng trong các phương thuốc chữa mẩn ngứa, phong hủi, vảy nến, viêm
âm đạo trùng roi và sa sinh dục (sắc uống và rửa ngoài). Liều dùng hàng ngày là 12-
24 g, có khi tới 40 g, dạng thuốc sắc [1], [19].
1.4.2. Bài thuốc
1.4.2.1. Chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1], [7], [19]
a. Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 50 g; Bồ công anh 20 g. Sắc uống.
b. Lá Khổ sâm cho lá, Bồ công anh, Nhân trần, mỗi vị 12 g; Lá khôi, Chút
chít, mỗi vị 10 g. Tán bột, mỗi ngày uống 30 g với nước đun sôi để nguội.
c. Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 40 g; Bồ công anh 20 g; Uất kim, Hậu
phác, mỗi vị 12 g; Ngải cứu 8 g; Cam thảo 4 g. Sắc uống hoặc nấu cao pha siro
uống.
1.4.2.2. Chữa đau bụng không rõ nguyên nhân [1]
Nhai mấy lá Khổ sâm cho lá tươi với muối, nếu có nôn hay sôi bụng thêm
miếng gừng tươi.
1.4.2.3. Chữa lỵ cấp tính, tiêu chảy [1], [19]
a. Lá Khổ sâm cho lá, lá Phèn đen, mỗi thứ một nắm sắc uống.
b. Khổ sâm cho lá, Rau sam, Cỏ sữa, Cỏ nhọ nồi, lá Mơ lông, mỗi vị 10 g,
sắc uống ngày 1 thang.
c. Khổ sâm cho lá 16 g; Hương phụ 10 g; củ Sả 6 g; vỏ Quýt 6 g; Gừng khô
3 lát. Sắc uống ngày 1 thang.
11


1.4.2.4. Chữa viêm da thần kinh thể phong nhiệt mới mắc [1]
a. Khổ sâm cho lá 12 g; Sinh địa, Thổ phục linh, mỗi vị 16 g; Cúc hoa, Kim

ngân hoa, Ké đầu ngựa, mỗi vị 12 g; Đan bì 8 g. Sắc uống ngày một thang.
b. Khổ sâm cho lá 12 g ; Kinh giới, Sinh địa, mỗi vị 16 g; Phòng phong, Kim
ngân, Cúc hoa, Tạo giác thích, mỗi vị 12 g; Thuyền thoái 6 g. Sắc uống ngày một
thang.
1.4.2.5. Chữa bệnh phong hủi [19]
a. Khổ sâm cho lá 500 g; lá Xoan 300 g; rượu trắng 1 lít. Ngâm rượu uống.
b. Khổ sâm cho lá 600 g; Tạo giác bỏ vỏ 1000 g; Hà thủ ô trắng 200 g;
Phòng phong 100 g. Hoàn to bằng hạt ngô, ngày uống 3-4 lần, mỗi lần 20 viên.
1.4.2.6. Chữa vảy nến [1]
Khổ sâm cho lá, Huyền sâm, Kim ngân, Sinh địa, mỗi loại 15 g; quả Ké 10 g.
Làm thành viên, ngày uống 20-25 g.
1.5. Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược
điển Việt Nam IV [3].
DĐVN IV đã có riêng một chuyên luận về Khổ sâm cho lá trong đó trình bày
các phần: mô tả thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột), độ ẩm, tro toàn phần,
tạp chất, tỉ lệ thân cành, chế biến, bảo quản, tính vị-quy kinh, công năng-chủ trị,
cách dùng-liều lượng và có cả các tiêu chuẩn để định tính theo phản ứng hóa học,
sắc ký lớp mỏng và tiêu chuẩn định lượng theo chất chiết được trong dược liệu.
1.5.1. Định tính
A. Lấy khoảng 2 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25 ml dung
dịch acid sulfuric 2% (TT). Đun cách thủy ở 100
0
C trong 10 phút, lọc. Lấy khoảng
1 ml dịch lọc cho vào chén sứ trắng. Thêm 5 giọt đến 6 giọt thuốc thử Dragendoff
(TT). Để yên khoảng 1 phút sẽ có tủa màu cam sậm.
Lấy khoảng 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt
(III) clorid 5% (TT), xuất hiện màu nâu đen.
B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
12

Bản mỏng: Silica gel 60 F
254

Dung môi khai triển: Benzen- EtOAc (95:5)
Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu, thêm 50 ml EtOH 96 % (TT).
Đun hồi lưu cách thủy ở 100
0
C trong 20 phút. Lọc qua giấy lọc. Cô cách thủy dịch
lọc đến cắn, hòa cắn trong 2 ml EtOAc (TT), để bốc hơi còn khảng 1 ml, dùng dung
dịch này làm dịch thử. Hoặc sử dụng cắn còn lại trong mục “Chất chiết được trong
dược liệu” hòa tan trong 2 ml EtOAc (TT) để làm dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g bột Khổ sâm cho lá (mẫu chuẩn), thêm 50 ml
EtOH 96% (TT), tiến hành chiết như dung dịch thử.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 µl dung dịch thử
và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm,
lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát màu sắc các vết ở ánh sáng
thường và dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm. Sau đó phun lên bản mỏng
dung dịch vanilin – sulfuric (TT), sấy bản mỏng ở 100
0
C đến 105
0
C trong khoảng 5
phút. Trên sắc đồ chưa phun thuốc hiện màu của dung dịch thử phải có vết cùng
màu vàng tươi ở ánh sáng thường, phát quang màu xanh lơ khi quan sát dưới ánh
sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm và cho màu tím đậm khi phun thuốc hiện màu
với giá trị R
f
khoảng 0,8. Ngoài ra, còn có nhiều hơn 4 vết màu tím hay xanh tím và
một số vết màu lục vàng hay xanh lá, có cùng màu sắc và giá trị R

f
với các vết của
dung dịch đối chiếu.
1.5.2. Chất chiết được trong dược liệu
Không ít hơn 8,0 % tính theo dược liệu khô kiệt.
Tiến hành theo phương pháp chiết nóng, dùng EtOH 96 % (TT) làm dung
môi.
Các tiêu chuẩn của DĐVN IV mới chỉ giúp định tính và định lượng các
thành phần hóa học chung có trong Khổ sâm cho lá mà chưa có quy định về định
tính và định lượng ent-7

-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (1) là hoạt chất
chính có giá trị cao trong y học.
13


Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu



Lá Cành non Cành già
Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá
Nguyên liệu để chiết xuất và phân lập ent-kauran diterpenoid là lá cây Khổ
sâm cho lá thu hái ở Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội, tháng 1 năm 2013. Mẫu dược
liệu đã được TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà
Nội, xác định tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., mã tiêu bản số
HNIP/17851/13 (Phụ lục 1). Mẫu nghiên cứu hiện còn lưu tại Khoa Hóa phân tích –
Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.

Nguyên liệu để định lượng là các mẫu lá, cành cây Khổ sâm cho lá thực tế
dùng để kiểm nghiệm được thu hái ở các địa phương khác nhau vùng Bắc bộ (Bảng
2.1). Các mẫu thực tế được phơi, sấy khô ở 50
0
C và lưu tại Khoa Hóa phân tích -
Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng
STT Nơi thu hái
Ngày lấy
mẫu
Bộ phận
dùng
Ký hiệu
mẫu
Độ ẩm
(%)
1
Ba Vì – Hà Nội 15/07/2012
Lá L1 10,86
Cành non
CN1
11,23
2
Mỹ Đức – Hà
Nội
15/01/2013
Lá L2 12,47
Cành non CN2 12,78
14

3
Thành phố Bắc
Giang – BG
28/03/2013
Lá L3 11,47
Cành non CN3 11,55
4
Vụ Bản – Nam
Định
23/03/2013
Lá
L4
11,46
Cành non CN4 10,98
5
Phố Lãn Ông –
Hà Nội
02/04/2013
Lá L5 11,22
Cành già CG5 10,59
6
Thành phố Vĩnh
Yên – VP
20/02/2013
Lá
L6
8,62
Cành già CG6 9,17
7

Chợ Đồng Xuân
– Hà Nội
12/04/2013
Lá L7 12,85
Cành già CG7 6,70
8
Thành phố Bắc
Ninh – BN
20/04/2013
Lá
L8
7,13
Cành già CG8 6,69
2.1.2. Hóa chất và dung môi
Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu
chuẩn phân tích; dung môi dùng cho HPLC, HPTLC của hãng Merck; dung môi
dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng.
Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F
254
(Merck).
Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck).
Hóa chất: dung dịch H
2
SO
4
đặc, dung dịch NaOH 10%, dung dịch HCl đặc,
dung dịch FeCl
3
, dung dịch gelatin 1%… Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng thuốc
thử: Dragendroff, Mayer, Liebermann-Burchard…

2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Cân kỹ thuật Precisa XT 620M.
Cân phân tích Precisa XT 220A.
Máy cất quay Buchi B481.
Tủ sấy Binder – FD 115.
Máy HPTLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5.
Hệ thống CAMAG REPROSTAR3 kết nối với máy vi tính.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – LC 10A (Shimadzu).

Máy đo điểm nóng chảy GALLENKAMP (Sanyo) của Nhật Bản.
Máy đo phổ tử ngoại UV-1800 Spectrometer (Shimadzu) của Nhật Bản.
15


Máy đo phổ hồng ngoại (IR) GX-PerkinElmer (Mỹ).
Máy đo phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) AGILENT 1100 LC-MSD
Tram.
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H- và
13
C-NMR Bruker AM500-FT-
NMR và sử dụng dung môi CDCl
3
để hòa tan chất.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Định tính sơ bộ thành phần hóa học lá cây Khổ sâm cho lá bằng các phản
ứng ống nghiệm.
- Phân lập, tinh chế (độ tinh khiết > 90%) và xác định công thức hóa học 01
ent-kauran diterpenoid (CT-1) chính từ lá cây Khổ sâm cho lá.

 Phân lập, tinh chế bằng các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, kết tinh…).
 Xác định công thức bằng các phương pháp phổ (UV, IR, MS, NMR…).
- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 trong mẫu lá và
cành cây Khổ sâm cho lá.
 Định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
 Định lượng hàm lượng CT-1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học
Định tính các nhóm chất có trong lá Khổ sâm cho lá bằng các phản ứng hóa
học thường quy [2].
2.3.2. Chiết xuất, phân lập
2.3.2.1. Chiết xuất
Để chiết được nhóm chất chứa trong đối tượng nghiên cứu, phải xây dựng
được các quy trình chiết xuất thích hợp. Tùy theo tính chất của mỗi chất mà sử dụng
dung môi có độ phân cực khác nhau. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá
16


trình chiết xuất (chiết ở nhiệt độ phòng, chiết nóng) để đảm bảo hợp lý cả hai yêu
cầu: Chiết được tối đa lượng chất nghiên cứu và tối thiểu tạp chất để thuận tiện cho
quá trình phân lập và tinh chế tiếp theo. Sử dụng phương pháp chiết ở nhiệt độ
phòng hoặc chiết nóng với methanol, ethanol ở các độ cồn khác nhau.
2.3.2.2. Phân lập chất bằng phương pháp sắc ký cột (CC)
Tiến hành phân lập chất bằng phương pháp sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh là
Silica gel 60 (Merck). Để lựa chọn dung môi rửa giải hợp lý, chúng tôi tiến hành
định tính bằng sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn thu được.
2.3.2.3.
Xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Xác định cấu trúc chất phân lập thông qua phân tích tính chất hóa lý (cảm
quan, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phân tích các phổ
hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (
1
H-NMR và
13
C-
NMR) và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo.
2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran diterpenoid
đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá
2.3.3.1. Định tính bằng phương pháp sắc ký
Dùng các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao
để định tính ent-kauran diterpenoid đã phân lập từ lá và cành cây Khổ sâm cho lá.
a) Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)
Khảo sát điều kiện phân tích định tính phù hợp áp dụng để định tính ent-
kauran có trong lá Khổ sâm cho lá gồm có các yếu tố liên quan như: Cách xử lý
mẫu, pha tĩnh, pha động, cách phát hiện…
 Chuẩn bị:
- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 105
0
C trong 30 phút.
- Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá
1cm), để bão hòa trong 30 phút.