Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn định của viên nén alpha chymotrypsin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH
GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NÉN
ALPHA-CHYMOTRYPSIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH
GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NÉN
ALPHA-CHYMOTRYPSIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Thạch Tùng
2. TS. Nguyễn Thị Liên
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Bào chế
2. Bộ môn Công nghiệp dược
3. Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương
HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Thạch
Tùng, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong q trình hồn thành khóa
luận. Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ về
kiến thức mà còn cả về sự đam mê với khoa học.
Em cũng chân thành cám ơn TS. Nguyễn Thị Liên và các cán bộ phòng Dược
lý, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. Sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của
các anh chị đã giúp em có điều kiện hồn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất.
Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng nhận được sự giúp
đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô giáo, kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế và Bộ
môn Công nghiệp Dược. Em xin cám ơn những sự giúp đỡ quý báu này.
Cuối cùng em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong
suốt quá trình nghiên cứu và học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Phạm Thanh Tùng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ................................................................... 2
1.1. Đại cương về alpha-chymotrypsin ................................................ 2
1.1.1. Nguồn gốc, cấu tạo .................................................................... 2
1.1.2. Tính chất hóa lý ......................................................................... 2
1.1.3. Phương pháp định lượng ........................................................... 2
1.1.4. Đơn vị tính ................................................................................. 3

1.1.5. Tác dụng dược lý ....................................................................... 3
1.1.6. Chỉ định ..................................................................................... 3
1.1.7. Liều lượng và cách dùng ........................................................... 3
1.1.8. Tác dụng không mong muốn..................................................... 4
1.1.9. Chế phẩm ................................................................................... 4
1.2. Độ ổn định và các phương pháp cải thiện độ ổn định của
enzym. ..................................................................................................... 4
1.2.1. Quá trình bất hoạt enzym .......................................................... 4
1.2.2. Các tác nhân gây bất hoạt của enzym ....................................... 6
1.2.3. Các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym. ................ 10
1.3. Đại cương về đông khô ................................................................ 11
1.3.1. Khái niệm ................................................................................ 11
1.3.2. Ảnh hưởng của các giai đoạn đông khơ tới hoạt tính enzym.. 11
1.3.3. Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ
ổn định của các chế phẩm sinh học. .................................................. 13
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................... 16
2.1.1. Nguyên vật liệu ....................................................................... 16
2.1.2. Thiết bị..................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................... 17


2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................. 17
2.3.1. Phương pháp bào chế. ............................................................. 17
2.3.2. Phương pháp đánh giá. ............................................................ 20
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................... 26
3.1. Nghiên cứu bào chế bột đông khô alpha – chymotrypsin ........ 26
3.1.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công thức. ..................................... 26
3.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố quy trình .............................................. 37
3.1.3. Đánh giá hoạt tính của bột đơng khơ. ..................................... 38

3.2. So sánh bột đông khô ACT với nguyên liệu ACT ban đầu ...... 38
3.2.1. Khả năng ổn định với chu trình nhiệt-lạnh. ............................ 39
3.2.2. Khả năng ổn định với yếu tố nhiệt-ẩm. ................................... 39
3.2.2. Khả năng ổn định dưới tác động của lực cơ học. .................... 41
3.3. Nghiên cứu bào chế viên nén chứa bột đông khô alphachymotrypsin ....................................................................................... 42
3.3.1. Lựa chọn phương pháp bào chế. ............................................. 42
3.3.2. Ảnh hưởng của tá dược độn. ................................................... 43
3.3.3. Ảnh hưởng của lực dập. .......................................................... 45
3.4. Đánh giá độ ổn định của viên nén alpha-chymotrypsin ........... 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ACT

Alpha-chymotrypsin

BĐK

Bột đông khô

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

USP

Dược điển Mỹ

ATEE

N-acetyl-L-tyrosin ethyl este

CT

Công thức

PBS

Đệm phosphat


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Các loại chế phẩm trên thị trường của alpha-chymotrypsin.

4

Bảng 1.2. Phân loại các dạng biến đổi cấu trúc của alpha-chymotrypsin.

5

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của pH đến trạng thái của alpha-chymotrypsin.

8

Bảng 1.4. Các phương pháp cải thiện độ ổn định của alphachymotrypsin.
Bảng 1.5. Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ
ổn định của chế phẩm sinh học trong những năm gần đây.

10

14

Bảng 2.1. Nguyên vật liệu

16

Bảng 3.1. Khảo sát tá dược tạo thể chất

26

Bảng 3.2. Thể chất và hàm ẩm của bánh đông khô và bột đông khô khi
sử dụng các tá dược tạo thể chất khác nhau.
Bảng 3.3. Bảng khảo ảnh hưởng của tá dược A trong môi trường đệm
7,8
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược A tới độ tan và pH
của ACT trong môi trường pH 7,8.
Bảng 3.5. Bảng khảo sát ảnh hưởng của tá dược A với các yếu tố biến
tính.
Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược A tới hàm ẩm của bột đơng
khơ.
Bảng 3.7. Khảo sát độ tan của ACT khi có mặt tá dược A tại 80oC
trong 2 giờ.

27

29

30

31

33

34

Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của chất diện hoạt

35

Bảng 3.9. Khảo sát một số thơng số quy trình.

37

Bảng 3.10. Hoạt tính của alpha-chymotrypsin trước và sau đông khô

38

Bảng 3.11. Hàm ẩm và hoạt tính cịn lại của ACT và ACT đơng khơ sau
chu trình nhiệt lạnh.

39

Bảng 3.12. Hàm ẩm và hoạt tính của alpha-chymotrypsin và alphachymotrypsin đông khô trong điều kiện nhiệt độ 40oC, hàm ẩm 75% theo

40

thời gian.
Bảng 3.13. Hoạt tính cịn lại của viên nén chứa alpha-chymotrypsin
đông khô và viên nén alpha-chymotrypsin sau khi dập.
Bảng 3.14. Góc trơn chảy của các khối bột.
Bảng 3.15. Hoạt tính và hoạt tính cịn lại của viên nén sử dụng isomalt,
tá dược C và carrageenan tại các thời điểm khác nhau.
Bảng 3.16. Hoạt tính và hoạt tính còn lại của viên nén khi sử dụng các
mức lực khác nhau.
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ ổn định của công thức tối ưu.

41
42
43

45
47


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình vẽ
Hình 1.1. Cấu trúc 3 chiều của phân tử alpha chymotrypsin.
Hình 1.2. Đường biểu diễn động học quá trình bất hoạt của alphachymotrypsin.

Trang
2
5

Hình 1.3. Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin.

6

Hình 1.4. Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin.

8

Hình 1.5. Các giai đoạn của quá trình đơng khơ

11

Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế bột đơng khơ alpha
chymotrypsin.

17

Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt quy trình bao chế viên nén alphachymotrypsin.

19

Hình 3.1. Thể chất của bánh đông khô khi sử dụng các loại tá dược
độn khác nhau trong môi trường PBS 7,8 và HCl 0,001N.

28

Hình 3.2. Trạng thái hịa tan trở lại của các mẫu đơng khơ.

32

Hình 3.3. Độ tan của alpha-chymotrypsin trong các mơi trường khác
nhau.

33

Hình 3.4. Độ tan của ACT sau khi gây biến tính ở nhiệt độ 80oC trong
2 giờ.

34

Hình 3.5. Thể chất của bánh đông khô sử dụng các loại chất diện hoạt
khác nhau.

36

Hình 3.6. Hoạt tính cịn lại của alpha-chymotrypsin và alphachymotrypsin đông khô trong điều kiện nhiệt độ 40 ± 2 oC, hàm ẩm 75
± 5% theo thời gian.

40

Hình 3.7. Hoạt tính cịn lại của viên nén sử dụng các loại tá dược độn
khác nhau theo thời gian khi lão hóa cấp tốc trong điều kiện 40 ± 2 oC,
hàm ẩm 75 ± 5%.

44

Hình 3.8. Hoạt tính còn lại của viên nén alpha-chymotrypsin sau khi
dập với các mức lực khác nhau.

45


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học hiện đại, việc ứng
dụng các chất có nguồn gốc sinh học vào điều trị đang là một hướng đi mới và hứa
hẹn mang lại hiệu quả cao. Nhiều chất đã và đang đóng vai trị quan trọng trong công
tác điều trị bệnh như insulin, γ-interferon, α-chymotrypsin,… Tuy nhiên, việc phát
triển chế phẩm chứa các chất có nguồn gốc sinh học lại gặp phải một trở ngại lớn, đó
là độ ổn định. Sự mất hoạt tính nhanh chóng của dược chất đã đặt ra một bài tốn rất
khó để ứng dụng rộng rãi các chế phẩm sinh học vào thực tế điều trị.
Alpha-chymotrypsin là một enzym sinh học thường được thương mại hóa dưới
dạng viên nén để điều trị các triệu chứng viêm. Tuy nhiên, một vấn đề thường gặp
phải của các chế phẩm này là khó có thể duy trì được hoạt tính cần thiết sau một thời
gian lưu hành trên thị trường. Điều này là do bản thân alpha-chymotrypsin rất nhạy
cảm với các yếu tố mơi trường, đặc biệt là trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm
của Việt Nam. Việc khắc phục nhược điểm này đang thu hút được sự quan tâm chú
ý của các nhà sản xuất và các nhà nghiên cứu.
Xuất phát từ thực tế nêu trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn
định của viên nén alpha-chymotrypsin” được chúng tôi tiến hành với mục tiêu:
Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế viên nén alpha-chymotrypsin có khả
năng duy trì được độ ổn định cao trong quá trình bào chế và bảo quản ban đầu.


2

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về alpha-chymotrypsin

1.1.1. Nguồn gốc, cấu tạo
- α-chymotrypsin được điều chế bằng cách phân giải chymotrypsinogen bằng trypsin
được chiết xuất từ tuyến tụy của bị.
- α-chymotrypsin có phân tử lượng là 25000 Da được cấu tạo từ 3 chuỗi peptid: chuỗi
A (Cys1 - Leu3), chuỗi B (Ile16 – Tyr 146) và chuỗi C (Ala149 – Asn245) được nối
với nhau bởi 5 cầu nối disulfit, tổng số acid amin là 245 [18].
- α-chymotrypsin thuộc nhóm serin-protease có trung tâm hoạt tính là bộ 3 acid amin
Asp102-His57-Ser195.

Hình 1.1. Cấu trúc 3 chiều của phân tử alpha chymotrypsin [18].
1.1.2. Tính chất hóa lý
- Cảm quan: Dạng bột kết tinh/ vơ định hình màu trắng. Dạng vơ định hình hút ẩm
mạnh.
- Độ tan:Hơi tan trong nước.
- Điểm đẳng điện pI = 8,5 [19].
- pH: Dung dịch 1% trong nước có pH trong khoảng từ 3,0 đến 5,0 [7].
1.1.3. Phương pháp định lượng
Hiện nay, theo tiêu chuẩn của các dược điển Anh và Mỹ, alpha-chymotrypsin
(ACT) được định lượng bằng cách so sánh tốc độ thủy phân N-acetyl-L-tyrosin ethyl


3

este (ATEE) của mẫu thử alpha-chymotrypsin so với alpha-chymotrypsin chuẩn trong
cùng một điều kiện.
𝑎𝑙𝑝ℎ𝑎−𝑐ℎ𝑦𝑚𝑜𝑡𝑟𝑦𝑝𝑠𝑖𝑛

𝐴𝑇𝐸𝐸 + 𝐻2 𝑂 →

𝑁 − 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐿 − 𝑡𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛 + 𝑒𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙

 Định lượng bằng phương pháp đo quang [37] (theo Dược điển Mỹ USP 34):
Tốc độ thủy phân ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm độ hấp thụ ánh sáng
của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian nhất định.
 Định lượng bằng phương pháp phân tích thể tích [7] (theo Dược điển Anh BP
2013):
Tốc độ thủy phân ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm pH của dung
dịch cơ chất sau những khoảng thời gian nhất định.
1.1.4. Đơn vị tính
- Microkatal (theo Dược điển Anh và Dược điển châu Âu).
- Đơn vị USP (theo dược điển Mỹ).
- Đơn vị FIP (theo Hiệp hội Dược quốc tế).
1.1.5. Tác dụng dược lý
- Alpha-chymotrypsin có tác dụng làm tan dây chằng thủy tinh thể, được dùng trong
nhãn khoa để bỏ nhân mắt đục trong bao và giảm chấn thương.
- Alpha-chymotrypsin được sử dụng nhằm làm giảm viêm và phù mô mềm do apxe
và loét hoặc do chấn thương. Enzym này còn giúp làm giảm các dịch tiết đường hô
hấp trên ở người bệnh hên, viêm phế quản, bệnh phổi và viêm xoang [1].
1.1.6. Chỉ định
- Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng.
- Phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật.
- Hỗ trợ bệnh lý viêm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhày đờm, dịch rỉ viêm [1].
1.1.7. Liều lượng và cách dùng
- Hỗ trợ phẫu thuật đục thủy tinh thể: 1-2 ml dung dịch chứa 150 U/mg hoặc 75 U/mg
bơm vào đáy mắt, có thể thêm 1-2 ml qua lỗ cắt mống mắt nếu cần thiết.
- Điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật: Tiêm bắp liều 5000 đơn vị
USP, 1-3 lần/ngày.


4

- Nếu dùng viên nén, dùng 4-6 viên/ngày ngậm dưới lưỡi, chia làm nhiều lần hoặc
uống 2 viên/ lần, 3-4 lần/ngày.
1.1.8. Tác dụng không mong muốn
- Thường gặp nhất là tăng nhất thời nhãn áp do các mảnh vụn dây chằng bị tiêu hủy
làm tắc mạng bó dây. Dùng trong nhãn khoa có thể gặp phù giác mạc, viêm nhẹ màng
bồ đào.
- Alpha-chymotrypsin có tính kháng ngun nên sau khi tiêm bắp có các phản ứng dị
ứng nặng [1].
1.1.9. Chế phẩm
Alpha-chymotrypsin có rất nhiều chế phẩm trên thị trường với các dạng bào chế
khác nhau.
Bảng 1.1. Các loại chế phẩm trên thị trường của alpha-chymotrypsin.
Tên thương mại

Loại chế phẩm

Alphachoay (Sanofi Aventis),

Viên nén 21 μkatal

Alphachymotrypsin GLOMED (GLOMED)

Viên nén phối hợp alpha
chymotrypsin,

trypsin

(100mg) và các enzym

Intenzym ForteTM (Biotics)

khác.
Bột pha dung dịch tiêm bắp Michosin (Arrow Pharm Group)
5000 đơn vị

Chymotrysin Inj (Vimedimex II)

1.2. Độ ổn định và các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym.
1.2.1. Quá trình bất hoạt enzym
Cấu trúc 3 chiều tinh vi và phức tạp của enzym là yếu tố quyết định hoạt tính
xúc tác của chúng. Bất kỳ yếu tố nào làm biến đổi cấu trúc đặc biệt này đều ảnh hưởng
đến hoạt tính enzym.
Sự bất hoạt enzym bao gồm sự biến đổi về mặt vật lý và hóa học:


5

Bảng 1.2. Phân loại các dạng biến đổi cấu trúc của alpha-chymotrypsin [3].
Biến đổi về mặt vật lý
- Biến tính.
- Đông tụ.
- Kết tủa.
- Hấp phụ bề mặt.

Biến đổi về mặt hóa học
- Thủy phân (đặc biệt là thủy phân nhóm
amid).
- Oxy hóa.
- Racemic hóa.

- Chuyển dạng đồng phân.
- Trao đổi liên kết disulfit.
- Quang hóa.
- Phản ứng tách β.

Động học của quá trình bất hoạt được James P.Henley và cộng sự biểu diễn qua
giản đồ:

Trong đó:
E là dạng có cấu trúc tự nhiên, E1 là dạng trung gian và E2 là dạng mất cấu trúc.
k1, k2: hằng số tốc độ bất hoạt bậc 1.
α1, α2: tỷ số hoạt tính riêng E1/E và E2/E (α2 = 0 trong trường hợp của ACT).
Hoạt tính cịn lại của alpha-chymotrypsin được tính theo công thức:
𝑎 = (1 +

𝛼1 𝑘1
𝑘2 −𝑘1

) 𝑒 −𝑘1 𝑡 −

𝛼1 𝑘1
𝑘2 −𝑘1

𝑒 −𝑘2 𝑡 [15].

Đường biểu diễn động học của q trình bất hoạt của alpha-chymotrypsin có dạng
như trong hình 1.2.

Hình 1.2. Đường biểu diễn động học quá trình bất hoạt của alpha-chymotrypsin [15].

6

1.2.2. Các tác nhân gây bất hoạt của enzym
Các loại tác nhân gây bất hoạt alpha chymotrypsin thường được chia làm 3
nhóm chính: tác nhân vật lý, tác nhân hóa học và tác nhân sinh học.
1.2.2.1. Tác nhân vật lý
a) Nhiệt độ
Ở nhiệt độ thấp, việc tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng xúc tác của
enzym cho tới một mức độ nhất định. Sau đó, tăng nhiệt độ sẽ làm tăng cả tốc độ và
mức độ mất hoạt tính của enzym.

Hình 1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến α-chymotrypsin.(A) Sự mất hoạt tính ở

30oC(●), 40oC(▲), 43oC (□) và 45oC (■), 50oC (○) và 60oC (). (B) Ảnh hưởng nhiệt
đến hoạt tính xúc tác của α-chymotrypsin ở 40oC [19].

Với alpha chymotrypsin, khi trong đệm phosphat pH 7,0, enzym có hoạt tính
cao nhất ở khoảng 40oC và mất hồn tồn hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới 50-60oC [19].
b) Lực cơ học
Lực cơ học là tác nhân gây mất hoạt tính này thường gặp trong q trình dập
viên. Bên cạnh việc cung cấp năng lượng để hình thành các liên kết cần thiết tạo thành
viên, việc tác động lực còn gây ra biến dạng cấu trúc của phân tử enzym. Ngồi ra,
trong thời điểm dập, động năng chuyển hóa nhanh chóng thành nhiệt năng cũng gây
phá vỡ cấu trúc của phân tử enzym [29]. Lực dập và tốc độ dập càng lớn, hoạt tính
của enzym mất trong q trình dập viên càng nhiều [28][29].
c) Ánh sáng
Trong cấu trúc của phân tử alpha-chymotrypsin có rất nhiều acid amin nhạy cảm
với ánh sáng như: Trytophan, Tyrosin, Phenylamin, Cystein nên enzym này dễ bị bất

7

hoạt bởi ánh sáng [3]. Do đó người ta thường bảo quản alpha-chymotrypsin và các
chế phẩm của nó trong điều kiện tránh ánh sáng [37].
1.2.2.2. Tác nhân hóa học
a) Dung mơi
 Nước
- Nước đóng vai trị rất quan trọng trong việc ổn định và duy trì cấu trúc khơng gian
của protein. Khi thiếu nước, cấu trúc của các phân tử protein trở nên chặt chẽ và cứng
nhắc, các liên kết nội phân tử được hình thành, điều này cản trở việc chuyển dạng có
hoạt tính của các enzym. Khi ở trong môi trường nước, các phân tử nước sẽ thâm
nhập vào trong và phá vỡ các liên kết nội phân tử làm cấu trúc protein trở nên linh
hoạt hơn. Thêm vào đó, lớp áo nước liên kết trên bề mặt giúp duy trì cấu trúc của
phân tử protein giống với dạng tự nhiên nhất [18].
- Tuy nhiên, sự có mặt của nước là điều kiện thuận lợi cho phản ứng thủy phân, ACT
trong dung dịch sẽ mất hoạt tính nhanh chóng do phản ứng tự thủy phân các liên kết
peptid. Sự có mặt của nước cũng làm tăng ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định của
enzym [13]. Ngoài ra, nước cũng là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của các vi
sinh vật. Chính vì các lý do này mà người ta thường tìm cách loại nước và hạn chế sự
tiếp xúc với ẩm của alpha-chymotrypsin và các chế phẩm của nó.
 Dung mơi hữu cơ
Sự có mặt của các dung môi hữu cơ sẽ làm giảm hoạt tính và độ ổn định của
enzym. Tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ nước để tạo lớp áo nước duy trì cấu trúc của
phân tử enzym, nhưng nếu thêm dung mơi hữu cơ vào dung dịch thì enzym sẽ mất
hoạt tính nhanh chóng. Điều này có thể giải thích do các phân tử dung môi hữu cơ sẽ
tương tác với các liên kết hydro giữa enzym và nước, làm biến đổi cấu trúc tự nhiên
của enzym, do đó làm giảm hoạt tính và độ ổn định của chúng [18].
b) pH
Enzym rất nhạy cảm với pH môi trường. Mỗi enzym có một khoảng giá trị pH

thích hợp rất hẹp. pH quyết định trạng thái ion hóa của phân tử enzym, đặc biệt là các
nhóm hoạt động của enzym và do vậy ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.


8

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của pH đến trạng thái của alpha-chymotrypsin [18].
Ảnh hưởng

pH
<2

Có khoảng 7% tổng số phân tử protein mất cấu trúc khơng gian.

2

Alpha chymotrypsin khơng hịa tan một phần ở mọi nhiệt độ.

3

Enzym bị bất hoạt thuận nghịch và có độ ổn định cao nhất [7].

3,5 – 5,5

Các phân tử ACT bị dimer hóa.

7,5 – 8,0

Các phân tử ACT tồn tại dưới dạng monomer và thể hiện hoạt tính cao
nhất.

>8,5

Hoạt tính enzym giảm rất nhanh theo sự tăng pH.

Sự bất hoạt do tăng pH thấp hơn so với tăng nhiệt độ. Hoạt tính bị mất do tăng
10oC lớn hơn rất nhiều so với tăng pH lên 1 đơn vị [19].

Hình 1.4. Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin ở 40oC. (A) Sự mất hoạt tính ở pH 6,0
(□), 6,5 (●), 7,0 (▲),7,5 (○) và 8,0 (■). (B) Ảnh hưởng pH đến hoạt tính xúc tác của αchymotrypsin ở 40oC [19].

Ngồi ra, pH trong một số trường hợp cịn xúc tác cho q trình oxy hóa, làm
giảm độ ổn định của enzym [3].
Do đó, việc lựa chọn khoảng pH thích hợp với từng loại enzym là rất quan trọng
để đảm bảo độ ổn định.
c) Ảnh hưởng của các chất oxy hóa
Oxy hóa là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây nên biến tính
protein. Các amino acid thường bị ảnh hưởng nhiều nhất là các acid amin có chứa lưu
huỳnh (Cys và Met) và các acid amin có nhân thơm (His, Tyr và Tryp). Trong phân


9

tử ACT có các amino acid nhạy cảm này nên dễ bị ảnh hưởng bởi các chất oxy hóa.
Sự oxy hóa có thể xảy ra tự phát hoặc do xúc tác là các ion kim loại hoặc pH [3]. Vì
vậy, các chế phẩm của ACT thường được đóng chân khơng (với thuốc tiêm) và được
chứa trong các bao bì khơng thấm khí (với viên nén và bột).
d) Ảnh hưởng của các ion
Ảnh hưởng của ion đối với enzym rất phức tạp. Có một số ion làm ổn định và
tăng hoạt tính của ACT như Ca2+ nhưng nhiều ion lại gây mất hoạt tính enzym.

Để đánh giá ảnh hưởng đến độ ổn định của enzym, các ion được phân loại theo
dãy Hofmeister:
Anion: F- ~ SO42- > HPO42- > acetat > Cl- > NO3- > Br - > ClO3- > I- > ClO4- > SCN-.
Cation: NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > urea > guanidin+.
- Muối được tạo bởi các ion đầu dãy được gọi là “muối ngoại”. Các ion “muối ngoại”
sẽ tương tác với các phân tử nước, làm các liên kết protein-nước trở nên yếu hơn các
liên kết protein-protein, khi đó, các phân tử protein sẽ đông tụ lại với nhau nhưng
không ảnh hưởng tới hoạt tính enzym. Người ta thường lợi dụng tính chất này để tách
enzym ra khỏi tạp tan trong nước.
- Muối được tạo bởi các ion cuối dãy được gọi là “muối nội”. Các ion này làm yếu
đi các liên kết nước-nước, do đó làm các phân tử nước trở nên linh hoạt hơn. Các ion
này còn tương tác với các khung peptid và các nhóm khơng phân cực trong phân tử
protein làm các nhóm này trở nên dễ tan hơn, do đó làm thay đổi cấu trúc ban đầu
của protein. Ngoài ra, các ion này sẽ bám lên bề mặt của enzym và cản trở hoạt động
và làm mất hoạt tính của các phân tử này [5][18].
- Chính vì các lý do trên, việc loại bỏ hoặc thêm các ion thích hợp cần được cân nhắc
và khảo sát kỹ lưỡng để duy trì độ ổn định tối đa cho enzym.
1.2.2.3. Các tác nhân sinh học
a) Các protease
Các protease là các enzym xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid
của alpha-chymotrypsin làm giảm độ ổn định. Do cũng là một protease, điều này cũng


10

xảy ra với chính trường hợp của alpha-chymotrypsin. Vì vậy, enzym thường được
tinh chế để loại bỏ các tạp, đặc biệt là tạp protease và được tách ra khỏi môi trường
thuận lợi cho phản ứng tự thủy phân (loại nước và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
b) Vi sinh vật
Trong quá trình bảo quản, vi sinh vật và nấm mốc là yếu tố ảnh hưởng rất lớn

tới độ ổn định của một dược chất nhạy cảm như alpha-chymotrypsin.
1.2.3. Các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym.
Nghiên cứu cái thiện độ ổn định của protein là một hướng nghiên cứu nhận được
rất nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Mục đích chung của hướng
nghiên cứu này là duy trì cấu trúc tự nhiên của enzym dưới sự tác động của các tác
nhân gây bất hoạt. Đã có rất nhiều hướng tiếp cận khác nhau được sử dụng và mang
lại hiệu quả đáng kể. Một số phương pháp chính để cái thiện độ ổn định của alphachymotrypsin được liệt kê trong bảng 1.4.
Bảng 1.4. Các phương pháp cải thiện độ ổn định của alpha-chymotrypsin.
Phương pháp

Ví dụ
- Tạo liên kết đồng hóa trị với poly(ethylen glycol) [8]
Biến đổi về mặt - Tạo các liên kết glycosylation [13][35].
hóa học
- Gắn thêm các gốc thân nước trên bề mặt phân tử để tăng tính
thân nước [12][23].
- Đưa ACT vào trong hệ polyme silicon [33].
Cố định enzym - Đưa ACT vào vi cầu poly(lactic-co-glycolic) [8].
trong các hệ bảo - Cố định ACT trong gel poly-acrylamid bằng cách tạo các liên
vệ
kết đa điểm [24].
- Cố định ACT trong micell anthraniloyl [11].
Loại nước
- Đơng khơ [3][10][38].
Duy trì lớp áo
- Hấp phụ alpha-chymotrypsin lên Celite (SiO2) [20]
nước bảo vệ
- Thêm các muối: Ca2+, “muối nội” [18][21][28]
Thêm các tá
- Tá dược ổn định về lực: Các tá dược có khả năng biến dạng

dược tăng độ ổn
đàn hồi như carragenan, chitosan,…[27][28][29]
định
- Các tá dược làm tăng độ tan: chất diện hoạt,…[18].


11

 Các hướng tiếp cận để cải thiện độ ổn định của alpha-chymotrypsin trên thế giới
rất đa dạng. Tuy nhiên, để phù hợp với thiết bị và hóa chất hiện có nên chúng tơi định
hướng sử dụng phương pháp đơng khô và thêm tá dược để cải thiện độ ổn định của
viên nén alpha-chymotrypsin.
1.3. Đại cương về đông khô
1.3.1. Khái niệm
Đơng khơ là q trình làm khơ chế phẩm trong các điều kiện đặc biệt, trong đó
chế phẩm được đơng lạnh và được loại dung mơi sau đó bằng cách thăng hoa trực
tiếp (giai đoạn làm khô sơ cấp) và giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn
chặn các phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh vật từ đó tăng độ ổn định của
chế phẩm [10] [16].
1.3.2. Ảnh hưởng của các giai đoạn đơng khơ tới hoạt tính enzym.

Hình 1.5. Các giai đoạn của q trình đơng khơ
1.3.2.1. Giai đoạn đơng lạnh
Trong giai đoạn này, dung môi (thường là nước) sẽ chuyển từ pha lỏng sang pha
rắn, tạo thành các tinh thể băng. Các chất tan được tách ra và phân bố vào khoảng
trống giữa các tinh thể đó [16][26][31].
Thơng số chính ảnh hưởng tới hoạt tính của protein trong giai đoạn này là tốc
độ làm lạnh. Tốc độ làm lạnh nhanh sẽ dẫn tới tăng tốc độ lớn lên của các tinh thể
băng [16]. Điều này dẫn tới tăng diện tích bề mặt phân cách pha nước-băng, dễ gây
biến tính các protein có mặt trong hệ [38]. Ngược lại, nếu tốc độ làm lạnh chậm, thời

12

gian protein tồn tại trong trạng thái dung dịch kéo dài, dễ làm ảnh hưởng tới độ ổn
định của hoạt chất.
Để khắc phục hiện tượng hoạt tính enzym bị mất trong q trình đơng lạnh,
người ta thường bổ sung các tá dược ổn định về mặt nhiệt lạnh (cryoprotectants):
sucrose, propylen glycol, glycerol,….
1.3.2.2. Giai đoạn làm khô sơ cấp
Trong giai đoạn này, dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha
hơi bằng cách hạ áp suất của buồng đông khô xuống thấp hơn áp suất hơi của dung
mơi. Bằng cách đó, phần dung mơi khơng liên kết sẽ được tách ra khỏi sản phẩm. Tốc
độ thăng hoa của nước đá được tính theo cơng thức:
𝑑𝑚
𝑃𝑖𝑐𝑒 − 𝑃𝑐
=
𝑑𝑡
𝑅 𝑝 + 𝑅𝑠
Trong đó:
dm/dt: Tốc độ thăng hoa nước đá (g/cm2/giờ).
Pice: Áp suất hơi bão hòa của nước đá tại nhiệt độ của buồng đông khô (mmHg).
Pc: Áp suất của buồng đông khô (mmHg).
Rp: Hệ số cản trở thăng hoa của sản phẩm.
Rs: Hệ số cản trở thăng hoa của nắp.
Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym trong q trình này: Áp
suất buồng đơng khơ, nhiệt độ làm khô, thời gian làm khô.
- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung mơi càng nhanh
nhưng áp suất q thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào
chế phẩm. Áp suất buồng đông khô càng cao, hiệu suất q trình làm khơ sơ cấp càng

giảm. Nếu lượng dung môi không liên kết chưa được loại hết thì sẽ dẫn tới hiện tượng
phá vỡ cấu trúc khi chuyển sang giai đoạn sấy thứ cấp. Điều này ảnh hưởng tới hàm
ẩm và độ ổn định lâu dài của chế phẩm.
- Nhiệt độ làm khơ càng cao thì Pice càng tăng, hiệu suất quá trình sấy sơ cấp càng
tăng. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg (hệ vơ định


13

hình) hoặc nhiệt độ eutecti Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của hệ.
Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm.
- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới phá
vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp.
1.3.2.3. Giai đoạn làm khô thứ cấp
Trong giai đoạn này, phần dung môi liên kết với dược chất sẽ được loại bỏ bằng
cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện áp suất thấp. Các yếu
tố cần quan tâm đến trong giai đoạn này là: Nhiệt độ làm khô và thời gian làm khô.
Nhiệt độ làm khô phải đảm bảo loại được phần nước liên kết nhưng khơng được ảnh
hưởng tới hoạt tính enzym. Thời gian làm khô cũng phải đủ dài để chế phẩm đạt được
hàm ẩm cần thiết để duy trì độ ổn định lâu dài.
 Ngồi ra, cả 2 q trình làm khô cũng ảnh hưởng tới cấu trúc của protein do
làm mất lớp áo nước bên ngoài phân tử. Để khắc phục hiện tượng này, người ta
thường thêm các tá dược ổn định (lyoprotectants): manitol, trehalose, sucrose,…
1.3.3. Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của
các chế phẩm sinh học.
Phương pháp đông khô đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về
các chế phẩm có nguồn gốc sinh học gần đây. Đơng khơ có thể được sử dụng độc lập
hoặc phối hợp với một số phương pháp khác để cải thiện độ ổn định của chế phẩm.
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp đông khô trong những năm gần đây
được liệt kê trong bảng 1.5.

14

Bảng 1.5. Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của
chế phẩm sinh học trong những năm gần đây.
Đối tượng

Protein phân lập từ tế
bào vi khuẩn
Escherichia coli

Enzym
organophosphorus
hydrolase (OPH)

Kháng nguyên
ovalbumin (OVA)

Phương pháp
- Thực hiện trên 3 mẫu:
sản phẩm phân lập chuẩn,
sản phẩm phân lập thêm
sucrose, sản phẩm phân
lập bổ sung các phân tử
nhỏ cần thiết cho hoạt
động
của
phosphoenolpyruvat.
- Đơng lạnh ở -40oC trong

bể ethanol, duy trì trong ít
nhất 5 phút.
- Làm khơ ở -60oC, áp
suất <120 mTorr. Cứ 20
phút dời mẫu vào môi
trường -40oC trong 1 phút
cho tới khí hàm ẩm < 5%.

Kết quả
Mẫu đơng khơ có các
đặc tính vượt trội:
- Thể tích bảo quản
giảm 2-3 lần.
- Có khả năng duy trì
được đặc tính sinh học
cao hơn trong điều kiện
nhiệt độ 4oC và nhiệt độ
phòng.
- Hạn chế hiện tượng
nhiễm vi sinh vật.
Việc sử dụng sucrose
không cho sự khác biệt.

- OPH kết hợp với F127
vẫn duy trì được hoạt
tính sau 3 tháng.
- OPH đơng khơ cải
- Tạo micell kết hợp OPH thiện độ ổn định của
– Pluronic F127.
enzym tuy nhiên ở mức

- Micell tạo thành được dưới 45% hoạt tính ban
đơng khơ và bảo quản ở - đầu sau 3 tháng.
20oC.
- Mục đích đơng khơ
OPH-F127 để giảm thể
tích vận chuyển và tăng
độ ổn định dài hạn của
chế phẩm.
- Ovalbumin được hấp
- Mẫu sử dụng 20%
phụ vào trong
trehalose có cấu trúc
mesoporous silica
giống như tuyết ở phần
nanoparticle có nhóm
trên của bánh đông khô;
chức amino (AM-41) tạo mẫu sử dụng 1% PEG
thành phức hợp OVA-41. 8000 bị co thể tích 50%;

Năm

2014
[34]

2014
[36]

2014
[22]

15

-Phức hợp được đông khô
không sử dụng tá dược,
sử dụng 20% trehalose
hoặc 1% PEG 8000 hoặc
5% trehalose+ 1% PEG
8000.
-Đông lạnh mẫu trong
nitơ lỏng và làm khô ở
nhiệt độ 24oC, áp suất 0,1
mBar trong 17h.

Tiểu phân nano protein
huỳnh quang xanh lục
(gFPNP) sử dụng trong
thử cộng hưởng từ
MRI, thăm dò 3
chiều,….

- 3 loại gFPNP đơng khơ
trong điều kiện có/khơng
sử dụng chất ổn định: 1%
(kl/kl) PEG và 5% (kl/kl)
sucrose hoặc 1% Tween
80 và 5% (kl/kl) sucrose.
- Mẫu được đông lạnh từ
từ xuống nhiệt độ -80oC
trong 3 giờ, làm khô sơ

cấp ở -10oC trong 1 giờ,
làm khô thứ cấp ở 20oC
trong 5 giờ.

Alpha - chymotrypsin

- Tạo liên kết
glycosylation với dextran
và lactose hoạt hóa (SSmDEX và SS-mLAC).
- Đông khô sản phẩm thu
được.

mẫu sử dụng 5%
trehalose và 1% PEG
8000 có thể chất tốt và
khơng có hiện tượng vỡ
cấu trúc.
- OVA bị biến tính khi
đơng khơ khơng sử dụng
tá dược và duy trì được
hoạt tính khi sử dụng các
tá dược
- Mẫu đơng khơ duy trì
được 80% hoạt tính sinh
học sau 4 tuần ở nhiệt độ
25oC và 37oC trong khi
mẫu khơng đơng khơ chỉ
duy trì được ở mức 40%.
- Các mẫu sử dụng tá
dược duy trì được hình

dạng cầu của nano trong
4 tuần và chỉ có mẫu sử
dụng sucrose và Tween
80 duy trì được hình
dạng sau 10 tuần.
-Sản phẩm thu được sau
đông khô cải thiện được
độ ổn định của enzym
với tác động của ẩm.

2011
[17]

2010
[13]

 Từ các nghiên cứu trên ta thấy phương pháp đơng khơ có hiệu quả rất tốt trong
việc ổn định cấu trúc và hoạt tính của protein khi dùng độc lập cũng như phối hợp
với các phương pháp khác. Chính vì lý do trên, chúng tôi sử dụng phương pháp đông
khô kết hợp với một số biện pháp khác để cải thiện độ ổn định của chế phẩm viên nén
alpha-chymotrypsin.


16

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu

Bảng 2.1. Nguyên vật liệu

STT
1
2
3
4
5
6
10
11
12
13
14
15
16
17
19
20
21

Nguyên vật liệu
Alpha - chymotrypsin
Manitol
Lactose
Tá dược A
Sorbitol
Tá dược B
Isomalt
Tá dược C
Magnesi stearat
Aerosil

Carrageenan
Acid hydrocloric
Tween 80
Pluronic F127
Lọ thủy tinh, nút cao su, nút nhôm
N-acetyl-L-tyrosin ethyl este
Nước siêu lọc

Nguồn gốc
Trung Quốc
Pháp
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Đức
Pháp
Trung Quốc
Trung Quốc
Phillipin
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Mỹ
Việt Nam

Tiêu chuẩn
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất

Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Tinh khiết hóa học
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
Nhà sản xuất
USP 34
DĐVN IV

2.1.2. Thiết bị
- Máy đông khô Freezone Triad 740030.
- Máy quang phổ SHIMADZU UV 2600, HITACHI U180.
- Máy dập viên thủy lực PYE UNICAM, máy dập viên tâm sai KORSCH EKO.
- Máy đo pH: EUTECH PH 510.
- Tủ vi khí hậu CLIMACEL.
- Máy hút ẩm Edison ED-12B.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật SARTORIUS..
- Máy xác định hàm ẩm nhanh SARTORIUS.
- Máy đo lực gây vỡ viên ERWEKA.