Nghiên cứu cố định tế bào bacillus subtillis natto bằng alginat

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



LƯU THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LƯU THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
Th.S. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ Môn Công Nghiệp Dược







HÀ NỘI – 2014




LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
chân thành nhất tới cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng – Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược – trường đại học Dược Hà Nội và DS. Lê Ngọc Khánh, những người
đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên
cứu khoa học.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, các anh
chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược - Trường đại học Dược Hà Nội đã
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận
này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy

cô giáo trong trường và tất cả các bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lưu Thị Hương










MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2
1.1. Cố định tế bào. 2
1.1.1. Khái niệm. 2
1.1.2. Phân loại. 2
1.1.3. Ưu nhược điểm của tế bào cố định. 4
1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào. 5
1.2. Tổng quan về alginat. 6
1.2.1. Cấu trúc hóa học. 6
1.2.2. Cơ chế tạo gel . 7
1.2.3. Tính chất của alginat. 8

1.2.4. Ứng dụng. 9
1.3. Bacillus subtillis natto. 10
1.3.1 Đặc điểm . 10
1.3.2. Nguồn gốc. 11
1.3.3. Phân loại khoa học 11
1.3.4. Cấp khí và nhiệt độ 11
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 13
2.1.1. Nguyên liệu – Hóa chất. 13
2.1.2. Máy móc – thiết bị - dụng cụ nghiên cứu 14
2.1.3. Môi trường nuôi cấy. 14
2.2. Nội dung nghiên cứu. 15
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate tới cố định tế bào B. subtilis
natto. 15
2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. 15
2.2.1.2. Đánh giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương
pháp đếm. 15




2.2.1.3. Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37
o
C,
100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. 15
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis natto.
15
2.3. Phương pháp nghiên cứu. 15
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 15
2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat. 16

2.3.3. Phương pháp phá hạt. 18
2.3.4. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính của các Enzym : Protease, cellulase,
amylase. 18
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục. 19
2.3.6. Phương pháp cấy trộn trong thạch. 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào B. subtilis
natto. 21
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. 21
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào bằng
phương pháp đếm 24
3.1.3. Định tính Enzym có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37
o
C, 100
vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. 30
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí tới quá trình cố định tế bào B.
subtilis natto. 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis natto : Bacilus subtilis natto
VSV : Vi sinh vật
RSD : Độ lệch chuẩn
CMC : Carboxymethyl cellulose
Na CMC : Natri Carboxymethyl cellulose

DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên các bảng
Trang
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất
13
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng
14
Bảng 3.1: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt
calci alginat 2%
21
Bảng 3. 2: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt
calci alginat 4%.
22
Bảng 3.3: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt

gel calci alginat ở các nồng độ khác nhau.
23
Bảng 3.4: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt sau khi
nuôi cấy (ở 37, 100 vòng/ phút, 24h)
24
Bảng 3.5: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1gam hạt Alginat 4%
sau khi nuôi cấy (ở 37, 100 vòng/ phút, 24 giờ)
25
Bảng 3.6: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các
nồng độ alginat khác nhau sau khi nuôi cấy (ở 37
o
C, 100 vòng/phút,
24 giờ)
26
Bảng 3.7: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch ( dịch sau khi
nuôi cấy ở 37, 100 vòng/ phút, 24h)
27
Bảng 3.8: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch hạt alginat 4% (
dịch sau khi nuôi cấy ở 37, 100 vòng/ phút, 24h ).
28
Bảng 3.9: Số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy sau khi nuôi cấy ở
37
o
C, 100 vòng/phút, trong 24 giờ.
28
Bảng 3.10: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci
alginat 2%
31

Bảng 3.11: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci
alginat 4%
32
Bảng 3.12: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt lắc ở
100 vòng/ phút trong 24 giờ
34
Bảng 3.13: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong 1 gam hạt lắc ở
150 vòng/phút trong 24 giờ.
34
Bảng 3.14: Số lượng tế bào B. subtilis natto được giữ trong hạt
alginat 2% lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút.
35
Bảng 3.15: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100
vòng/phút trong 24 giờ.
36
Bảng 3.16: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc 150
vòng/phút trong 24 giờ.
36
Bảng 3.17: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100
vòng/phút và 150 vòng/phút.
37

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình
Trang
Hình 1.1: Cấu hình của  – D – mannuronic acid và -L-
Guluronic acid.
6
Hình 1.2: Cấu trúc của phân tử alginat
7
Hình 1.3: Sự kết hợp ion Ca
2+
với alginat
8
Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của B. subtilis
natto
11
Hình 2.1: Phương pháp tạo hạt gel Calci alginat
17
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto
phụ thuộc vào nồng độ alginat
23
Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto
trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ khác nhau
26
Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto

trong dịch nuôi cấy (37
o
C, 100 vòng/phút, trong 24 giờ) ở
các nồng độ alginat khác nhau
29
Hình 3.4: Sô lượng tế bào VSV B. subtilis natto trong dịch
nuôi cấy hạt Alginat 2% ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút.
39


.
.
1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong gel alginat đã trở thành
một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi. Cố định tế bào tuy là công nghệ mới và tiên
tiến nhưng nó đã được sự quan tâm của các nhà khoa học và sản xuất bởi hiệu quả
và tính kinh tế vượt trội của nó so với phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự
do và cả kỹ thuật bất động enzym đã được nghiên cứu trước đó. Kỹ thuật cố định tế
bào tiến hành đơn giản hơn, cho năng suất cao hơn và đặc biệt là có thể sản xuất
liên tục trong các quy trình được tự động hóa.
Vi khuẩn B. subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis là một trong
các vi khuẩn có khả năng sinh protease và được ứng dụng nhiều [24]. Năm 1980,
Giáo sư Sumi người Nhật phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym
thuộc nhóm protease có khả năng phân giải fibrin [16]. Từ đó tới nay nhiều nghiên
cứu về B. subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này
có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [21], elastase [29],

bacillopeptidase [27] Các chế phẩm của enzym này được sản xuất và sử dụng
ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người.
Alginat là chất mang hay được sử dụng nhất trong quá trình cố định tế bào.
Nhưng vấn đề đặt ra là ở nồng độ bao nhiêu và điều kiện cấp khí bao nhiêu thì khả
năng cố định tế bào của alginat là tốt nhất. Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu cố định
tế bào Bacillus subtilis natto bằng alginat” được thực hiện với 2 mục tiêu :
1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên quá trình cố định tế bào B. subtilis
natto.
2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên quá trình cố định tế bào B.
subtilis natto.

2



CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Cố định tế bào.
1.1.1. Khái niệm.
Cố định tế bào là sự bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên
“một vùng không gian nhất định“ nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong
muốn.[17]
1.1.2. Phân loại.
Phương pháp này được chia thành 4 loại [18]:
 Cố định trên bề mặt chất mang rắn.
 Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel).
 Keo tụ tế bào (tạo hạt).
 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn.
1.1.2.1. Phương pháp cố định trên bề mặt chất mang rắn.
Nguyên tắc: Cố định dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào và chất mang. Các
lực liên kết là lực hấp phụ vật lý, liên kết tĩnh điện hay liên kết cộng hóa trị. Những

lực liên kết này yếu nhưng đủ lớn về số lượng để có thể liên kết hợp lý [10], [18],
[28].
Chất mang: là các vật liệu cellulose : gỗ, mùn cưa, DEAE – cellulose hoặc
các vật liệu vô cơ như : hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp [18], [20].
Ưu điểm:
- Ít hoặc không nguy hiểm tới tế bào [10].
- Đơn giản dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố định [10], [28], [20].
- Không ảnh hưởng tới quá trình truyền khối [28], [20].
- Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố định và chất mang lớn hơn so với các kỹ
thuật khác [20].
- Có thể phục hồi trở lại tế bào tự do [10].
Nhược điểm:
3



- Hàm lượng của tế bào tự do trong dung dịch cao (tế bào tự do dễ bị tách ra
do không có màng chắn giữa dung dịch và các tế bào) [18], [10].
- Nếu điều chỉnh không cẩn thận, sự quá tải trên bề mặt chất mang có thể làm
giảm hoạt tính xúc tác [10].
- Sự thiếu không gian phù hợp giữa tế bào và chất mang có thể làm cản trở
không gian [10].
1.1.2.2. Phương pháp nhốt trong khung mạng xốp.
Nguyên tắc: Đưa tế bào vào bên trong một mạng đủ chặt để ngăn cản tế bào
khuếch tán vào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển của
chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [18], [10].
Chất mang : Là các polyme tự nhiên như alginat, agar, chitosan [18] hoặc
là polymer khác như genlatin, collagen và polyvinyl alcohol hoặc polymer tổng hợp
như polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [20].
Ưu điểm:

- Đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích chất mang cao hơn so với
canh trường vi sinh vật tự do [20].
- Chất mang có tác dụng bảo vệ chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lai
cũng như môi trường gây bất lợi [20].
Nhược điểm:
- Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối thì độ bền của mạng gel sẽ giảm [18].
- Tế bào trên bề mặt gel phát triển, tăng lên và thoát khỏi bề mặt gel, phát triển
trong môi trường như tế bào tự do [18].
1.1.2.3. Phương pháp keo tụ tế bào (tạo hạt).
Sự tập hợp các tế bào gia tăng kích thước của khối tế bào hoặc huyền phù tế
bào gắn thành cụm và lắng xuống để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng. Có
thể là keo tụ tự nhiên hoặc keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kết ngang
[18].
4



Ưu điểm:
- Đơn giản, dễ thực hiện.
- Không ảnh hưởng tới quá trình chuyển khối.
Nhược điểm:
Do không có màng chắn giữa tế bào và dung dịch nên tế bào dễ tách ra làm
tăng hàm lượng của các tế bào tự do trong dung dịch.
1.1.2.4. Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn.
Nguyên tắc : Phương pháp này thực hiện bằng hai cách sử dụng membrane
vi xốp hoặc sử dụng màng vi bao [18], [19].
Ưu điểm:
Canh trường lên men không bị nhiễm tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có
thể không cần lọc.
Nhược điểm:

- Khả năng truyền khối kém.
- Màng Membrane có thể bị bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất trên bề mặt màng.
1.1.3. Ưu nhược điểm của tế bào cố định.
1.1.3.1. Ưu điểm của tế bào cố định hơn tế bào tự do [18].
- Hoạt động tế bào và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mang có thể
đóng vai trò như chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi
và thậm chí là kim loại nặng.
- Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng cao hơn, thời
gian phản ứng ngắn hơn.
- Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiên.
- Có thể thục hiên được quá trình liên tục.
- Khả năng chịu đựng của nồng độ cơ chất cao tăng và giảm sự ức chế của sản
phẩm cuối.
5



- Với quá trình lên men có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn tới cái thiện chất
lượng sản phẩm.
- Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết và lọc, do
đó giảm giá thành cho thiết bị và năng lượng sử dung.
- Có thể tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học.
- Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao.
- Có thể sử dụng thiết bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế công nghệ
đơn giản do đó giảm chi phí vốn.
- Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm.
1.1.3.2. Nhược điểm của cố định tế bào.
- Có hiện tượng rò rỉ và rửa trôi tế bào nên việc thu nhận và tinh sạch sản
phẩm khá phức tạp.
- Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng để

sinh trưởng phát triển và hoạt động bình thường. Do đó có hiện tượng phân hủy sản
phẩm để cung cấp dinh dưỡng. Vì vậy hiệu suất có thể thấp hơn.
- Việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào
bị cản trở.
- Hoạt lực của tế bào cố định thấp hơn tế bào tự do.
1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào.
Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginat, công nghệ sinh học đã công
nghiệp hóa được một số công nghệ cao như sản xuất liên tục các loại rượu bằng
việc cố định các tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, các chất kháng sinh và các
hoocmon bằng việc cố định tế bào các vi khuẩn đồng thời nuôi cấy được mô tế bào
của động thực vật, các kháng nguyên dòng vô tính đơn
Các ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào phát triển mạnh mẽ và được công nghiệp
hóa ở nhiều nước phát triển với các thành tựu rực rỡ. Tuy nhiên, ở nước ta ứng dụng
của cố định tế bào còn chưa phát triển và phổ biến.
6



1.2. Tổng quan về alginat.
Alginat có khá nhiều trong tự nhiên, và chủ yếu là từ tảo nâu biển. Ngoài ra
còn có nguồn gốc từ các loại vi khuẩn đất. Tuy nhiên tất cả các alginat thương mại
hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo.
Alginat tồn tại dưới hai dạng không tan là acid alginic và alginat calci hoặc
magie rất bên vững ở trong tế bào cây rong.[1].
1.2.1. Cấu trúc hóa học.
Alginat có tên gọi chung họ các muối của acid alginic. Alginat là một
polymer không phân nhánh bao gồm các monomer -D-mannuronic acid (M) và -
L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4–glucoside.
Có ba loại liên kết có thể gặp trong một phân tử alginat: (M-M-M), (G-G-G),
(M-M-G).

Công thức cấu tạo của acid alginic là: (C
6
H
6
O
6
)
n


Hình 1.1: Cấu hình của  – D – mannuronic acid và -L-Guluronic acid

Các liên kết này phân bố trong mạch alginat theo các block :
Block homopolyguluronic : gồm các gốc guluronic liên kết với nhau
Block homopolymannuronic : gồm các gốc mannuronic liên kết với nhau.
Block liên hợp : Gồm các gốc mannuronic và guluronic luân phiên nối với nhau.
7




Hình 1.2: Cấu trúc của phân tử alginat
a) Các momomer của alginat. b) Chuỗi alginat. c) Sự phân bố các block.
1.2.2. Cơ chế tạo gel .
Alginat có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao
hoặc khi phân tử alginat bị acid hóa.
Ở phương pháp tạo gel khi kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến
hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và từ bên trong.
Chúng tôi nghiên cứu và sử dụng phương pháp tạo gel từ bên ngoài. Đây là
phương pháp tạo gel phổ biến nhất vì nó có ưu điểm là tạo gel nhanh và đơn giản.

Tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao.
Cơ chế tạo gel:
Khi nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có chứa cation kim loại có hóa trị
cao (thường là 

), bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ bị gel hóa, và các cation bên
ngoài môi trường sẽ tiếp tục khuếch tán vào bên trong làm phân tử alginat bên trong
tiếp tục bị gel hóa. Quá trình này xảy ra trên bề mặt và phát triển vào bên trong.
8




Hình 1.3: Sự kết hợp ion Ca
2+
với alginat
1.2.3. Tính chất của alginat.
 Độ tan
Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hút nước để trương nở thành
bột nhão. Muối alginat của kim loại hóa trị I ( 

, 

) tan trong nước tạo thành
dung dịch có độ nhớt cao, còn muối kim loại hóa trị II hoặc III thì không tan trong
nước trừ muối của 

[1], [5].
 Độ nhớt :
Natri alginat có độ nhớt dao động trong khoảng 10 – 3500 cps. Độ nhớt phụ thuộc

vào các yếu tố :
Khối lượng phân tử : Khối lượng phân tử tăng thì độ nhớt tăng.
Nhiệt độ : Khi nhiệt độ tăng độ nhớt giảm 2,5% cho 1, khi duy trì nhiệt độ
90trong nhiều giờ sẽ làm alginat bị cắt mạch và giảm độ nhớt, trái lại khi hạ nhiệt
độ tới điểm đông đặc sau đó rã băng thì độ nhớt của alginat không thay đổi.
9



pH : Liên kết glycozid rất nhạy cảm với pH do đó dưới các điều kiện thuận
lợi cho việc thủy phân, alginat sẽ bị cắt mạch rất nhanh chóng. Độ nhớt của alginat
không bị ảnh hưởng trong khoảng pH 5. [1], [5]
 Độ ổn định :
Độ ổn định của các muối alginat xếp theo thứ tự : Na – alginat > Amoni –
alginat > Acid – alginic; càng xếp cuối các muối càng kém ổn định. Alginat có độ
nhớt cao nhanh rã hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp. Ở nhiệt độ thường
bột Na – alginat chỉ bảo quản được trong vài tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ xuống
thấp và bảo quản trong bóng tối thì sẽ bảo quản được lâu hơn.
Alginat khô không bền với oxy, nhiệt độ và các ion kim loại. Khi có mặt các
tác nhân này alginat sẽ bị rã ra. [5]
 Khả năng tạo gel của alginat:
Khi phản ứng với các ion hóa trị II, III thì dung dịch alginat sẽ tạo gel. Các
gel này sẽ tạo thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào dưới 100 và chúng
không bị tan chảy khi đun nóng. Do cấu hình đặc biệt của đoạn mạch GGG tạo
thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng. Khoảng không gian của các vỉ xếp lên
như chỗ đặt quả trứng. Các ion 

khớp vào các khoảng trống này liên kết với
nhóm chức carboxyl và các nguyên tử oxy khi đó gel Ca – alginat được tạo thành.
 Độ bền của gel phụ thuộc vào :

- Chiều dài của các chuỗi tham gia liên kết (khối lượng phân tử) khi khối
lượng phân tử quá lớn mô đun đàn hồi không phụ thuộc vào khối lượng phân tử
nữa.
- Tỷ lệ G/M và trình tự sắp xếp các gốc uronat: block G càng nhiều gel càng
bền hơn.
- Ái lực liên kết giữa polyme càng lớn gel càng bền. [5]
1.2.4. Ứng dụng.
Sản lượng acid alginic trên toàn thế giới vào khoảng 32.000 – 39.000
tấn/năm. Những nước sản xuất alginat nhiều nhất là Scotlen, Nhật, Mỹ, Tây Ban
10



Nha, Trung Quốc. Ở Việt Nam, có nguồn rong mơ phong phú thích hợp cho việc
sản xuất alginat, và thực tế đã sản xuất được alginat thương phẩm đạt chất lượng ở
Nha Trang, Khánh Hòa.
Alginat được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp :
 Ngành công nghiệp dệt : Sử dụng alginat chiếm gần 50% tổng sản lượng,
alginat được sử dụng chủ yếu để hồ sợi vải và in hoa trên vải.
 Ngành công nghiệp thực phẩm : Alginat để làm keo, làm kẹo dẻo.
 Ngành công nghiệp khác: chế tạo keo dán giấy và chất kết dính trong công
nghiệp diêm (keo alginat dùng vào việc dính kết hóa chất ở đầu que diêm và ở
thành bao diêm).
 Ngành công nghiệp dược phẩm: làm tá dược rã viên nén, tá dược kiểm soát
giải phóng dược chất, dùng để đóng nang, bao phim. Còn được dùng để làm trơn,
ngăn trào ngược dịch dạ dày và là yếu tố ổn định nhũ tương, huyền phù. Ngày nay,
khi kỹ thuật bất động tế bào ngày càng phát triển và được đưa vào sử dụng rộng rãi
trong thực tế thì vao trò của alginat cũng ngày càng được nâng cao. Trong kỹ thuật
này alginat được sử dụng để cố định tế bảo như một gel có nhiều ưu điểm. [1]
1.3. Bacillus subtillis natto.

1.3.1 Đặc điểm .
B. subtilis natto là trực khuẩn Gr (+), hiếu khí, nội bào tử hình que có kích
thước dưới 1. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi.
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt
hơi nhăn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch
[17].
11




Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của B. subtilis natto.
1.3.2. Nguồn gốc.
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập và định danh ban đầu năm
1905. Có nhiều trong cỏ khô, đậu nành. Phát triển trong các cây họ đậu, thực phẩm
có nguồn gốc động thực vật khác như tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [17], [32].
Khi mới phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi là một vi sinh vật mới.
Nhưng dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B.natto và B. subtilis của
Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [26], [32] mà đã sắp xếp B. subtilis natto là
một dòng thuộc loại B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng
lên men tạo sản phẩm natto.
1.3.3. Phân loại khoa học
Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillaceae; Họ:
Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis; Dưới loài: Bacillus subtillis natto
[17], [23].
1.3.4. Cấp khí và nhiệt độ
B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình nuôi cấy cần cung
cấp oxy, và vi khuẩn này có thể phát triển ở nồng độ oxy > 3%.
12

Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển vi khuẩn là giữa 39  tới 43 , trong đó
tối ưu là 37 . Ở 55
o
C, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng
diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40
o
C [11], [22].






13



CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị.
2.1.1. Nguyên liệu – Hóa chất.
Vi sinh vật sử dụng: Bacillus subtilis natto
Xuất xứ: Nhật Bản.

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất
Hóa chất
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ

Cao thịt
Ấn Độ
Cao nấm men
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
Alginat
Trung Quốc
CaCl
2
Trung Quốc
Thạch bột
Việt Nam
NaCMC
Trung Quốc
Casein
Trung Quốc
Dung dịch xanh methylen
Việt Nam
KI, Iod
Trung Quốc




14



2.1.2. Máy móc – thiết bị - dụng cụ nghiên cứu.

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng
Thiết bị
Nguồn gốc
Tủ lạnh
Daewoo – Hàn Quốc
Máy khuấy từ
Heidolph - Đức
Nồi hấp
ALP – Nhật
Cân phân tích
Sartorius – Đức
Cân kỹ thuật
Sartorius – Đức
Lò vi sóng
Daewoo – Hàn Quốc
Tủ ấm
Memmert – Đức
Tủ cấy
Sanyo – Nhật
Tủ lắc Bioshaker
Taitec - Nhật
Các loại ống nghiệm, que cấy, ống ly tâm, khi sử dụng đều được hấp ở điều
kiện 1atm/20 phút.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy.
Công thức môi trường thạch thường:
Thành phần Khối lượng
Pepton 1 gam
Cao thịt 0,5 gam
NaCl 0,5 gam

Thạch bột 2,3 gam
Nước máy vừa đủ 100 ml.
Môi trường nuôi cấy được chọn là môi trường canh thang do môi trường này hay
được sử dụng để nhân giống B. subtilis natto và B. subtilis [11], [15].
15



Công thức môi trường canh thang:
Thành phần: Khối lượng
Pepton 1gam
Cao thịt 0,5 gam
NaCl 0,5 gam
Nước máy (vừa đủ) 100ml.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu để giải quyết 2 mục tiêu sau :
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate tới cố định tế bào B. subtilis
natto.
2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định.
2.2.1.2. Đánh giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương
pháp đếm.
2.2.1.3. Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37
o
C,
100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis
natto.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto.
a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng.

Pha môi trường thạch thường, đun cho đồng nhất. Chia đều vào các ống
nghiệm (4-5 ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn các ống ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau
khi tiệt khuẩn xong đặt nghiêng ống nghiệm để cho thạch nguội và đông lại. Tiến
hành cấy truyền từ ống giống sang ống môi trường thạch thường mới theo hình zic
16



zắc. Đặt các ống vừa cấy vào tủ ấm, ở /24 giờ. Bảo quản giống trong tủ lạnh ở
4-5. Việc cấy truyền giống được thực hiện 1-2 tháng/lần [2], [4].
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón.
Pha 100ml môi trường canh thang cho vào bình nón 250ml, nút kín. Hấp tiệt
khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, lấy bình nón ra và
để nguội tới khoảng 40. Cấy giống từ môi trường giữ giống vào bình nón, Nuôi
trên máy lắc ở 37/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/ phút. Thu được dung dịch sinh
khối tế bào [2], [4].
Thu sinh khối ướt: Ly tâm dịch sinh khối tế bào của B. subtilis natto với tốc độ
4000vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ phần dịch trong ở trên thu
được sinh khối ướt.
2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat.
Pha các dung dịch sau :
300ml dung dịch 

2% vào bình nón 500ml
400ml dung dịch NaCl 0,9% vào bình nón 500ml
50ml dung dịch Natri alginat 2%, 4% vào bình nón 250ml
Đem hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút, sau đó lấy ra để nguội. Với các
bình alginat có nồng độ 2%, 4%, ta thêm sinh khối ướt đã chuẩn bị ở 2.3.1.b vào,
lắc đều, đem khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30
phút để tạo hỗn dịch đồng nhất, sau đó để yên 5 phút để loại bọt khí.

Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch này vào cốc đựng 50 ml dung dịch 


2% đã tiệt trùng, hạt sẽ tạo thành, để yên 30 phút cho hạt ổn định rồi rửa hạt 3 lần
bằng dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng.
Ngay sau khi thu được hạt, cho 10gam hạt vào mỗi bình 100ml NaCl 0,9%
đã được tiệt trùng và tiến hành nuôi cấy ở máy lắc với tốc độ khác nhau (100