Nghiên cứu định lượng tetrodotoxin trong phủ tạng cá nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




HOÀNG THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG
CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI
PHỔ (LC-MS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ


HÀ NỘI-2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THANH HÀ


NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG
CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI
PHỔ (LC-MS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Phùng Minh Dũng
2. CN. Vũ Tùng Lâm
Nơi thc hin:
1. Bộ môn Hóa Phân Tích
2. Vin kiểm nghim thuốc Trung Ương

3. Công ty CP Dược Phẩm Mediplantex




HÀ NỘI-2014


HÀ NỘI-2014


LỜI CẢM ƠN
Vi lng knh trng v bit ơn sâu sc tôi xin đưc by t lời cm ơn chân
thnh ti:
ThS. Phùng Minh Dũng, CN.Vũ Tùng Lâm v các thầy cô giáo trong bộ môn
Hóa Phân Tch, những người đã nhiệt tình ging dạy tôi về c lý thuyt v thực hnh,
trực tip cung cấp, góp ý cho tôi những thông tin, kin thức rất hữu ch đ tôi có th
hon thnh đưc khóa luận ny.
TS. Trần Việt Hùng, Phó viện trưởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã
tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong sut quá trình nghiên cứu v th nghiệm thực t trên
cá Nóc.
TS. Bùi Hồng Cường, Ging viên Bộ môn Dưc Cổ Truyền, một người thầy đáng
knh trong công việc cng như trong cuộc sng. Thầy đã định hưng v cho tôi những
lời khuyên bổ ch đ tôi hon thnh khóa luận ny.
Dược sĩ Dương Minh Tân đã trực tip hưng dẫn, ch bo v tạo mi điều kiện
thuận li cho tôi trong quá trình lm việc, nghiên cứu v thu thập s liệu thực t trên
cá Nóc đ tôi có th hon thnh đưc khóa luận.
Xin chân thnh cm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phng đo tạo Trường
Đại hc Dưc H Nội đã tạo mi điều kiện thuận li cho tôi trong quá trình hc tập v
hon thnh khóa luận.

Xin chân thnh cm ơn gia đình, người thân v bạn bè đã luôn  bên cạnh động
viên v giúp đỡ tôi hc tập, lm việc v hon thnh khóa luận tt nghiệp.
H Nội, ngy 07 tháng 5 năm 2014
SINH VIÊN

Hoàng Thanh Hà



MC LC

TRANG PH BÌA
LỜI CẢM ƠN
MC LC
DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MC CÁC BẢNG
DANH MC CÁC HÌNH
Trang
ĐT VN Đ 1
Chương 1: TNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về cá Nóc và Tetrodotoxin 2
1.1.1 Cá Nóc 2
1.1.2. Tetrodotoxin 3
1.1.3. Phương pháp xử lý mẫu trong các bộ phận khác nhau của cá Nóc để định
lượng Tetrodotoxin: Kỹ thuật chiết và làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) 7
1.1.4. Các phương pháp định lượng Tetrodotoxin 9
1.2. Tổng quan về sắc khí lỏng khối phổ 10
1.2.1. Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ 10
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 12
1.2.3. Một số kỹ thuật LC-MS 17

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19
2.1.1 Nguyên vật liệu 19
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Chuẩn bị mẫu 21


2.3.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX 23
2.3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng TTX
23
2.3.4. Đánh giá phương pháp. 24
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Chuẩn bị mẫu 27
3.1.1. Mẫu chuẩn 27
3.1.2. Mẫu thử 27
3.2. Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với TTX 28
3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng 29
3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 29
3.4. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS 35
3.5. Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối
phổ LC-MS 41
3.6. Bàn luận 41
3.6.1. Về quy trình chiết tách và xử lý mẫu 41
3.6.2. Về phương pháp phân tích LC/MS 41
3.6.3. Về kết quả định lượng một số mẫu cá Nóc 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
KẾT LUẬN 44
KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APCI
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Kỹ thuật ion hóa hóa
học ở áp suất khí quyển)
APPI
Atmospheric Pressure Photoionization (Kỹ thuật ion hóa ánh sáng
ở áp suất khí quyển)
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme)
ESI
Electro Spray ionization (Kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử)
FLD
Fluorescence Detector (Đầu dò huỳnh quang)
GC-MS
Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối
phổ)
HPLC
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
cao)
LC-MS
Liquid Chromatography- Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép
khối phổ)
LOD
Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ
Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)
MLD
Mean Lethal Dose (Liều gây chết trung bình)
SIM
Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion)
SPE
Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)
SRM
Selected Reaction Monitoring (Chọn lọc ion con sau phản ứng)
TIC
Total Ion Chromatogram (Sắc đồ toàn ion)
TTX, UV
Tetrodotoxin, Ultra Violet (Tia cực tím)
AG, SG
Auxiliary Gas (khí bổ trợ), Sheath Gas (khí thổi)
RSD
Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)



DANH MC CÁC BẢNG

Bảng 3.1
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Tr.35
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Tr.35
Bảng 3.3

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Tr 39
Bảng 3.4
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Tr.40
Bảng 3.5
Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp
Tr.40
Bảng 3.6
Kết quả định lượng một số mẫu cá Nóc
Tr.41



DANH MC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Ảnh hai trong số các loài Nóc độc
Tr.3
Hình 1.2
Cấu trúc phân tử Tetrodotoxin
Tr.4
Hình 1.3
Cơ chế epimer hóa nhóm OH C-4 của Tetrodotoxin
Tr.5
Hình 1.4
Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tr.10
Hình 1.5
Thí nghiệm xác định đồng vị Neon của F.W Aston năm 1913

Tr.11
Hình 1.6
Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiu ESI
– kt ni phun sương)
Tr.14
Hình 1.7
Kỹ thuật Electrospray Ionization
Tr.16
Hình 2.1
Nội tạng cá Nóc được mổ lấy ra để đem đi xử lí
Tr.19
Hình 2.2
Sơ đồ quy trình xử lí mẫu, chiết và làm giàu
Tr.22
Hình 3.1
Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX
Tr.29
Hình 3.2
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký A
Tr.30
Hình 3.3
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký B
Tr.31
Hình 3.4
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký C
Tr.32
Hình 3.5
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký D
Tr.33
Hình 3.6

Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký E
Tr.34
Hình 3.7
Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ TTX và diện tích peak
Tr.36
Hình 3.8
Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng
Tr.37
Hình 3.9
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn TTX nồng độ 10µg/mL
Tr.37
Hình 3.10
Sắc ký đồ dung dịch thử
Tr.38
Hình 3.11
Hai loài Lagocephalus lunaris và Arothran hispidus
Tr.43

1

ĐT VN Đ
Mặc dù các phương tiện thông tin đại chúng đã nói rất nhiều về mối nguy hiểm
của cá Nóc tới tính mạng con người nhưng số nạn nhân tử vong do ăn cá Nóc ở nước ta
vẫn không hề giảm, đặc biệt là ở các tỉnh duyên hải miền Trung.
Độc tố trong cá Nóc có thành phần chủ yếu là Tetrodotoxin (TTX), thuộc nhóm
độc tố thần kinh cực kỳ nguy hiểm, khả năng gây tử vong cao [15]. Tuy nhiên không
phải loài cá Nóc nào cũng độc, hàm lượng độc tố khác nhau ở các loài cá Nóc khác
nhau và ở các bộ phận khác nhau của cá. Hàm lượng độc tố trong cơ thể còn thay đổi
theo mùa, vùng địa lý và giai đoạn phát triển của cá thể [6]. Độc tố trong cá Nóc hiện
được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu, đặc biệt là Nhận Bản, Hàn Quốc và Trung

Quốc. Chúng được dùng trong y dược, nghiên cứu khoa học và lĩnh vực khác. Do vậy,
chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình định lượng độc tố
của một số loài cá Nóc biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học (làm thuốc),
trong đó đặc biệt quan tâm đến tetrodotoxin.
Sắc ký lỏng khối phổ hiện đang là phương pháp phổ biến, với nhiều ưu điểm
như độ nhạy cao, chính xác, vì vậy, ứng dụng phương pháp này để định lượng độc tố
TTX với một hàm lượng nhỏ là hết sức phù hợp và cần thiết.
Từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng
Tetrodotoxin trong phủ tạng cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)” với các
mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng Tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ.
- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng Tetrodotoxin trong phủ tạng cá
Nóc.
2

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 TNG QUAN V C NC V TETRODOTOXIN
1.1.1 Cá nóc [3], [7], [8], [9], [17], [28], [29], [30].
Bộ Cá nóc (tên khoa học là Tetraodontiformes) chứa 10 họ còn sinh tồn với
khoảng 360 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [17]. Phần lớn các loài là cá nước mặn
và sinh sống trong hay xung quanh các bãi đá san hô ngầm vùng nhiệt đới, nhưng có
vài loài là các nước ngọt, sinh sống trong sông suối hay cửa sông.
Các hình dạng kỳ dị được thấy trong bộ cá này: có thể gần như là hình vuông hay tam
giác (các loài cá nóc hòm), hình cầu (các loài cá nóc) cho tới dẹp bên (các loài cá đầu)
[3].
Cá nóc phòng thủ bằng cách hy sinh tốc độ: ở loài này lớp vảy đã biến đổi thành các
tấm hay các gai cứng. Các gai này đôi khi có thể thụt vào và có thể khóa tại chỗ (như ở
các loài cá nóc gai), hay với lớp da dai như da thú (các loài cá đầu và cá bò giấy). Một
đặc điểm phòng ngự đáng chú ý khác được thấy ở các loài cá nóc và cá nóc nhím là
khả năng phình to cơ thể, để tăng các kích thước so với hình dáng thông thường. Nhiều

loài của các họ Tetraodontidae (cá nóc bốn răng), Triodontidae (cá nóc ba răng) và
Diodontidae (cá nóc nhím) còn có khả năng tự bảo vệ (thêm) chống các kẻ ăn thịt nhờ
tetraodotoxin (TTX), một chất độc thần kinh cực mạnh hiện chưa có thuốc giải, tập
trung chủ yếu trong các cơ quan nội tạng [9].
Tại Việt Nam, cá Nóc phân bố dọc bờ biển từ Bắc vào Nam, tập trung nhiều ở ven biển
miền Trung. Theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện Nghiên cứu Hải sản, có khoảng 46
loài trong 4 họ (Diodontidae, Ostraciidae, Tetraodontidae, Triodontidae) sống ở biển,
trong đó họ Cá nóc (Tetraodontidae) là chủ yếu, chiếm khoảng 85%.
3

Độc tố chủ yếu, nguy hiểm nhất đối với người trong cá nóc là TTX. Tại Việt Nam,
người ta đã tiến hành phân tích độc tố của 35 loài [7], [8], trong đó:
- 10 loài có độc tính rất mạnh.
- 7 loài có độc tính mạnh.
- 4 loài có độc tính nhẹ.
- 14 loài chưa phát hiện thấy độc tố.

Hình 1.1. Ảnh hai trong s các loi Nóc độc
1.1.2. Tetrodotoxin [5], [10], [13], [20], [22], [24].
Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố thần kinh cực mạnh, được đặt tên theo loài cá
nóc đầu tiên phát hiện thấy có chứa độc tố này [20]. TTX được tổng hợp từ một số loài
vi khuẩn: Vibrio species, Pseudomonas species, Photobacterium phosphoreum. Ngoài
cá Nóc có thể tìm thấy chất độc này ở nội tạng con Sa giông (Newt), kỳ nhông
(Salamander), tuyến nước bọt ở bạch tuộc vòng xanh, ếch Harlequin, cua Chân ngựa,
cua Philippine cho tới nay không có chất giải độc.Tuy nhiên, cá Nóc vẫn là nguyên
liệu chính để tách, chiết và nghiên cứu về TTX [5].
TTX là (4R,4aR,5R,6S,7S,8S,8aR,10S,12S)-2-azaniumyliden-4,6,8,12-tetra
4

hydroxy-6-(hydroxymethyl)-2,3,4,4a,5,6,7,8-octahydro-1H-8a,10-methano-5,7-

(epoxymethanooxy)quinazolin-10-olat, có cấu trúc hóa học, công thức phân tử và phân
tử lượng như sau: ( hình ảnh xác định cấu trúc TTX bằng chạy cộng hưởng từ hạt nhân
tại phụ lục)

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử TTX
Công thức phân tử: C
12
H
17
N
3
O
8

Phân tử lượng: 319,3
TTX tinh khiết là bột tinh thể không màu; TTX sẫm màu ở khoảng 220
o
C không kèm
phân hủy [13] Trong phân tử TTX có một vài nhóm hydroxyl thân nước, khiến nó
không tan trong các dung môi hữu cơ. Khung phân tử của TTX tương tự như cấu trúc
lồng của đá, khiến rất khó hydrat hóa, do vậy nó ít tan trong nước. Do trong phân tử có
nhóm guanidin perhydroquinazolin (guanidin có tính kiềm mạnh), nên TTX tan trong
các dung dịch acid trong nước. TTX cũng có cấu trúc nội este, nên dễ bị các dung dịch
acid mạnh phân hủy, do đó cách duy nhất giữ TTX bền vững trong dung dịch là hòa
tan trong acid hữu cơ yếu [24]. Đặc tính C-4 có thể dễ dàng nhìn thấy từ cấu trúc phân
tử của TTX. C-4 là vị trí ortho của nguyên tử nitơ với nhóm OH ở vị trí xích đạo và
nguyên tử H ở vị trí trục. Bởi vậy, các hoạt tính hóa học và sinh học của nhóm
hydroxyl ở C-4 là rất đáng kể. Nếu H
+
có mặt trong dung dịch, nguyên tử ôxy từ nhóm

5

hydroxyl của C-4 sẽ kết hợp với nó, tạo ra cấu trúc B hóa trị dương từ cấu trúc A. Cấu
trúc B mất phân tử H
2
O tạo thành cấu trúc C với C-4 hóa trị dương [22].
Cấu trúc C có thể tương tác với H
2
O trong dung dịch. H
2
O có thể tấn công vị trí
nơi phân tử H
2
O gốc bị loại bỏ và tạo thành cấu trúc E, hoặc tấn công vị trí đối diện nơi
phân tử H
2
O gốc bị loại bỏ và tạo thành cấu trúc D. Nếu phân tử H
2
O bị loại khỏi cấu
trúc E, cấu trúc A gốc của TTX được tạo thành. Cấu trúc D chuyển thành cấu trúc F
sau khi H
2
O bị loại bỏ. Sự khác nhau giữa cấu trúc F và cấu trúc A là vị trí của H và
OH hoán đổi cho nhau. H trong C-4 của cấu trúc A là trục và OH là xích đạo, trong khi
đó ở cấu trúc F nguyên tử H trong C-4 là xích đạo và OH là trục.

Hình 1.3. Cơ ch epimer hóa nhóm OH C-4 của Tetrodotoxin [22].
Tetrodotoxin cấu trúc A được gọi “tetrodotoxin”, là nồng độ chủ yếu của TTX
thu được từ cá nóc tự nhiên. Tetrodotoxin cấu trúc F thường được gọi “4-epi
tetrodotoxin”. Do nhóm hydroxyl ở C-4 gần với nhóm hydroxyl ở C-9 trong 4-epi

tetrodotoxin, phân tử H
2
O dễ dàng bị loại bởi tương tác với H
+
, tạo ra một analog của
TTX chứa liên kết ether, được gọi là “4-epi anhydrotetrodotoxin”. Các đặc tính hóa
học của ba phân tử “tetrodotoxin” này khác nhau không đáng kể. Nhưng chúng khác
nhau đáng kể về hoạt tính sinh học. Ví dụ, độc tố của TTX là 4500 đơn vị chuột/mg;
6

của 4-epi TTX là 710 đơn vị chuột/mg và của 4-epi anhydrotetrodoxin chỉ là 92 đơn vị
chuột/mg [22].
Sự quan trọng của nhóm hydroxyl C-4 còn thể hiện ở chỗ: độc tính của nó giảm
đáng kể khi nó được thay thể bằng những nhóm khác, như H, CH
3
hay CH
3
CO Do đó,
về lý thuyết, cần giữ nhóm hydroxyl trong C-4 ở vị trí xích đạo trong quá trình chiết
TTX. Bởi vậy, điều quan trọng là lựa chọn đúng các vật liệu và thiết bị chiết, pH và
nhiệt độ của dung dịch, thời gian chiết. Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10
analog, chủ yếu là TTX, (chiếm tới 70% - 80% khối lượng chiết). Ba analog chính
khác là acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydrotetrodotoxin. So với TTX, ba chất
này không khác nhiều về đặc tính hóa học, nhưng khác nhau đáng kể về đặc tính sinh
học (độc tố tính) [22].
TTX tác dụng cả lên hệ thần kinh trung ương lẫn thần kinh ngoại vi, với các biểu hiện
sau :
- Tim mạch: Mạch nhanh, huyết áp hạ, rối loạn nhịp tim. [5], [20].
- Hô hấp: Khó thở, do liệt cơ hô hấp và liệt trung khu hô hấp, da và niêm mạc
xanh tím [10], [20].

- Thần kinh:
+ Thần kinh trung ương: Choáng váng, đau đầu, co giật. Không có rối loạn ý thức.
+ Thần kinh ngoại vi: Liệt đa dây thần kinh, rối loạn cảm giác (dị cảm) ở lưỡi, môi,
mặt, ngón tay, ngón chân, rối loạn lời nói, khó nuốt [20].
+ Thần kinh cơ vân và cơ trơn: Liệt, rung giật các cơ, cử động hỗn độn, yếu cơ và liệt
chi dưới, liệt vận động nhãn cầu, đặc biệt nguy hiểm là liệt cơ liên sườn, cơ ngực và cơ
hoành.
7

+ Mất phản xạ tủy và phản xạ gân xương [20]
1.1.3. Phương pháp xử lý mẫu trong các bộ phận khác nhau của cá Nóc để định
lượng Tetrodotoxin: Kỹ thuật chiết và làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn (SPE)
[11], [16], [22].
Nhờ vào những đặc tính ưu việt của phương pháp, chiết pha rắn (SPE) hiện
đang được sử dụng rất rộng rãi, nhất là trong các trường hợp chiết hoạt chất từ các dịch
có nguồn gốc sinh học, được chúng tôi lựa chọn thực hiện trong khóa luận này
Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chuẩn bị mẫu, trong đó chiết và làm giàu chất cần
phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ chúng vào pha rắn, rồi rửa giải bằng dung
môi thích hợp. Thông thường, thể tích của dung môi dung để rửa giải nhỏ hơn thể tích
của dung dịch mẫu ban đầu rất nhiều, vì thế mẫu được làm giàu.
Cơ bản, cơ chế của SPE giống như cơ chế phân tách của HPLC, với ba cơ chế chính là:
hấp phụ pha thuận, hấp phụ pha đảo và trao đổi ion.
- Cơ chế hấp phụ pha thuận:
Là sự hấp phụ chất cần phân tích từ dung môi không phân cực lên bề mặt phân cực của
pha rắn. Cơ chế của quá trình phân tách dựa trên lực tương tác phân cực. Trong SPE
pha thuận, pha tĩnh thường được sử dụng là: silica, alumina, magnesi silica, nhưng
thông dụng nhất vẫn là silica.
- Cơ chế hấp phụ pha đảo:
Ngược với cơ chế hấp phụ pha thuận, pha tĩnh ở đây là các chất không phân cực (như
C

18
), còn pha động là phân cực. Cơ chế hấp phụ pha đảo là tương tác không phân cực.
Các chất hấp phụ trong pha đảo thường là C
8
, C
18
và một số loại khác.
- Cơ chế trao đổi ion:
Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi phân cực hay
không phân cực với chất hấp thụ trao đổi ion Quá trình này phụ thuộc vào độ chọn lọc
của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí. Nếu là các chất trao đổi ion mạnh thì
8

dùng silica với nhóm sulfonic acid, còn với các chất trao đổi ion yếu thường liên kết
với nhóm –COOH.
Rửa giải các chất cần phân tích trên pha tĩnh có thể tiến hành theo nhiều cách: nếu trao
đổi cation có thể dùng H
+
của các acid mạnh, hoặc dung cation mạnh hơn (ví dụ, rửa
giải Na
+
thì dung dung dịch K
+
), còn rửa giải anion thì dùng OH
-
hoặc các nhóm anion
mạnh hơn.
*Qui trình của SPE [11], [16].
SPE có bốn bước:
- Bước 1: Điều kiện hóa pha rắn. Đơn giản là cho dung môi chạy qua cột để thấm ướt

pha rắn và kích hoạt các nhóm chức năng của chất hấp phụ. Đồng thời loại bỏ không
khí (nếu có) trong cột và các khoảng trống tồn tại giữa các hạt của pha rắn. Thông
thường, đầu tiên người ta cho methanol chay qua cột, tiếp theo là nước hay đệm pha
trong nước. Sử dụng nước hay đệm pha trong nước tiếp theo methanol là để cơ chế hấp
phụ hoạt động tốt đối với mẫu là dung dịch trong nước. Cần tránh, không để pha rắn bị
khô: chỉ cần chất hấp phụ khô trong vài phút ở điệu kiện chân không, cơ chế hấp phụ
sẽ hoạt động kém hiệu quả, tỷ lệ chiết sẽ rất thấp.
Nếu cần, có thể bổ sung một bước làm sạch chất hấp phụ nữa trong quá trình điều kiện
hóa: sau khi làm ẩm với methanol, cho dung môi rửa giải chạy qua cột để loại bỏ các
tạp chất có thể có trong pha rắn. Sao đó, rửa lại với methanol, rồi với đệm pha trong
nước.
- Bước 2: Cho mẫu chạy qua cột. Phụ thuộc vào thể tích của mẫu, từ 1 ml đến 1 lít, mà
áp dụng hút chân không, bơm hút hay các hệ thống thích hợp khác. Trong bước này,
chất cần phân tích được lưu giữ và cô đặc trong pha rắn.
- Bước 3: Rửa loại chất nền của mẫu và lưu giữ chất cần phân tích. Nếu như chất nền
của mẫu là nước, sử dụng đệm pha trong nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ
để rửa. Nếu mẫu được pha trong dung môi hữu cơ, thì dung chính dung môi đó.
9

- Bước 4: Rửa giải chất cần phân tích ra khỏi pha rắn bằng dung môi thích hợp. Dung
môi rửa giải được chọn lựa đặc biệt để phá vỡ sự tương tác giữa chất cần phân tích và
chất hấp phụ trong quá trình rửa giải. Dung môi được chọn chỉ rửa giải ít nhất có thể
các chất khác cũng được hấp phụ trong pha rắn.
1.1.4. Các phương pháp định lượng TTX [20], [21], [27].
 Mouse bioassay: phương pháp sinh hóa trên chuột.
 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kt vi enzyme).
 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (Gas-Chromatography-Mass Spectrometry)
 Phương pháp sắc ký lỏng với các detector UV, FLD, MS [20],[27].
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là phương pháp dùng để tách và định lượng các thành

phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn
tiếp xúc và không đồng tan với nhau. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc
độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các
hạt chất mang hoặc được gắn hóa học với chất mang. Pha động cùng với mẫu phân tích
được bơm qua cột với tốc độ phù hợp tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn tới
sự tách các chất.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là Detector và
được truyền qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc
đưa ra máy in
Quá trình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion
o Pha tĩnh
Có rất nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc kí lỏng, loại phổ biến
nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica). Các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt
của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol. Tính phân cực của pha tĩnh phụ thuộc
vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết.
10

Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc kí pha
thuận. Ngược lại, pha động phân cực, pha tĩnh không phân cực được gọi là sức kí pha
đảo.
o Pha động
Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2, 3, 4 thành phần. Độ phân
cực của dung môi được xác định bằng hệ số P’, P’ càng cao thì dung môi càng phân
cực. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi thành phần
pha động, tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp. Kỹ thuật này được gọi là
rửa giải gradient hay chương trình hóa dung môi.

Hình 1.4. Cấu tạo hệ thng sc ký lng hiệu năng cao
 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass
spectrometry)

1.2. TỔNG QUAN V SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
1.2.1. Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [4], [15], [20], [23], 25], [26].
*Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) là một phương
pháp phân tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Bắt
đầu từ cuối thế kỷ XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy rằng một chùm tia ion
dương có thể tách ra khỏi nhau dưới tác dụng của một điện trường và từ trường. Năm
1913, F.W Aston (nhà bác học đạt giải Nobel năm 1922 cho các nghiên cứu đồng vị)
11

đã nghiên cứu thấy khí neon tự nhiên gồm 2 loại có khối lượng nguyên tử khác nhau
(isotope) là 20 và 22 (g/mol). Hàng loạt các nghiên cứu về phương pháp phổ khối
lượng như cơ chế và kỹ thuật ion hoá, thiết bị phân tích phổ khối và các ứng dụng của
phương pháp phổ khối lượng trong các lĩnh vực hoá học, vật lý, sinh học, …đã được
thực hiện như máy GC/MS ra đời những năm 1950, máy HPLC/MS được phát minh
những năm 1970…





Hình 1.5. Th nghiệm xác định đồng vị Neon của F.W Aston năm 1913
Ngày nay, phương pháp phân tích phổ khối lượng có ứng dụng rộng rãi trong nhiều
ngành với các ứng dụng chính như: Xác định khối lượng, cấu trúc phân tử; Nhận dạng,
định danh và cấu trúc chuỗi peptip, protein; Nghiên cứu đồng vị; Định tính, định lượng
các chất nồng độ vết và vi lượng trong các mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm, nông
thuỷ sản, môi trường
* Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) và detector khối phổ (MS).
Trong kỹ thuật LC-MS , hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được tách qua
cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ.

Trong phân tích dược phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp LC-MS
cho:
- Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi
- Phân tích thuốc trong dịch sinh học
- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc
12

-Trường hợp không sử dụng được các detector khác: Không phát hiện được
bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng định
- Nét nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy, độ đặc hiệu
cao. Giới hạn phát hiện có thể đến 10
-14
gam. Do vậy thường dùng kỹ thuật này để
phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp.
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ [1], [2], [4], [6], [12], [19], [26].
a. Pha động
Pha động trong sắc ký lỏng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách.
Pha động thường là hai dung môi (hữu cơ hoặc dung dịch nước) hoà tan vào nhau để
có khả năng tách với độ phân giải phù hợp.
Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
 Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký.
 Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 đến 4 loại
được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc
ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi).
b. Hệ thống bơm
Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi qua
hệ thống sắc ký. Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
 Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách, dòng không liên tục
sẽ gây nhiễu đường nền.
 Không có xung ở áp suất cao

 Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
c. Cột tách và pha tĩnh
Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất dẻo có
chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm. Kích thước của hạt nhồi trong cột
13

thường là 5-10 m. Các chất nhồi thường được sử dụng là Silica gel, nhôm oxyd,
polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C8, C18
Cột tách sắc ký lỏng yêu cầu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và
có thể chịu được áp suất cao.
d. Hệ tiêm mẫu
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột
mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng chứa mẫu có
dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50  20 L
e. Detector khối phổ [4], [12], [19], [26].


Nguyên tc hoạt động
- Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của
mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit)
hoặc bằng Dalton. 1 amu = 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.
- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân tích
khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10
-5

đến 10
-8
Torr).

- Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp
thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định
lượng các chất.


Nhiệm vụ của detector khi phổ
- Trong phân tích định tính: Khi ghép với thiết bị sắc ký lỏng, chất phân tích
được xác nhận bằng:
+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định t
R
đặc trưng cho chất phân tích
14

+ Phổ khối tương ứng của hoá chất phân tích hoặc phổ khối biểu diễn cường độ
các ion sinh ra từ một ion xác định của chất phân tích.
Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là
chỉ dựa vào thời gian lưu.
- Trong phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho định
lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao.

Các bộ phận của detector khi phổ [1], [4], [12], [19], [26].
- Bộ phận np mẫu: Đưa mẫu vào máy. Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ
nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ. Với LC/MS, đầu ra
của LC là dòng dung môi pha động nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng dung môi vào
khối phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hành của thiết bị.
Mặt khác, khi đó các ion có trong thành phần dòng dung môi dễ dàng va chạm với các
phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển, và bị bơm chân không của
khối phổ kế hút thải ra ngoài. Do vậy, quá trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải có
các giao diện ghép nối phù hợp (đai chuyển, chia dòng, phun sương,…). Một ghép nối

LC/MS cần có các đặc tính: Cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang
MS mà không làm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm
pha loãng mẫu và làm mất chất phân tích









Hình 1.6. Sơ đồ khi cấu tạo thit bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiu
ESI – kt ni phun sương)

15

- Bộ phận ion hoá (ion source):
+ Nhiệm vụ:
 Ion hoá chất cần phân tích
 Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi.
 Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối.
 Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không
sâu.
 Rút ra ngoài các phân tử trung hoà và ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến
phép đo.
+ Kỹ thuật ion hoá: Có nhiều kỹ thuât ion hóa như:
- K thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization)
- K thuật ion hóa hóa hc (Chemical ionization)
- K thuật ion hóa điện trường (Field ionization)

- K thuật bn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment)
- K thuật phn hấp thụ v ion hoá bằng tia laser
- K thuật ion hóa phun sương điện (Electron Spray Ionization)
- K thuật ion hóa hóa hc  áp suất kh quyn (APCI)
- Kĩ thuật ion hóa ánh sáng  áp suất kh quyn (APPI)
Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật phun điện tử (ESI) và ion hoá bằng hoá học ở
áp suất thường (APCI) hoặc kết hợp 2 kỹ thuật này.
Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI [18], kỹ thuật được sử dụng phổ
biến nhất trong LC-MS. Kỹ thuật này được mô tả như sau:
16


Hình 1.7. K thuật Electrospray Ionization
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền
nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa
điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa
êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide,
nucleotide Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và
sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại
bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi
giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này
tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia
thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này
được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang
điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện
sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải
được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ
thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer):
Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được

gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối được coi là
quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành
17

từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến đến bộ phận
phát hiện và xử lý số liệu.
- Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối
của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo
ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc
tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ
phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang
(photomultiplier). Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ
biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các
electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp
nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống
như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron.
Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn
phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân
quang hoạt động như thiết bị nhân electron.
1.2.3. Một số kỹ thuật LC-MS [4].
a. Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)
Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng và đưa
vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất.
Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total Ion Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn bộ
các ion (FULL SCAN).
FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương
pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn.
b. Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)