Nghiên cứu một số tính chất của nấm men phân lập từ hạt kerfir

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM
MEN PHÂN LẬP TỪ
HẠT KEFIR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM
MEN PHÂN LẬP TỪ
HẠT KEFIR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Người hướng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội







HÀ NỘI – 2013






LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn

chân thành nhất tới cô giáo T – Giảng viên bộ môn Công nghiệp
Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và TS. Đàm Thanh Xuân, những người đã
luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên
cứu khoa học.

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy,
cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn
thành khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy
cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập.



Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1 Lịch sử dùng các sản phẩm sữa lên men 2
1.2 Hạt kefir 3
1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir 3
1.2.2 Đặc điểm hạt kefir 4
1.2.3 Tác dụng hạt kefir 8
1.3 Nấm men 10
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 10
1.3.2 Ứng dụng của nấm men 12
1.3.3 Các công trình nghiên cứu về nấm men trong hạt kefir 13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 15
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15
2.1.3. Môi trƣờng 15
ụng cụ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
16
2.2.2. Khảo sát một số đặc tính probiotic 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
17
p 17
18
18
2.3.5. Phƣơng 18

18
19
19
2.3.9. Phƣ 20
20
2.3.11. 20
21
22
2.3.14. 22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23
23
ấm men từ hạt kefir Hà Lan. 23
ều kiện hô hấ 25
3.1.3. ồn 29
3.1.4. ệt độ 30
3.2. Khảo sát một số đặ 32
3.2.1. Khả ẩn có hại 32
3.2.2. Khả năng chịu pH acid dạ dày 35
3.2.3. Khả năng cộng sinh với vi khuẩn lactic 36
40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Lactobacillus
L.
Streptococcus
Str.
Lactococcus
Lc.
Leuconostoc
Leuc.
Kluyveromyces
Kl.
Saccharomyces
S.
Candida
C.
Debaryomyces
D.
Pichia
P.
Issatchenkia
I.
Yarrowia
Y.
Torulaspora
T.
Rhodosporidium
R.

Bacillus
B.
Escherichia
E.

KHV

DĐVN 4

MT1

MT2

MT3
Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ
(The American Type Culture Collection)
ATCC




DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang
Bảng 1.1:
Các vi sinh vật có trong hạt kefir
7
Bảng 2.1:
Nguyên liệu, hóa chất

15
Bảng 2.2:

16
Bảng 3.1:
Ảnh hƣởng của điều kiện hô hấp đến sự tăng sinh khối
26
Bảng 3.2:
Ảnh hƣởng của hô hấp đến khả năng tiêu thụ đƣờng
26
Bảng 3.3:
So sánh khả năng sinh ethanol của nấm men kefir với S.
cerevisiae tron
28
Bảng 3.4:
Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự tăng sinh khố

30
Bảng 3.5:
Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng nấm men kefir
31


32


trên B. subtilis
34

kefir

36

kefir
37
Bảng 3.10:



38






DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ


Trang
1.1:
H
4


5

-

24
h 3.2:

24


24

2

27

trên
B. subtilis
34

B. subtilis
34
:

35
:

36

2h
36




1

ĐẶT VẤN ĐỀ


s
(FAO/WHO) năm 2002
sẽ cho sức khỏe củ chủ” [15]. t
trong
Baccillus S.
cerevisiae & S. boulardii




2. Nghiên cứu kefir c



2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Lịch sử dùng các sản phẩm sữa lên men
Sữa là chất bài tiết giàu dinh dƣỡng của động vật có vú. Giá trị dinh dƣỡng tự
nhiên của sữa đã đƣợc khuyến khích sử dụng cho con ngƣời ngay từ buổi đầu của
xã hội loài ngƣời. Điều này có thể bắt đầu từ khi các loài động vật đầu tiên đƣợc
thuần hóa. Các sản phẩm sữa lên men cũng đƣợc đề cập sớm trong tiếng Phạn và
các công trình Kito giáo. Ngày nay, ở vùng Cận Đông và Bắc Phi có rất nhiều thực
phẩm sữa lên men truyền thống, đó là những biến thể của sữa chua và pho mát [22].
Tầm quan trọng của sữa chua và pho mát trong văn hóa ẩm thực Hy Lạp
(1.500 năm trƣớc Công Nguyên) và Rome (750 năm trƣớc Công Nguyên) đã từng

đƣợc các nhà nghiên cứu đề cập đến. Sự xuất hiện những bằng chứng khảo cổ tìm
thấy tại Windmill Hill ở Dorset, Anh (1.800 năm trƣớc Công Nguyên) cho biết pho
mát đã đƣợc làm ở Anh trƣớc khi có sự xuất hiện của ngƣời La Mã [22].
Yogurt là sản phẩm sữa chua đƣợc biết đến nhiều nhất và cũng là sản phẩm
phổ biến trên khắp thế giới. Yogurt có nguồn gốc từ Bungari [13]. Ngƣời dân
Thracia cổ đại (các cƣ dân sớm nhất của vùng đất Bungari) thêm sữa lên men vào
sữa tƣơi đã đun sôi để tạo ra sản phẩm gọi là „prokish‟ hay „kvasenomliako‟. Trong
thế kỉ 11, sữa chua Bungari đƣợc đổi tên thành „yogurt‟. „Yogurt‟ là từ có nguồn
gốc ở Thổ Nhĩ Kỳ, trong đó: „yog‟ nghĩa là dày còn „urt‟ là sữa tức là sữa dày. Ở
Tây Âu, yogurt đƣợc đề cập lần đầu tiên ở Pháp khi một ngƣời bác sĩ Thổ Nhĩ Kỳ
chữa khỏi bệnh tiêu chảy cho vua Pháp Francois bằng sữa chua cừu. Kể từ đó,
yogurt đƣợc sử dụng rộng rãi ở Tây Âu. Nhà sinh vật học nổi tiếng ngƣời Nga Ilya
Metchnikoff là ngƣời đầu tiên công bố các tính chất khoa học của yogurt [17]. Ông
cho rằng các vi khuẩn trong yogurt có thể ức chế các vi khuẩn gây bệnh và không
mong muốn trong ruột con ngƣời, tiêu thụ sữa lên men với Lactobacilli giúp kéo dài
tuổi thọ [29].
Sữa lên men thƣờng phân thành bốn loại: (1) Loại tính acid kiêm rƣợu nhƣ
kefir, koumiss (rƣợu sữa ngựa); (2) Loại tính acid cao nhƣ sữa chua Bungari; (3)

3

Loại tính acid trung bình nhƣ sữa acidophilus ; (4) Loại tính acid thấp nhƣ cultured
buttermilk (sữa tƣơi có chất béo nhỏ hơn 5% đƣợc lên men) [22].
sản phẩm sữa lên men
yogurt, lassi, sh ) [29].
Các sản phẩm sữa lên men ngày càng đƣợc ƣa chuộng trên thế giới vì ngoài
việc cung cấp nguồn dinh dƣỡng thiết yếu, chúng còn có tác dụng chữa bệnh. Một
trong những sản phẩm đƣợc quan tâm nhất hiện nay là sữa chua kefir bởi ích lợi mà
nó mang lại. Kefir là sản phẩm làm từ hạt kefir; vừa lên men lactic nhờ nhóm vi
khuẩn ƣa ấm, vừa lên men rƣợu nhờ nấm men. Kefir khác với các sản phẩm sữa lên

men khác là có sự xuất hiện của một nhóm vi sinh vật trong hạt kefir, có thể thu hồi
đƣợc để lên men tiếp. Các vi sinh vật trong hạt kefir thƣờng tạo ra acid lactic, chất
ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng và các vi sinh vật gây bệnh [2]. Mặc
dù, trên thế giới hạt kefir đã phổ biến nhƣng ở Việt Nam còn ít đƣợc biết đến.
1.2 Hạt kefir
1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir
Cách đây hàng nghìn năm, hạt kefir đƣợc biết đến nhƣ một thứ nấm dùng
chữa bệnh, xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng. Hạt kefir có thể làm
biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men
đƣợc chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ. Dân miền núi Caucasus thuộc nƣớc Xô
Viết cũ - nguyên quán của Kefir - đã bào chế nó từ sữa của các sinh vật khác nhau
và Kefir đƣợc lên men tự nhiên trong những túi da thú hoặc bồn bằng gỗ sồi. Việc
tiêu thụ thƣờng xuyên Kefir đã giúp họ tránh đƣợc bệnh ung thƣ, lao, dạ dày… và
họ thọ đến trung bình là 110 tuổi. Núi Caucasus là vùng duy nhất trên trái đất mà
con ngƣời giữ đƣợc sức khỏe ở lứa tuổi này.
Đến cuối thế kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc của ngƣời dân các
nƣớc Đông Âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari ) và các nƣớc vùng
Scandinavia. Đầu thế kỉ 20, Kefir đƣợc sản xuất với quy mô công nghiệp [14], [8].
Hiện nay, kefir đƣợc sản xuất với nhiều tên gọi: Kephir, Kiaphur, Kefer, Kepi hay

4

Kippi… [21].
1.2.2 Đặc điểm hạt kefir
Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và
thƣờng kết thành chùm với nhau với đƣờng kính trung bình 0,3÷3,5 cm. Hạt kefir
không tan trong nƣớc và hầu hết các dung môi. Khi thả vào sữa, hạt kefir thấm nƣớc
(sữa) và trở nên màu trắng đục [22], [13].
Quan sát hình dạng hạt kefir bằng mắt thƣờng cho thấy các hình dạng khác
nhau của hạt từ dạng tấm mỏng phẳng đến dạng cuốn, cuộn lại hay dạng giống hoa

súp lơ con [27].









Còn bằng kính hiển vi điện tử quét cho phép thấy sự kết hợp của các vi sinh
vật trong hạt kefir. Hệ vi sinh vật phần bên ngoài của hạt chi phối bởi trực khuẩn
(ngắn và dài cong) kết hợp với tế bào nấm men (dạng quả chanh). Các tế bào vi sinh
vật ở bên trong ít hơn so với phần bên ngoài của hạt (hình 2). Các sợi nguyên liệu
nhỏ (có thể là kefiran polysaccharide) đƣợc quan sát thấy ở phần bên ngoài cũng
nhƣ phần bên trong hạt [24].



1.1: H [27].

5



b
A- H
(B, C) – V
(D) – N

–
– Polysaccharid
–
: [24].
Hạt kefir chứa một hỗn hợp vi sinh vật cộng sinh phức tạp gồm vi khuẩn lactic
(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc và Streptococcus spp.), nấm men
(Kluyveromyces, Saccharomyces và Torula) và đôi khi còn tìm thấy cả vi khuẩn
acetic (Acetobacter), trong mạng lƣới của polysaccharid và protein [32].
Mạng lƣới là một phức hợp có 13% protein (tính theo trọng
lƣợng khô), 24% polysaccharide, cộng với mảnh vỡ tế bào và các thành phần chƣa
biết. Các polysaccharide chính là một chất hòa tan trong nƣớc đƣợc biết đến nhƣ
kefiran. Kefiran là một vật liệu gồm các sợi nhỏ vô định hình hợp thành để bao
quanh vi khuẩn, nấm men. Chúng cấu tạo bởi D-glucose liên kết D-galactose với tỉ
lệ cân đối, trong mỗi đơn vị lặp lại có nhánh thế ở vị trí 6-O của D-galactose. Các vi
khuẩn lactic lên men đồng hình (L. kefir, L. kefiranofaciens, Leu. mesenteroides, Lc.
lactis ssp. cremoris) đều có thể sản xuất kefiran; trong đó L. kefiranofaciens đƣợc
xác định là sản xuất polysaccharide chính, nằm sâu bên trong hạt, quyết định đến sự
hình thành của hạt. Quá trình sản xuất này đƣợc kích thích bởi CO, ethanol hoặc các
sản phẩm chuyển hóa chƣa biết của vi khuẩn lactic lên men đồng hình .
Hiện nay, kefiran đang đƣợc rất quan tâm bởi khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,
chống ung thƣ [22].

6

Thành phần vi sinh vật của hạt kefir là khoảng 65-80% Lactobacilli, 10-15%
nấm men, 5-25% Lactococci và Leuconostoc spp. Ngƣợc lại, trong kefir, vi sinh vật
mà hạt kefir rụng ra một phần thì tỷ lệ này là khoảng 80% Lactococci và
Leuconostoc spp., 10-15% nấm men và 5-10% Lactobacilli [19].

Nhóm vi khuẩn lactic gồm những loài ƣa ấm và ƣa nhiệt, thực hiện quá trình
lên men lactic theo cơ chế đồng hình lẫn dị hình. Trong quá trình lên men đƣờng
lactose, vi khuẩn lên men theo cơ chế đồng hình sản xuất ra acid lactic còn dị hình
(e) tạo ra acid lactic và CO
2
. Một số loài lên men citrate: Lc. lactis, Leu.
mesenteroides ssp. cremoris Leu. mesenteroides ssp, trong đó Lc. lactis sản xuất
diacetyl, acetaldehyde, ethanol & acetate còn Leu. mesenteroides ssp. cremoris và
Leu. mesenteroides ssp. sản xuất diacetyl, ethanol và acetate [14].
Nấm men gồm những loài lên men đƣợc lẫn không lên men đƣợc đƣờng
lactose. Các loài nấm men lên men đƣợc đƣờng lactose thƣờng đƣợc tìm thấy tại
các vị trí gần bề mặt hạt kefir. Ngƣợc lại, các loài nấm men không lên men đƣợc
đƣờng lactose lại đƣợc tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong hạt. Các tế bào nấm men
tạo ra rƣợu và CO
2
. Gần đây, sử dụng trình tự sao chép các gen rRNA, ngƣời ta
phát hiện nấm Dipodascus capitatus và Trichosporon coremiiforme, tác nhân gây
bệnh, có trong hạt kefir. Đó là cơ sở cho yêu cầu kiểm soát của các chất lƣợng của
vi sinh vật trong hạt kefir [14], [19].
Việc nghiên cứu về hạt kefir rất khó khăn bởi các nguồn gốc khác nhau đang
tồn tại trong các sản phẩm Kefir. Hơn nữa, với số lƣợng lớn vi sinh vật có những
đặc điểm tƣơng tự khiến việc phân lập và xác định các loài riêng biệt trở nên khó.Vì
vậy, hiện nay, nhiều trong số các vi sinh vật trong hạt kefir chỉ xác định đƣợc bằng
cách sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến [8].

7

Bảng 1.1: Các vi sinh vật có trong hạt kefir [8], [32], [19].
Vi khuẩn
Lactobacilli
L. acidophilus
o
L. brevis
e
L. casei
e
L. delbrueckii ssp. bulgaricus
o
L. delbrueckii ssp. delbrueckii

L. delbrueckii ssp. lactis
L. fementum
e
L. fructivorans
e

L. hilgardi
e

L. helveticus
o
L. kefiranofaciens ssp.kefiranofaciens
0
L. kefir
e

L. kefirgranum
o
L. parakefir
e
L. paracasei ssp. paracasei
e
L. plantarum
e
L. rhamnosus
e
L. sake
e

Streptococci
Str. thermophilus
Str. filant
Str. durans
Lactococci
Lc. lactis
e
Lc. lactis ssp. lactis
o
Lc. lactis ssp. cremoris
o

Leuconostoc
Leuc. mesenteroides ssp. cremoris
e
Leuc. mesenteroides ssp. dextranicum
e

Leuc. mesenteroides ssp. mesenteroides
e
Acetobacter
Acetobacters aceti
Acetobacters racens
Nấm men
Kluyveromyces
Kl. lactis
l
Kl. marxianus ssp bulgaricus
Kl. marxianus ssp marxianus
Saccharomyces
S. cerevisiae
n
S. delbrueckii
n
S. unisporus
n

S. pastorianus
n

S. turicensis
n
S. exiguus
n

Candida

8

C. kefir
l
C. famata
l
C. fimetaria
n
C. friedrichii
n
C. maris
n

C. humilis
n
C. krusei
n
C. lipolytica
n

Debaryomyces
D. occidentalis
n
D. hansenii
l
(t) / C. famata

(a)
Pichia
P. fermentans
n

(t) / C. firmetaria (a)
Issatchenkia
I. orientalis
n
(t)/ C. krusei (a)

Yarrowia
Y. lipolytica
n
(t)/ C. lipolytica (a)

Dekkera

Dekkera anomala
l
(t)/ Brettanomyces anomalus
l
(a)
Galactomyces
Galactomyces geotrichum

(t)/ Geotricum candium (a)
Torulaspora
T. delbrueckii
n

Rhodosporidium
R. kratochvilovae
o: lên men đồng hình, e: lên men dị hình, l: lên men đƣợc đƣờng lactose, n: không lên men
đƣợc đƣờng lactose, t: giai đoạn sinh sản hữu tính, a: giai đoạn sinh sản vô tính.

Hạt kefir đƣợ trữ trong nƣớc chỉ có thể đƣợc trong 8-10 ngày; trong
không khí khô hoặc đông khô có thể đƣợc lƣu giữ trong 12-18 tháng mà không làm
giảm hoạt động của hạt kefir. Hạt đông lạnh bảo quản ở -20
0
C duy trì vi sinh vật
hoạt động cho 7-8 tháng, trong khi hạt lạnh cho thấy giảm hoạt động sau 10 ngày
[22].
1.2.3 Tác dụng hạt kefir
Tên kefir nguồn gốc từ Thổ Nhĩ Kỳ kefi, dịch là 'cảm thấy tốt'. Có rất nhiều
các loại đồ uống làm từ hạt kefir bằng cách lên men sữa động vật (lạc đà, bò, dê

9

cừu), sữa thực vật (hạnh nhân, đậu phộng, sữa đậu nành), trái cây hay nƣớc đƣờng
nhƣng những tác dụng của kefir vẫn không thay đổ
), kefir đƣợc coi nhƣ là một chế phẩm sinh học [19].
Tác dụng probiotic của kefir: kefir bổ sung nhiều vi sinh vật có lợi giúp cân
bằng hệ vi sinh đƣờng ruột. Trong lịch sử, kefir đã đƣợc đề nghị điều trị các bệnh
nhƣ có vấn đề về tiêu hóa, tăng huyết áp, dị ứng, và bệnh thiếu máu cơ tim [19].
Tác dụng trên ruột: Kefir đã đƣợc chứng minh là làm giảm số lƣợng Clostridia
spp. trong ruột và tăng số lƣợng Bifidobacteria và Lactobacilli. Tác dụng probiotic
của kefir tập trung ở khả năng điều chỉnh hệ vi sinh vật đƣờng ruột: giảm vi sinh vật
gây bệnh ở niêm mạc ruột bằng các sản phẩm acid và chất diệt khuẩn đƣợc tạo ra để
ức chế trực tiếp hay loại trừ bằng cạnh tranh, đồng thời gia tăng số lƣợng vi khuẩn
có lợi [19].
Tác dụng kháng khuẩn: Chế phẩm kefir đƣợc báo cáo là có khả năng diệt và
kìm hãm trên cả vi khuẩn Gr(+) và Gr(-). Tác nhân gây bệnh bị ức chế bởi kefir,
chất chiết xuất từ kefir, hoặc vi khuẩn phân lập từ kefir bao gồm Salmonella typhi,
Salmonella typhimurium, Salmonella enteriditis, Shigella sonnei, Yersinia
enterocolitica, Micrococcus luteus, Micrococcus flavans, Escherichia coli, Bacillus

cereus, Klebsiella pneumoniae và Candida albicans… Cơ chế chính để ức chế tác
nhân gây bệnh là do sự hiện diện của các acid hữu cơ trong hạt kefir (acid lactic,
acid axetic…) [19].
Tác dụng chống u và chống ung thƣ:
Kefir có tác dụng ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ và ngăn chặn một
số loại ung thƣ (đại tràng, vú) và giảm kích thƣớc khối u. Điều này đƣơc chứng
minh trên mô hình động vật, thông qua chế độ ăn bổ sung kefir cho thấy một số
thành công trong việc tăng apoptosis, giảm kích thƣớc khối u, ngăn ngừa quá trình
lipid peroxy và tăng glutathione trên chuột có đại tràng bất thƣờng. Tƣơng tự, chất
chiết xuất từ kefir có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ vú. Khả năng chống u
bƣớu của kefir có liên quan đến kefiran (ức chế ung thƣ Ehrlich và Sarcoma180)
đƣợc đề xuất rằng polysaccharide kích thích hệ miễn dịch thông qua hoạt động của

10

tế bào T. Một cơ chế khác đƣợc đề xuất là tăng tế bào giết tự nhiên, hoạt động đại
thực bào [18].
Giúp dung nạp lactose: Một số vi sinh vật trong kefir có khả năng phân giải
lactose thành đƣờng đơn (glucose, galactose) giúp cho những ngƣời không dung
nạp đƣợc lactose có thể sử dụng đƣợc sữa [18].
Giảm cholesterol: Một số nghiên cứu cho thấy giảm cholesterol huyết thanh và
phospolipids trên những con chuột có chế độ ăn uống cholesterol cao bổ sung kefir.
Vì thế, có lợi cho việc ngăn ngừa các sự xuất hiện của nhiều bệnh tim mạch nhƣ đau
tim và đột quỵ [18].
Ngoài ra, kefir có rất nhiều tác dụng khác nhƣ giảm cân, chống oxy hóa, giảm
stress, tăng hoạt động của não, cung cấp các vitamin, tăng cƣờng hoạt động miễn
dịch… [33].
1.3 Nấm men
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy
Nấm men có thể thuộc về hai lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn

(Deuteromecetes hoặc Fungi imperfect). Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào
hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi. Tế bào nấm men có hình cầu, hình oval
hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài ra thành sợi.
So với các vi sinh khác, tế bào nấm men có kích thƣớc tƣơng đối lớn khoảng 7 ×
8-12 µm [27], [29].
Dinh dƣỡng
- Nguồn cacbon: gồm các loại đƣờng và dẫn chất, các rƣợu, acid hữu cơ, acid
amin Tất cả các loại nấm men đều sử dụng đƣợc glucose. Nhiều loài nấm men,
trong đó có giống Saccharomyces không sử dụng đƣợ giống Candida,
Torulopsis. Các disacarit (maltose và saccarose) trƣớc khi sử dụng phải nhờ enzym
tƣơng ứng của nấm men thủy phân sơ bộ thành đƣờng đơn. Nấm men không sử
dụng trực tiếp đƣợc tinh bột cũng nhƣ cellulose và hemicellulose trừ một số chủng
thuộc giống Candida có hoạt tính amylase ngoại bào [9].

11

- Nguồn nitơ: bao gồm nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ đƣợc
nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng nhƣ hữu cơ. Đó là
amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối acetat, lactat, malat và succinat. Nấm men
chỉ sử dụng đƣợc acid amin ở dạng tự nhiên (L-acid amin). Muốn tiêu hóa đƣợc
các hợp chất (acid amin và amit) nấm men cần có các vitamin nhƣ biotin, acid
pantoteic, pyridoxin, thiamin [9].
- Các nguyên tố vô cơ: phospho đƣợc quan tâm trƣớc hết sau đó là kali, magie
và lƣu huỳnh… Phospho đóng vai trò rất quan trọng trong cấu tạo tế bào, xác định
biến đổi hóa sinh, đặc biệt là trao đổi chất và vận chuyển năng lƣợng. Lƣu huỳnh là
thành phần một số acid amin trong phân tử protein, là nhóm phụ (-SH) của một số
enzym CoA nên nếu thiếu không tổng hợp đƣợc protein. Các ion Ca
2+
, K
+

, Mg
2+

cũng rất cần cho nuôi cấy nấm men. Thông thƣờng K
+
đƣợc bổ sung cùng các muối
phosphat hoặc sulfat, còn ion Mg
2+
và Ca
2+
thƣờng đủ trong nƣớc sinh hoạt. Các
nguyên tố vi lƣợng: Mn, Cu, Fe, Zn, Bo, Li… chỉ cần một lƣợng rất nhỏ.
- Các chất sinh trƣởng bao gồm các vitamin, bazơ purin và pyrimidin. Trong
công nghiệp, nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nƣớc chiết cám, dịch thủy
phân đậu tƣơng bằng enzym và đặc biệt là rỉ đƣờng. Nguồn cao ngô có thể đáp ứng
cả nhu cầu vitamin và acid amin [9].
Hô hấp
Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy tiện.Vì vậy, chúng có hai kiểu hô hấp kị
khí và hiếu khí tùy thuộc vào điều kiện oxy cung cấp cho quá trình trao đổi của
chúng. Trong điều kiện hô hấp kị khí, nấm men tạo ra ít năng lƣợng hơn so với hiếu
khí vì vậy để đảm bảo cung cấp năng lƣợng nấm men tiêu tốn nhiều cơ chất hơn [9].
Nhiệt độ:
Đa số nấm men có nhiệt độ thích hợp là 28÷32
o
C
0
C. Nhiệt độ không chỉ ảnh hƣởng đến cƣờng độ lên men và
sinh trƣởng của nấm men còn ảnh hƣởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm. Nhiệt độ
càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩ [9].
pH

12

Mỗi chủ đều có khoảng pH thích hợp cho sinh trƣởng và phát
triển riêng. Với giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp cho lên men là 5,5.
Trong quá trình lên men giảm xuống 4,4-4,5 rồi lại tăng lên do sự tạo thành CO
2
và
các acid hữu cơ [9].
1.3.2 Ứng dụng của nấm men
Từ thời xa xƣa, loài ngƣời đã biết dùng nấm men để lên men rƣợu tạo ra một
loại nƣớc uống có hƣơng vị đặc biệt kích thích ăn ngon và cho đến ngày nay loài
ngƣời đã sử dụng nấm men trong một số lĩnh vực sau.
Sản xuất ethanol:
 Cồn ethylic là loại dung môi quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp,
đặc biệt công nghiệp thực phẩm và công nghiệp Dƣợc. Nguyên liệu có thể là đƣờng
hoặc tinh bột, cellulose đƣợc nấu chín rồi đƣờng hóa bằng acid hoặc enzym vi sinh
vật. Đƣờng tạo ra đƣợc lên men bằng S. cerevisiae tạo rƣợu rồi đem cất [4].
 Sản xuất rƣợu vang: Ngƣời ta thƣờng dùng S. vini loài sống trên bề mặt
quả nho. Chỉ cần lấy nho chín về xay nát và thêm đƣờng vào cho lên men trong điều
kiện kỵ khí [9].
 Sản xuất bia: Nguyên liệu là thóc malt, gạo, ngô đƣợc lên men nổi
S. cerevisiae ở 14-25
o
C hay men chìm S. carlobergensis ở 6-8
o
C.
Ở điều kiện đó, quá trình lên men xảy ra chậm nên CO
2
hấp thụ tốt vào bia và khi

rót bia sẽ tạo ra nhiều bọt [9], [4].
Sản xuất sinh khối
Sinh khối nấm men chứa nhiều vitamin B và các acid amin quan trọng. Vì vậy,
thực tế ngƣời ta sử dụng để: làm nở bột m trong công nghiệp
bánh m , làm nguồn protein-vitamin bổ sung cho thức ăn chăn nuôi… Nghiên cứu
làm bánh mỳ sử dụng hạt kefir nhƣ nấm men bánh m cho thấy: bánh mì đƣợc sản
xuất với kefir giữ lại độ ẩm hơn, độ axit thấp (pH 4,9-5,5) và giữ lại độ „tƣơi‟ của
chúng lâu hơn so với bánh mì làm từ nấm men bánh mì thông thƣờng [4], [30].
Ứng dụng nấm men trong lĩnh vực Y-Dƣợc

13

Nấm men dùng trong dƣợc phẩm gồm tế bào nấm men tƣơi hay đông khô.
P.
pastoris S. cerevisiae
.
Men bia giúp tăng hoạt tính của enzym trong ruột như disaccharidase,
saccharidase, maltase và lactase để giúp giảm các triệu chứng tiêu chảy; cũng giúp
tăng hoạt động của insulin rất có ích cho bệnh nhân tiểu đường do chứa nhiều
chromium [9]. Trong một nghiên cứ những người dùng mỗi
ngày 2 muỗng canh men bia trong 8 tuần có thể giúp làm hạ cholesterol trong máu
trung bình được 10% [5].
Một số loài nấm men nhƣ S. cerevisiae, S. boulardii đƣợc bổ sung vào các sản
phẩm probiotic. Đặc biệt là S. boulardii Biocare, Bio-
flora, Florastor, Normargut, Usapha Bio…. So với vi khuẩn việc bổ sung nấm men
có những ƣu điểm sau:
- Có khả năng đề kháng kháng sinh và sulfamid (ngoại trừ kháng sinh kháng
nấm).
- Có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn (men tiêu hóa sống).
- Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi

khuẩn gây viêm ruột kết màng giả cũng nhƣ trung hòa đƣợc nội độc tố E. coli và
Vibrio cholerae nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính.
- Không gây ra sự ứ thừa vi khuẩn.
- Điều kiện nuôi cấy đơn giản, chi phí thấp, sinh sản nhanh [12].
1.3.3 Các công trình nghiên cứu về nấm men trong hạt kefir
Phần lớn các công trình nghiên cứu về nấm men trong hạt kefir đều là để định
danh các loài bằng phƣơng pháp sinh học phân tử. Dƣới đây là một số nghiên cứu
trên thế giới đã thực hiện trên nấm men của hạt kefir:
Liu Hui, Li Ping-Lan, Gong Pin, Wang Lei
khả nấm men

14

Kết quả cho thấy nấm men đƣợc phân lập từ dịch lọc kefir và
lotiones lên men lactose khác nhau điều kiện tối ƣu cho lên men thu đƣợ
nhiệt độ 28 ℃, thời gian 60h, cấy 3% [25].
Năm 2010, Gorsek A. & Z
ethanol kefir nhiệt độ và
thời gian lên men. l
25
0
C. Giá trị năng lƣợng kích hoạt của sản xuất ethanol là 64,3 kJ/mol [20].
Năm 2013, M.G.C.P. Miguel, P.G. Cardoso, K.T.
Ma -
của nấm men kefir từ Brazil, Canada và
Hoa Kỳ. 25 loài nấm men đƣợc phân lập từ sữa lên men kefir
chỉ có 3 loài S. cerevisiae, Saccharomyces sp. và Kl. marxianus có thể phát triển ở
nồng độ 12% (v/v) ethanol. thử nghiệm ở nồng độ
tất cả đạt mức tăng trƣởng tối đa ở nồng độ đƣờng 25% (v/ S. cerevisiae
và Kl. marxianus có tốc độ tăng trƣởng cao nhất [26].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về hạt kefir nói chung và nấ
(2006)
cho t 30
0
C [8].








15


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
ấm men tách từ h –
Chủ B. subtilis – ATCC6633 E. coli – ATCC25922
: S. cerevisiae –
L. acidophilus– ATCC4653
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Bảng 2.1: Nguyên liệu, hóa chất
Tên nguyên li


Glucose
Việt Nam

Đức
(NH
4
)
2
SO
4

Trung Quốc
MgSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc
KH
2
PO
4

Trung Quốc
Thạch bột
Việt Nam
Pepton
Ấn Độ
Cao thịt
Đức
NaCl
Trung Quốc

 Fehling A, Fehling B, K
2
Cr
2
O
7
0,5N, Na
2
S
2
O
3
0,1N & HCl pH
1,2

2
SO
4
25%, Ba(OH)
2
10%
2.1.3. Môi trường

(MT2)
Glucose
: 8,0 g
Glucose
: 5,0 g

: 0,5 g

C
: 0,5 g

16

(NH
4
)
2
SO
4

: 0,5 g
(NH
4
)
2
SO
4

: 0,5 g
MgSO
4
.7H
2
O
: 0,1 g
MgSO
4
.7H

2
O
: 0,1 g
KH
2
PO
4
: 0,2 g
KH
2
PO
4

: 0,2 g

100ml

: 2,3 g
Môi trường thạch thường (MT3)

100ml
Pepton
: 1,0 g


Thạch bột
: 2,3 g


Cao thịt

: 0,5 g


NaCl
: 0,5 g



100ml



và dụng cụ
Bảng 2.2
Thiết bị
Nguồn gốc
Tủ cấy UV Bioair
Italia
Tủ ấm, tủ sấy Memmert
Đức
Nồi hấp ALP
Nhật
Lò vi sóng Daewoo
Hàn Quốc
Tủ lạnh Toshiba
Nhật
Máy li tâm Rotofix
Đức
Máy lắc Bioshaker
Đức

ật
Đức


Máy khuấy từ

Bếp cách thủy
Trung Q
Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ trang…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phâ
- nấm men từ hạt kefir Hà Lan.

17

-
2.2.2. Nghiên cứu một số đặc tính probioti
-
B. subtilis & E. coli.
- acid .
- lactic.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
ấy giống đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Tủ cấy đƣợc tiệt
trùng trƣớc khi sử dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 70
o
và bật đèn UV trong 20
phút.
2.3.1. Phương pháp
MT2
0

-

-
gi

0
C/24h.
2.3.2.
Pha môi trƣờng thạch tan hế
ống nghiệm (khoảng 10 ấp tiệt khuẩn (115
0
ặt nghiêng các ống nghiệm sao cho chiều cao của môi trƣờng đến
khoảng 2/3 ống. Để nguội cho thạch đông lạ
. Sau 24h, các ống giống đạt yêu cầu đƣợc bảo quản
trong tủ lạnh ở 4 -5
0
C.
-
0
C/24h.