Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây gạo

P

NG
H
P
HÁ
P
S
Ố


TR
Ư
H
IÊN
C
P
XÁ
C
Ố
CH
Ấ
V
KHÓA
L

Ư
ỜNG Đ
L
Ụ

C
ỨU
C
ĐỊ
N
Ấ
T P
H
Ỏ
T
H
L
UẬN
T
H
BỘ Y
ẠI HỌ
C
WY 

Ụ
C TU
Ấ
XÂ
Y
N
H H
À
H
ÂN

L
H
ÂN
C
T
ỐT N
G

H
À NỘI
TẾ
C
DƯỢ
C
ZX

Ấ
N TÚ
Y
DỰ
N
À
M
L
L
ẬP
Đ
C
ÂY
G

G
HIỆP
D
- 2013
C
HÀ N
Ộ
N
G P
H
L
ƯỢ
N
Đ
Ư
Ợ
G
ẠO
D
ƯỢC S
Ộ
I
H
ƯƠ
N
N
G
M
Ợ
C T

Ừ
Ĩ
N
G
M
ỘT
Ừ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
WY  ZX



LỤC TUẤN TÚ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT
SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
VỎ THÂN CÂY GẠO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
2. DS. Phạm Lê Minh
Nơi thực hiện:
1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ
phẩm Hà Nội

2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác
định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây Gạo”, ngoài sự làm việc
nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự
khích lệ từ phía nhà trường, thày cô, gia đình và bè bạn.
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thái Nguy
ễn
Hùng Thu – Trưởng Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, người đã dành nhiều thời gian
và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thái An – Bộ môn Dược Liệu,
người đã rất nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Hồ Thị Thanh Huyền và DS. Phạm
Lê Minh - Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất cùng toàn thể
các cán bộ Bộ môn Hóa
phân tích-Độc chất, cán bộ Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thày cô Trường Đại học Dược Hà nội, đặc biệt
là những thày cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại Trường.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, b
ạn bè đã động viên tôi về mọi mặt
và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để
tôi có kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng 05 năm 2013.

Lục Tuấn Tú

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3
1.2.TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VỎ THÂN CÂY GẠO 3
 Hoạt động antiangiogenic của Lupeol 4
 Tác dụng hạ huyết áp 4
 Tác dụng chống viêm 4
 Tác dụng bảo vệ gan 4
 Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con
người ……………………………………………………………………………4
 Tác dụng kháng khuẩn, kháng n
ấm 5
1.3.CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4.THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4.1. Công thức hoá học, tính chất vật lý, tác dụng dược lý của một số chất phân
lập từ vỏ thân cây Gạo 6
1.5.MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 12
1.5.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao 12


1.5.2. Các thông số đặc trưng 13
1.5.3. Hệ thống máy HPLC 15
1.5.4. Các phương pháp định lượng bằng kỹ thuật HPLC 16
1.5.5. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 17
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21
2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 21
2.2.1. Hóa chất 21
2.2.2. Dụng cụ thiết bị 21
2.3.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.4.1. Chuẩn bị mẫu thử 22
2.4.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 23
2.4.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 23
2.4.4. Thẩ
m định phương pháp phân tích 24
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 26
CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27
3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27
3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu: 27
3.1.2. Hiệu suất chiết 27
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 27
3.3. XÁC ĐỊNH
ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU 30
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ 33

3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ
THÂN CÂY GẠO BẰNG HPLC 36
3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký: 36
3.5.2. Tính đặc hiệu 36

3.5.3. Độ lặp lại 37
3.5.4. Khoảng nồng độ tuyến tính 37
3.5.5. Độ đúng 41
3.5.6. Giới hạn phát hiện LOD và giớ
i hạn định lượng LOQ 41
3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO42
3.7.BÀN LUẬN 42
3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu 42
3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC 43
3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo 43
3.7.4. Về thẩm đị
nh phương pháp định lượng 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45
KẾT LUẬN 45
ĐỀ XUẤT 46

TÀI LIỆU THAM KHÁO
PHỤ LỤC





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C:
Nồng độ (µg/mL)
ESI:
Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
EtOH:
Ethanol

HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS:
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LOD:
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ:
Giới hạn định lượng (Limit of Quatification)
MeCN:
Acetonitril
MeOH:
Methanol
MS:
Khối phổ (Mass Spectrometry)
RSD:
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
S/N:
Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)
SD:
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
STT:
Số
thứ tự
S:
Diện tích pic sắc ký (mAu.s)
TP:
Thành phần
t
R

:
Thời gian lưu
UV-VIS:
Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)




DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu
27
Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 36
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất phân tích 37
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tuyến tính với epicatechin 38
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tuyến tính với catechin 38
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tuyến tính với daucosterol 39
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tuyến tính với Lupeol 39
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tuyến tính với Stigmasterol 40
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tuyến tính với friedelin 40
Bàng 3.10. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất 41
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/mL) 41
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu vỏ thân cây Gạo
nghiên cứu
42
Bảng phụ lục. Kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất trong vỏ thân cây Gạo.

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hệ thống máy HPLC 15
Hình 1.2. Sơ đồ khối của máy khối phổ 18
Hình 1.3. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba. 19
Hình 3.3. Sắc ký đồ của epicatechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo. 31
Hình 3.4. Sắc ký đồ của catechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo. 31
Hình 3.5. Sắc ký đồ của daucosterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 31
Hình 3.6. Sắc ký đồ của lupeol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo. 32
Hình 3.7. Sắc ký đồ của stigmasterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 32
Hình 3.8. Sắc ký đồ của friedelin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 32
Hình 3.9. Phổ khối lượng ứng với các pic của epicatechin trên sắc ký đồ của mẫu
thử và hỗn hợp chất đối chiếu 33
Hình 3.10. Phổ khối lượng
ứng với các pic của catechin trên sắc ký đồ của mẫu
thử và hỗn hợp chất đối chiếu. 34
Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với các pic của daucosterol trên sắc ký đồ của
mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 34
Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với các pic của lupeol trên sắc ký đồ của mẫu thử
và hỗn hợp chất
đối chiếu 34
Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với các pic của stigmasterol trên sắc ký đồ của
mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 35
Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với các pic của friedelin trên sắc ký đồ của mẫu
thử và hỗn hợp chất đối chiếu 35
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu) 37

Hình phụ lục. Sắc ký đồ của hỗn hợp mẫu thử.
- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) là cây gỗ cao đến 15m, có hoa màu đỏ
tươi, được biết đến như là một cây thuốc dân gian tại các nước Pakistan, Ấn Độ,
Trung Quốc, Việt Nam và châu Phi. Theo kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của
cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày,
viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy xương, kiết lỵ.
Từ vỏ thân cây Gạo, nhóm tác giả Hồ Thị Thanh Huyề
n và cộng sự đã
nghiên cứu với mẫu thu hái tại Hà Nội, các tác giả đã phân lập được một số thành
phần như epicatechin [11], catechin, momor-cerebroside I [12], lupeol, stigmasterol
[13], friedelin và daucosterol.
Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn
thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế
về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũ
ng
như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời.
Tuy nhiên nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa
có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học. Cần có các nghiên cứu xác định
hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm năng của
nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình hiệ
n đại
hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây
Gạo” đã được thực hiện nhằm mục tiêu:
1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã
được phân lập từ vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng
epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin có trong một
mẫu vỏ thân cây Gạo thu hái được.

- 2 -

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Bombax malabaricum DC. họ Gạo (Bombacaceae) [4], [18],
[19].
Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba L., Gossampinus malabarica (DC.) Merr.,
Salmalia malabarica (DC.) Schott et Endl, Bombax heptaphylla Cavl [4], [7], [8],
[9], [10], [14], [16], [18], [19].
Tên khác: Gòn rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu (Tày) [4], [7], [8],
[9].
Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn. Thân cây thẳng, sần sùi, màu xám, có bạnh
vè to ở gốc, lá mọc so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng,
gốc thuôn, đầu nhọn, dài 9-15cm, rộng 4-5cm, hai mặt nhẵ
n, mép nguyên, cuống
chung dài hơn phiến lá, dài từ 20-25cm [2], [4], [7], [8], [9], [10], [18], [19].
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, 1-3 hoa mọc cùng một cuống. Hoa
màu đỏ, thỉnh thoảng màu cam, vàng, đường kính 7,5-11cm, dài 5-10cm. Hoa
nhiều, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe. Hoa to, đều, lưỡng tính. Nhị rất nhiều hợp thành
5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh
khác nhau. Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu nhụy, bầu hình nón, có lông màu
trắng nhạt.
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo
- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm,
thu liễm [3].
- Vỏ thân cây Gạo có vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi tiểu, tiêu sưng, gây
nôn [17], khu phong, trừ thấp, tiêu thũng [3]. Theo tài liệu Ấn Độ, nước sắc vỏ thân
có tác dụng làm dịu viêm, cầm máu [3].

- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây
nôn và giảm đau [17], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ
huyết, tán kết, chỉ thống. Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [3].
- 3 -

- Vỏ từ 15 – 16g, có thể sắc và ngậm chữa đau răng [15]. Vỏ còn được dùng
trị thấp khớp, đau giập gãy xương, dùng cầm máu trong các chứng băng huyết (phối
hợp với rễ non và hạt cây tươi), liều dùng 15 – 30g [5], dùng đắp chữa tàn nhang,
mụn trứng cá, các rối loạn sắc tố da [10].
- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ
[10].
- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [17].
- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu,
rong kinh, kích dục [3].
- Rễ Gạo ép lấy nước chữa sốt, chữa kiết lỵ, chữa đau dạ dày mạn tính [3],
chữa đau thượng vị, viêm hạch bạch huyết dạng lao và làm thuốc lợi tiểu. Ở Ấn Độ,
người ta dùng rễ làm thuốc kích dục cho trường hợp bất lực, liều dùng 30 – 50g
[17].
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:
- Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [2], [18], [19] nhưng
cũng có tài liệu [6] cho rằng tốt nhất vào mùa hè. Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô
bên ngoài, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống, hoặc dùng tươi giã nát để đắp
ngoài [15], [4].
-
Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô [15],
[4].
- Hoa: hái vào mùa xuân, ép lấy nước (dùng tươi) hoặc phơi khô, tán thành
bột để uống [15], [4], [18], [19].
- Gôm, gỗ, nhựa, hạt, quả, bông: cũng được thu hái, chế biến phù hợp với

mục đích sử dụng [15], [4], [18], [19].
1.2. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VỎ THÂN CÂY GẠO
Cây Gạo được biết đến với nhiều tác dụng: chống viêm, giảm đau, hạ huy
ết
áp, hạ đường huyết, chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
Helicobacter pylori, hạ sốt, cầm máu, tác dụng ức chế trên ống hình thành các tế
- 4 -

bào tĩnh mạch rốn của con người, hoạt động antiangiogenic, chống ung thư và
HIV. Một số tác dụng dược lý liên quan tới vỏ thân cây Gạo như:
 Hoạt động antiangiogenic của Lupeol
Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược liệu
thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol của
vỏ thân cây Gạo có tác động antiangiogenic trên dòng tế bào thuộc màng trong
ống dây rốn (HUVEC). Ở nồng độ 30 và 50µg/mL, lupeol có tác dụ
ng ức chế trên
ống HUVEC với tỷ lệ tương ứng là 40%-60% và trên 80%, trong khi nó không
ảnh hưởng tới sự phát triển của dòng tế bào ung thư độc như SK-MEI-2, B16-F10
[31], [43].
 Tác dụng hạ huyết áp
Theo [43], lupeol và dịch chiết methanol của vỏ thân có tác dụng hạ áp.
 Tác dụng chống viêm
Chiết xuất vỏ thân bằng dầu hỏa thu được cắn, cắn được lắc với methanol thu
được chất kết tinh không màu được xác đị
nh là lupeol có tác dụng chống viêm [28],
[23], [21]. Các phân tích thống kê cho thấy ba bộ phận gồm vỏ thân, lõi của thân
cây và rễ có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng
carrageenan.
 Tác dụng bảo vệ gan
Theo [41], [23], các bộ phận của cây Gạo như vỏ thân, lõi thân, rễ có tác

dụng giảm nhẹ tổn thương gan gây ra bởi CCl4. Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế
bào, giảm thoái hóa cũng được ghi nhận. Dịch chiết methanol của một số bộ phận
của cây, cao lỏng 1g/mL cũng được chứng minh là có tác dụng làm giảm men gan,
giảm sự suy thoái và hoại tử tế bào gan thông qua thử nghiệm gây độc tế bào gan
bằng CCl4.
 Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con
người
Do sự hình thành mạch quá nhiều cũng là một tiến trình bệnh lý thuộc bệnh
viêm khớp, thấp khớp nên Nguyễn Hải Nam cùng các nhà khoa học Hàn Quốc đã
- 5 -

tiến hành nghiên cứu tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm
rốn của một số cây thuốc thu hái tại Việt Nam. Trong số 58 cây nghiên cứu thì có 7
cây có tác dụng ức chế trong đó có cây Bombax malabaricum DC. [43].
 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Theo [28], dịch chiết nước, dịch chiết ethanol, dịch chiết ether của bột vỏ
thân được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn, với chất đối chiếu ofloxacin.
Mẫu nghiên cứu có tác d
ụng trên các chủng vi khuẩn như: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Klebsiella
aerogenes, Neisseria gonorrhoae. Các dịch chiết cũng có tác dụng kháng nấm, với
chất đối chiếu fluconazole, chủng nấm thử là Candida albicans.
1.3. CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO
Vỏ thân cây Gạo dùng tươi chữa gãy xương, sai khớp, viêm khớp và một số
bệnh khác liên quan tới cơ xương khớp. Đồng bào ở Tây Nguyên dùng vỏ Gạo và
vỏ cây đa quả to, phơi khô, thái nhỏ, sắc uống chữa bệnh đậu mùa. Nước sắc đặc
của vỏ Gạo được ngậm chữa đau răng [15], [4], [9], [18], [19]. Vỏ thân còn dùng để
cầm máu trong chứng băng huyết (phối hợp với rễ non và hạt cây tươi) [6], [7]. Vỏ
Gạo sao vàng sắc uống làm thuốc an thần, lợi tiểu với liều 15-20g/ngày. Vỏ khô sắc
uống 10-20g/ngày, dùng đồng thời giã đắp để chữa quai bị. Nước sắc v

ỏ hoặc hoa
dùng để chữa ỉa chảy, kiết lỵ. Vỏ thân được sử dụng bên ngoài như miếng dán cho
viêm nhiễm và phát ban ngoài da [15], [4], [9], [18].
1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY GẠO
Hồ Thị Thanh Huyền đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ
thân cho thấy:
Vỏ thân có chứa: Glycosid Tim, saponin, flavonoid, coumarin, alkaloid,
tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol. Không có anthranoid, acid amin,
polysaccharid, chất béo, caroten [11], [12], [13], [34], [43]. Cũng từ vỏ thân cây
Gạo, tác giả sử dụng s
ắc ký cột với chất hấp thụ là silicagel có cỡ hạt 40-63 µm đã
phân lập được 2 chất: epicatechin và bis (2-ethylhexyl) adipate [11].
- 6 -

Vỏ thân chứa chất nhầy. Năm 2003, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập
được một chất từ phân đoạn dicloromethan là lupeol [33], [43]. Năm 1971, β-
sitosterol cũng được phân lập từ vỏ thân [32]. Ngoài ra, từ vỏ thân cây Gạo còn
phân lập được shamimicin [33], shamimin [28], 5-isopropyl-3-methyl-2,4,7
trimethoxy-8,1-naphtalen carbolacton và một naphthoquinon là 8-formyl-7-
hydroxy-5-isopropyl-2-methoxy-3-methyl-1,4-naphthoquinon [32].
1.4.1. Công thức hoá học, tính chất vật lý, tác dụng dược lý của một số chất
phân lập từ vỏ thân cây Gạo
1.4.1.1. Lupeol

• Nguồn gốc
Năm 2013: Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được lupeol [13] từ
vỏ thân cây Gạo với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô.
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (1R, 3aR, 5aR, 5bR, 7aR, 9S, 11aR, 11bR, 13aR, 13bR)-3a,
5a, 5b, 8, 8, 11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 9, 10, 11, 11b,

12,13,13a, 13b-hexadecahydrocyclopenta [a]chrysene-9-ol
- Tổng hợp: Năm 2009 Surendra và Corey đã báo cáo một con đường để
tổng hợp Lupeol từ (1E,5E)-8-[(2S)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-2,6-dimethylocta-1,5-
dienyl acetate [38].
- Công thức phân tử: C
30
H
50
O
- Khối lượng phân tử: 426,72 g/mol
- Điểm nóng chảy: 212
o
C
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, ether, benzene
- λ
max
: 350nm
- 7 -

• Tác dụng dược lý
- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược
liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol
của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác động antiangiogenic trên dòng tế bào
thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [31], [43].
- Cũng theo [41], [43], [23], lupeol còn có tác dụng giảm nhẹ tổn thương
gan gây ra bởi CCl4. Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế bào, giảm thoái hóa cũ
ng
được ghi nhận. Ngoài ra, lupeol còn có tác dụng dãn mạch, hạ huyết áp.
- Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh lupeol có tác dụng chống viêm
[42], [21], [20], [28], [23] và tác dụng chống oxy hoá, có thể ứng dụng trong điều trị

ung thư [20], [40].
1.4.1.2. Epicatechin

• Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã thành công trong việc phân
lập Epicatechin từ vỏ thân cây Gạo [11], [13].
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (2R, 3R)-2-(3, 4-dihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-2H-
chromene-3, 5, 7-triol
- Công thức phân tử: C
15
H
14
O
6

- Khối lượng phân tử: 290,27 g/mol
- Điểm nóng chảy: 177
o
C
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH
- λ
max1
: 220nm; λ
max2
: 277 nm

- 8 -

• Tác dụng dược lý

- Theo Katsuyuki Tanabe và cộng sự tại Đại học Kyoto, Nhật bản, đã
chứng minh được rằng epicatechin có tác dụng hạn chế tổn thương thận do tác dụng
bảo vệ tế bào ty thể của thận [39].
- Ngoài ra, trong nghiên cứu [34], Parmvir Bahia và cộng sự đã đưa ra rằng
epicatechin có tác dụng kích thích các yếu tố đáp ứng ERK thông qua AMP vòng để
điều chỉnh GluR2 trong tế
bào thần kinh vỏ não, qua đó có tác dụng cải thiện dẫn
truyền thần kinh, cải thiện trí nhớ.
- Cải thiện các chức năng về mạch máu [35]. Tháng 4 năm 2005, Hagen
Schroeter và cộng sự đưa ra rằng, Epicatechin và chất chuyển hoá của nó là
epicatechin-7-O-glucuronide đều có tác dụng lên cải thiện mạch máu tại động mạch
chủ trên thỏ. Và cũng chứng minh được rằng thực phẩm giàu flavanol (Epicatechin)
phát huy lợi ích trên sức kh
ỏe tim mạch làm giảm rối loạn chức năng nội mô, là một
nguy cơ quan trọng liên quan trong tiên lượng xơ vữa động mạch [35].
1.4.1.3. Catechin

• Nguồn gốc
Là đồng phân quang học của Epicatechin. Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền
cũng đã phân lập được catechin từ vỏ thân cây Gạo [12].
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (2R, 3S)-2-(3, 4-dihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-1H-
chromene-3, 5, 7-triol
- Công thức phân tử: C
15
H
14
O
6

- Khối lượng phân tử: 290,27 g/mol
- Điểm nóng chảy: 177
o
C
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH
- 9 -

- λ
max1
: 209nm; λ
max2
: 279nm
• Tác dụng dược lý
- Năm 2009, Navindra P. Seeram và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng của
Catechin và Epicatechin trên ức chế COX-1 và COX–2 và đã cho thấy kết quả ức
chế tốt tại nồng độ 80µM và hoạt động ức chế COX tốt nhất trong so sánh với các
thuốc ức chế COX ibuprofen thương mại (tại 10μM), naproxen (tại 10µM ), Vioxx
® (tại 1,67ppm) và Celebrex (tại 1,67ppm). Ở nồng độ 50mM, catechin ức ch
ế các
tế bào vú, hiệu quả chống lại các tế bào ruột kết, các tế bào phổi. Các tế bào thần
kinh trung ương là nhạy cảm nhất trong các dòng tế bào thử nghiệm. Nhìn chung
catechin có tác dụng ức chế sự gia tăng của các dòng tế bào ung thư [36].
- Giảm sự hấp thu Aluminum trong trà tại dạ dày và ruột non [37]. Ngoài
tác dụng ức chế COX và ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư, catechin còn
được chứng minh có thể
sử dụng như là một chất làm giảm lượng Aluminum tích
luỹ trong cơ thể do uống trà xanh, một trong những nguy cơ gây độc đang được
quan tâm tới hiện nay do trà là loại thức uống đang ngày càng phổ biến trên thế
giới. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, catechin và các polyphenol có tác dụng giảm sự
hấp thu Aluminum tại ruột.

1.4.1.4. Daucosterol

• Nguồn gốc:
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự cũng đã phân lập được
Daucosterol từ vỏ thân cây Gạo [12].
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (3R, 4S, 5S, 6R)-2-[[(3S, 8S, 9S, 10R,13R, 14S)-17-[(2R,
5R)-5-ethyl-6-methylheptan-2-yl]-10, 13-dimethyl-2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15,
- 10 -

16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)
oxane-3,4,5-triol
- Công thức phân tử: C
35
H
60
O
6

- Khối lượng phân tử: 576,847 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 284-286°C
- Độ tan: Tan tốt trong MeOH
• Tác dụng dược lý
- Theo [26], tác dụng dược lý được biết tới của daucosterol đó là điều hoà
miễn dịch cơ thể, thông qua làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột qua
đó làm giảm sinh trưởng của tế bào nấm men Candida albicans. Trong nghiên cứu
này, Lee JH và cộng sự tại đại học Dongduk Women đã đưa ra kết quả daucosterol
giúp bảo vệ tế bào chuột bởi nấm men Candida.
1.4.1.5. Stigmasterol

• Nguồn gốc
Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân cây Gạo [13].
Ngoài ra, Stigmasterol còn được tìm thấy trong dầu đậu nành với nồng độ
khoảng 0,54 µg/mL [24] bằng phương pháp HPLC.
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-
methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17-
dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren – 3-ol
- Công thức phân tử: C
29
H
48
O
- Khối lượng phân tử: 412,69 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 160 – 164
o
C
- 11 -

- Độ tan: tan tốt trong MeOH
- λ
max
: 257 nm
• Tác dụng dược lý
- Theo Richard E và cộng sự [25], phytosterols có tác dụng làm giảm
Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), là một trong những chỉ số biểu thị mức độ
cholesterol máu. Một kế quả tương tự cũng được tìm thấy qua nghiên cứu [29] của
Padmanabhan P Nair và cộng sự. Stigmasterol có tác dụng giảm sự hấp thu
Cholesterol vào màu, do đó làm giảm nguy cơ béo phì và nguy cơ ung thu ruột.
- Stigmasterol còn được dùng làm nguyên liệu để tổ

ng hợp progesterol [30].
Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể, progesterol có thể dùng một
mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất
thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do
AIDS. Do đó, việc tổng hợp ra Progesterol mang tính thực tiễn rất cao.
- Nguyên liệu để tổng hợp cortison [27]. Cortison cũng là một hormon có
tác dụng giảm đau, dùng trong các bệnh lý mi
ễn dịch. Cùng với việc tổng hợp ra
Progesterol, tổng hợp cortison từ Stigmasterol cũng có rất nhiều ứng dụng trong
thực tế.
1.4.1.6. Friedelin

• Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được từ vỏ thân cây
Gạo, ngoài ra friedelin còn được tìm thấy trong lá cây Azima tetracantha L. [22].


- 12 -

• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (4R, 4aS, 6aS, 6bR, 8aR, 12aR, 12bS, 14aS, 14bS) - 4, 4a, 6b,
8a, 11, 11, 12b, 14a-octamethylicosahydropicen-3(2H)-one
- Công thức phân tử: C
30
H
50
O
- Khối lượng phân tử: 426,72g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 262-265
o

C
- Độ tan: Tan tốt trong MeOH, benzen, ether
- λ
max
: 287nm
• Tác dụng dược lý
Tháng 8/2011, Paulrayer Antonisamy và cộng sự đã chỉ ra rằng friedelin ức
chế tính thấm acid acetic qua thành mạch tại chuột. Friedelin có tác dụng giảm đau
đáng kể (P<0,05) trong các phản ứng co thắt bụng gây ra bởi acid acetic và formalin
gây ra phản ứng chân liếm. Điều trị bằng friedelin cho thấy (P<0,05) có ý nghĩa về
việc giảm sốt ở chuột. Kết quả cho thấy friedelin sở hữu hoạt độ
ng chống viêm,
giảm đau và hạ sốt mạnh [22].
1.5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.5.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và
pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên. Các
chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi
và bộ phận xử lý số liệu thành sắc ký đồ với các thông tin về pic của chất phân tích.
Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic
riêng biệt được tách ra trên sắc đồ.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắ
c ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó sắc ký lỏng phân bố được
sử dụng rộng rãi nhất hiện nay.
- 13 -

1.5.2. Các thông số đặc trưng [1]
 Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố K của chất phân tích đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất
đó qua pha tĩnh và được xác định bằng:
K =

: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh.
: Nồng độ chất tan trong pha động
Nếu
= thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi
nhau.
càng nhiều thì khả năng tách hai chất A và B trong quá trình sắc ký
càng lớn.
 Thời gian lưu
(phút)
Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của
pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất). So sánh thời gian lưu của mẫu thử và
mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó.

K
’
: Hệ số dung lượng
Trong một phép phân tích, nếu
nhỏ quá thì sự tách kém, còn quá lớn
(
>20 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài
 Hệ số dung lượng K
’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong

hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng:

Trong đó
và là lượng chất tan A phân bố trong pha tĩnh và
trong pha động.


- 14 -

 Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất
định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H,
lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân
bằng nhiệt động học được thiết lậ
p giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha
tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:
N = 16
hoặc N = 5,54
Trong đó:
: thời gian lưu (phút).
W: chiều rộng của pic đo ở đấy pic.

: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều cao của đỉnh.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là phù hợp, tối thiểu là 1000.
 Độ phân giải

Là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký đã cho. Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo công thức sau:

= hoặc =
Trong đó:
, : thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút).
, : độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút).
, : độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút).
Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì độ phân giải tối thiểu để 2 pic
có độ lớn bằng nhau tách ra khỏi nhau là R=1,0.
 Hệ số bất đối
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức:
AF =


- 15 -


Trong đó:
: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía
trước của pic ở 1/20 chiều cao pic.
Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9
AF 2.
 Hệ số chọn lọc

Hệ số chọn lọc
đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B

Theo qui ước:
< nên < 1.
Thường chọn 1,05
2. Nếu quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.

1.5.3. Hệ thống máy HPLC [1]









Hình 1.1. Hệ thống máy HPLC
Máy HPLC gồm các bộ phận sau:
- Bình đựng dung môi và hệ thống xử lý dung môi (Solvent Reservoir and
inlet Filters)
- Bơm cao áp, đẩy pha động qua cột sắc ký (Pump)
- Bộ phận tiêm mẫu (Injector)