Phân lập tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG

PHÂN LẬP TETRODOTOXIN TỪ
PHỦ TẠNG CÁ NÓC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ







HÀ NỘI-2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG

PHÂN LẬP TETRODOTOXIN TỪ
PHỦ TẠNG CÁ NÓC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:
1. TS. Đào Thị Thanh Hiền
2. ThS. Phùng Minh Dũng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược cổ truyền
2. Công ty CPDP Mediplantex
3. Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương


HÀ NỘI-2014



LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS.Đào Thị Thanh Hiền giảng viên bộ
môn Dược học cổ truyền, ThS.Phùng Minh Dũng tổng giám đốc công ty cổ phần
dược phẩm Mediplantex đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi để
tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn TS.Trần Việt Hùng phó giám đốc Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung Ương, thầy giáo TS.Bùi Hồng Cường và các thầy cô trong bộ
môn Dược học cổ truyền, DS.Dương Minh Tân và các anh chị trong Viện kiểm
nghiệm đã góp ý, tận tình giúp đỡ mọi mặt để tôi hoàn thành khóa luận này.
Xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè những người thường xuyên
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để tôi đạt được kết
quả như ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn!


Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Phương Dung







LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. CÁ NÓC 2
1.1.1. Vị trí, phân loại 2
1.1.2. Đặc trưng hình thái 3
1.1.3. Tập tính sống- phân bố 3
1.1.4. Thành phần độc tố 4
1.1.5. Độc tính 5

1.2. TETRODOTOXIN 6
1.2.1. Tính chất, cấu trúc 7
1.2.2. Tác dụng dược lý- độc tính 9
1.2.3. Ứng dụng điều trị của TTX 11
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TTX 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 14
2.1.1. Nguyên liệu 14
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất: 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15
2.2.1 Chiết xuất độc tố toàn phần 15
2.2.2. Phân lập TTX 15
2.2.3. Định tính TTX 15
2.2.4. Định lượng TTX 15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.3.1. Phương pháp chiết xuất 15

2.3.2. Phương pháp phân lập TTX 17
2.3.3. Định tính TTX 19
2.3.4 Định lượng TTX bằng phương pháp LC-MS/MS 20
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 22
3.1.1. Chiết xuất 22
3.1.2 Phân lập: 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 36

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu, chữ viết tắt
Nội dung
CE
Collision energy-năng lượng bắn phá
dc-
Decarbamoyl-
Dd
Dung dịch
ESI
Electron spray ionization-ion hóa tia điện
GTX
Gonyautoxin
HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS
Sắc kí lỏng khối phổ
MLD

Mean lethal dose-liều gây chết trung bình
NMR
Nuclear Magnetic Resonance-cộng hưởng từ hạt
nhân
PL
Phụ lục
PSP
Paralytic Shellfish Poisoning-độc tố gây liệt
TTX
Tetrodotoxin
STX
Saxitoxin
SRM
Select reaction monitoring


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả chiết xuất 25
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết 26
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát pH 27
Bảng 3.4: Kết quả phân lập 30
Bảng 3.5: Kết quả định lượng 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Các họ cá nóc trong bộ cá nóc Tetraodontiformes 3
Hình 1.2: Công thức TTX và các analog (TTXs) 5
Hình 1.3: Công thức của nhóm chất độc PSP (saxitoxin và các dẫn xuất) 5
Hình 1.4: Cấu trúc phân tử TTX (A) cấu trúc phẳng, (B) cấu trúc 3-D 7
Hình 1.5: Cơ chế sự epime hóa nhóm OH-C4 của TTX 9
Hình 1.6: TTX chẹn kênh vận chuyển natri làm tê liệt thần kinh 10
Hình 2.1:Sơ đồ chiết xuất TTX từ phủ tạng cá nóc 16
Hình 2.2: Sơ đồ phân lập theo phương pháp của Maoquing Zhou 18
Hình 3.1: (A) dịch chiết qua giấy lọc 5µm, (B) dịch chiết qua giấy lọc
0,45µm 24
Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng (Rf=0,2) 24
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến kết quả
chiết xuất 26
Hình 3.4: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của pH chạy cột đến kết quả chiết xuất 27

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có vùng tài nguyên
biển dồi dào và tiềm năng khai thác biển rất lớn. Trong những năm gần đây, công tác
điều tra nguồn lợi biển đã được đẩy mạnh nhằm đánh giá hiện trạng nguồn lợi hải sản
và xu hướng biến động của chúng, cá nóc cũng là một trong những đối tượng được
quan tâm nghiên cứu [2].
Cá nóc được coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xương sống, chỉ đứng
sau cóc độc vàng. Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ yếu
trong số này là tetrodotoxin thuộc nhóm độc tố thần kinh cực kỳ nguy hiểm, có tính
bền nhiệt lớn và khả năng gây tử vong cao [10]. TTX có triển vọng thay thế morphin
để giảm đau trong ung thư và cai nghiện [3], [13] nhưng TTX có hàm lượng rất thấp
trong cá nóc. Có vài nghiên cứu về chiết xuất TTX nhưng không được công bố hoặc
công bố không đầy đủ [4], [6], [20], [21].
Với mục đích nghiên cứu TTX trong cá nóc, tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập
tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc” được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm.
Mục tiêu của đề tài:
1. Nghiên cứu chiết xuất độc tố toàn phần từ phủ tạng cá nóc ở quy mô phòng
thí nghiệm
2. Nghiên cứu phân lập tetrodotoxin từ độc tố toàn phần ở quy mô phòng thí
nghiệm.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. CÁ NÓC
1.1.1. Vị trí, phân loại [10]
Phân ngành có sọ Craniata
Lớp cá xương Osteichthyes

Phân lớp cá vây tia Actinopterygii
Liên bộ cá vược Percomorpha
Bộ cá nóc Tetraodontiformes
+ Phân bộ cá nóc hòm Ostracioidei
1. Họ cá nóc hòm Ostraciidae
Họ phụ cá nóc hòm lục lăng Aracaninae
Họ phụ cá nóc hòm Ostraciinae
+ Phân bộ cá nóc Tetraodontoidei
2. Họ cá nóc ba răng Triodontidae
3. Họ cá nóc Tetraodontidae
Họ phụ cá nóc dẹt Canthigasterinae
Họ phụ cá nóc tròn Tetraodontinae
4. Họ cá nóc nhím Diodontidae
Về tổng thể, bộ Tetraodontiformes chứa 10 họ còn sinh tồn với khoảng 430 loài và
khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [15]. Kết quả nghiên cứu năm 2013 của Betancur-R và
cộng sự cho rằng bộ Cá nóc có quan hệ họ hàng gần với nhánh chứa bộ Lophiiformes
và họ Caproidae [17]. Người ta cũng ước tính rằng bộ này là hậu duệ của các loài
sinh sống ven san hô, đã xuất hiện khoảng 95 triệu năm trước [15].
3

1.1.2. Đặc trưng hình thái [10]

Hình 1.1: Các họ cá nóc trong bộ cá nóc Tetraodontiformes
Đặc điểm quan trọng để nhận biết và phân biệt với các loài cá khác là cá nóc
không có vây bụng và các vây đều không có gai cứng. Vây lưng và vây hậu môn nằm
đối diện hoặc gần đối diện với nhau và chúng nằm cách xa vây ngực, gần với vây
đuôi. Vây đuôi thường tròn hoặc bằng hoặc lõm nông (trừ cá nóc ba răng có vây đuôi
chẻ sâu). Cá nóc không có khe mang, mang chỉ còn là lỗ mang và ngay sau lỗ mang
là gốc vây ngực. Thân cá nóc không có vảy. Cá nóc nhím có gai sắc nhọn như lông
nhím. Cá nóc hòm có lớp giáp cứng liên kết với nhau thành hình hộp bao quanh cơ

thể. Miệng cá nóc bé nhưng răng khoẻ; xương hàm và xương gần hàm gắn liền với
nhau thành mỏ cứng thích nghi với các loài thức ăn có vỏ cứng. Cá nóc không có
xương sườn và các xương dăm ở phần thịt. Dạ dày cá có thể co dãn và ở nhiều loài
cá nóc có thể hút được nhiều nước hoặc không khí để làm phồng tròn bụng lên như
quả bóng.
1.1.3. Tập tính sống- phân bố [10]
Cá nóc phân bố khá rộng cả về không gian và khía cạnh sinh thái. Một số loài
ưa sống đáy, trong khi số khác sống ở các rạn san hô có độ sâu từ vài chục mét đến
hàng trăm mét hay các vùng nước ven bờ, đầm lầy, cửa sông; thậm chí một số ít loài
còn sống ở nước ngọt, sông suối, hồ Cá nóc là loài ăn tạp, sống đơn lẻ hoặc theo
đàn và thường không di cư.
4

Trên thế giới có khoảng 246 loài cá nóc, bao gồm cả cá nóc nước mặn và nước
ngọt, chúng sống ở các khu vực biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới của Thái Bình
Dương, ấn Độ Dương và Đại Tây Dương. Việt Nam có khoảng 67 loài cá nóc thuộc
bốn họ nói trên. Chúng phân bố khá rộng và được bắt gặp gần như ở toàn vùng biển
Việt Nam .
1.1.4. Thành phần độc tố
Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ yếu là TTX,
(chiếm tới 70% - 80% khối lượng chiết). Ba analog chính khác là acid tetrodonic, 4-
epi TTX và 4-epi anhydrotetrodotoxin. So với TTX, ba chất này không khác nhiều
về đặc tính hóa học, nhưng khác nhau đáng kể về đặc tính sinh học (độc tố tính) [20].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hoàng (Viện Nghiên Cứu Hải Sản) trên 5
loài cá nóc (Takifugu oblongus, Arothron stellatus, Arothron hispidus, Torquigener
brevipinnis, Lagocephalus sceleratus) được thu thập ở các tỉnh ven biển Việt Nam
năm 2005 – 2006: thành phần độc tố cá nóc là hỗn hợp nhiều độc tố. Trong đó, nhóm
độc tố TTXs (TTX và các dẫn xuất 4,9-anhydro TTX, 4-epi TTX) là thành phần
chính, chiếm tỷ lệ 97,47%. Các độc tố thuộc nhóm chất độc thần kinh PSP là saxitoxin
và các dẫn xuất của nó (neoSTX, dcSTX, GTX6 và GTX5) chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ,

khoảng 2,53% [5].
Theo nghiên cứu của Chih-Yu Chen và Hong-Nong Chou (1998) định lượng
TTX và các dẫn chất của nó trong hai loài cá nóc Diodon holocanthus và Takifugu
rubripes rubripes ở hòn đảo phía bắc Đài Loan được kết quả TTX chiếm 77%, 4-epi-
TTX 11%, còn lại anhydro-TTX 12% [12].
Năm 2011, Xiao-Wu Chen và cộng sự xác định công thức của TTX và 10
analog của TTX và định lượng TTX (92,54%) và 4 analog: 5,6,11 trideoxy TTX
(2,81%,), 11-nor TTX-6(R/S)-ol (0,412%), 4,9-anhydroTTX (1,32%) và 5-
deoxyTTX (2,92%) có trong dịch chiết cá nóc [28].


5



Hình 1.2: Công thức TTX và các analog (TTXs)


Hình 1.3: Công thức của nhóm chất độc PSP (saxitoxin và các dẫn xuất)
1.1.5. Độc tính
Cá nóc được coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xương sống, chỉ
đứng sau cóc độc vàng. Độc tố trong cá nóc có thành phần chủ yếu là TTX, thuộc
nhóm độc tố thần kinh cực kỳ nguy hiểm, có tính bền nhiệt lớn và khả năng gây tử
vong cao [3]. Tuy nhiên, không phải loài cá nóc nào cũng độc. Độc tố trong các loài
6

cá nóc khác nhau thì khác nhau. Hàm lượng độc tố trong cơ thể còn thay đổi theo
mùa, vùng địa lý và giai đoạn phát triển của cá thể [10].
Các bộ phận khác nhau của cá nóc có độc tính với mức độ rất khác nhau. Mức
độ độc của đa số các loài có thể được sắp xếp theo trật từ giảm dần của độ mạnh như

sau: trứng, tinh hoàn, gan, ruột, da, thịt [7], [8].
Theo giai đoạn trưởng thành và thuần thục sinh dục, cá nóc có độc tính cao ở
giai đoạn 5 đối với cá đực và giai đoạn 6 đối với cá cái. Độc tính của cá nóc thường
tăng cao vào các tháng 2-3 và 7-9 trong năm, đây cũng là mùa sinh sản của cá nóc
[7].
Tại Việt Nam, người ta đã tiến hành phân tích độc tố của 35 loài [7], [8], trong đó:
̶ 10 loài có độc tính rất mạnh
̶ 7 loài có độc tính mạnh
̶ 4 loài có độc tính nhẹ
̶ Có 14 loài chưa phát hiện thấy độc tố
1.2. TETRODOTOXIN
TTX là chất độc chính trong độc tố cá nóc, được phát hiện ở Nhật Bản năm
1909 [13], là một độc tố thần kinh cực mạnh cho tới nay không có chất giải độc, được
đặt tên theo loài cá nóc đầu tiên phát hiện thấy có chứa độc tố này [18].
Độc tố tetrodotoxin được tìm thấy nhiều nhất ở các loài thuộc họ
Tetraodontidae. Ngoài ra TTX còn chứa ở những loài sinh vật biển khác nhau như
bạch tuộc tua xanh Australian (Hapooloclaena maculosa); cá mỏ vẹt, cá thần tiên
(Ostracion spp), cá mặt tròn đại dương,…, một số loài ghẹ như ghẹ Philippin, ghẹ
mắt đỏ (Eriphia spp, Carcinoscorpius rotudicauda…), một số loai ốc sên biển, hai
loài ếch độc (Harlequin). Cá nóc vẫn là nguyên liệu chính để tách chiết và nghiên
cứu về TTX (Mosher, 1986) [8].

7

1.2.1. Tính chất, cấu trúc
1.2.1.1 Đặc điểm, tính chất:
- Tên IUPAC: (4 R ,4a R ,5 R ,6 S ,7 S ,8 S ,8a R ,10 S ,12 S )-2-azaniumylidene-
4,6,8,12-tetrahydroxy-6-(hydroxymethyl)-2,3,4,4a,5,6,7,8-octahydro-1 H -
8a,10-methano-5,7-(epoxymethanooxy)quinazolin-10-olate
- Công thức phân tử: C

12
H
17
N
3
O
8

- Phân tử lượng: 319,27 g/mol
- TTX tinh khiết là bột tinh thể không màu, không mùi, sẫm màu ở khoảng 220
0
C
nhưng không phân hủy [13].
- Nhiệt độ nóng chảy 225
0
C [14].



(A) (B)
Hình 1.4: Cấu trúc phân tử TTX (A) cấu trúc phẳng, (B) cấu trúc 3-D
- Cấu trúc liên quan đến tính chất :
+ Độ tan: trong phân tử TTX có một vài nhóm hydroxyl thân nước, khiến nó
không tan trong các dung môi hữu cơ. Khung phân tử của TTX tương tự như cấu
trúc lồng của đá, khiến rất khó hydrat hóa, do vậy nó ít tan trong nước. Do trong
phân tử có nhóm guanidin perhydroquinazolin (guanidin có tính kiềm mạnh), nên
TTX tan trong dung dịch acid. TTX cũng có cấu trúc nội este, nên dễ bị các dung
dịch acid mạnh phân hủy, do đó cách duy nhất giữ TTX bền vững trong dung
dịch là hòa tan trong acid hữu cơ yếu [11], [19].
8

+ pKa (H
2
O) = 8,76; pKa (50% alcol) = 9,4 [24]
+ Chất phân cực mạnh [18].
1.2.1.2. Cấu trúc TTX và các analog [20]
Đặc tính C-4 có thể dễ dàng nhìn thấy từ cấu trúc phân tử của TTX. C-4 là vị trí
ortho của nguyên tử nitơ với nhóm OH ở vị trí xích đạo và nguyên tử H ở vị trí trục.
Bởi vậy, các hoạt tính hóa học và sinh học của nhóm hydroxyl ở C-4 là rất đáng kể.
Nếu H
+
có mặt trong dung dịch, nguyên tử ôxy từ nhóm hydroxyl của C-4 sẽ kết hợp
với nó, tạo ra cấu trúc B hóa trị dương từ cấu trúc A. Cấu trúc B mất phân tử H
2
O tạo
thành cấu trúc C với C-4 hóa trị dương.
Cấu trúc C có thể tương tác với H
2
O trong dung dịch. H
2
O có thể tấn công vị trí
nơi phân tử H
2
O gốc bị loại bỏ và tạo thành cấu trúc E, hoặc tấn công vị trí đối diện
nơi phân tử H
2
O gốc bị loại bỏ và tạo thành cấu trúc D. Nếu phân tử H
2
O bị loại khỏi
cấu trúc E, cấu trúc A gốc của TTX được tạo thành. Cấu trúc D chuyển thành cấu trúc

F sau khi H
2
O bị loại bỏ. Sự khác nhau giữa cấu trúc F và cấu trúc A là vị trí của H
và OH hoán đổi cho nhau. H trong C-4 của cấu trúc A là trục và OH là xích đạo, trong
khi đó ở cấu trúc F nguyên tử H trong C-4 là xích đạo và OH là trục.
TTX cấu trúc A được gọi “tetrodotoxin”, là nồng độ chủ yếu của TTX thu được
từ cá nóc tự nhiên. TTX cấu trúc F thường được gọi “4-epi tetrodotoxin”. Do nhóm
hydroxyl ở C-4 gần với nhóm hydroxyl ở C-9 trong 4-epi tyetrodotoxin, phân tử H
2
O
dễ dàng bị loại bởi tương tác với H
+
, tạo ra một analog của TTX chứa liên kết ether,
được gọi là “4-epi anhydrotetrodotoxin”. Các đặc tính hóa học của ba phân tử
“tetrodotoxin” này khác nhau không đáng kể. Nhưng chúng khác nhau đáng kể về
hoạt tính sinh học. Ví dụ, độc tố của TTX là 4500 đơn vị chuột/mg; của 4-epi TTX là
710 đơn vị chuột/mg và của 4-epi anhydrotetrodoxin chỉ là 92 đơn vị chuột/mg.
Sự quan trọng của nhóm hydroxyl C-4 còn thể hiện ở chỗ: độc tính của nó giảm
đáng kể khi nó được thay thể bằng những nhóm khác, như H, CH
3
hay CH
3
CO Do
đó, về lý thuyết, cần giữ nhóm hydroxyl trong C-4 ở vị trí xích đạo trong quá trình
chiết TTX. Bởi vậy, điều quan trọng là lựa chọn đúng các vật liệu và thiết bị chiết,
pH và nhiệt độ của dung dịch, thời gian chiết
9

Hình 1.5: Cơ chế sự epime hóa nhóm OH-C4 của TTX
1.2.2. Tác dụng dược lý- độc tính
1.2.2.1. Cơ chế [9]
TTX là chất độc thần kinh rất đặc hiệu, bao vây đặc hiệu cổng tích điện của các
kênh Natri nằm trên bề mặt của màng tế bào thần kinh.
- Cấu trúc phân tử với nhóm Guanidin tích điện dương và vòng Pyrimidin tạo ra sự
tăng cường hợp nhất các hệ thống vòng kết hợp với 5 nhóm hydroxyl làm tăng tính
bền vững của phức hệ liên kết gữa TTX với kênh Natri tại phần ưa nước. Sự liên
kết của TTX với kênh Natri rất nhạy (Kd = 10 –10nM). TTX có tác dụng rất giống
tác dụng của hydrat Natri, khi xâm nhập vào miệng kênh liền liên kết với nhóm
peptit glutamat, sau đó thắt chặt vòng lại khi peptit thay đổi cấu hình không gian
của nửa phần liên kết. Do vậy phức hệ nhận dạng thay đổi
- TTX tấn công vào các điện tích có tác dụng mở cổng của kênh Na+ (hậu quả thứ
hai xảy ra trong cơ thể khi dehydrat phức hệ nước-Na+). Sự bám chặt của
tetrodotoxin cá nóc làm bao vây sự truyền dẫn xung thần kinh tại phức hệ Na+-
kênh được giải thích rõ ràng hơn bởi thời gian chiếm giữ lâu của TTX so với
hydrat- Na+ ở trong phức hệ. Hydrat natri có thể đảo ngược liên kết trong thời gian
1nanogiây, trong khi TTX liên kết với kênh và tồn tại trong thời gian được tính
10

bằng lũy thừa 10 của giây là một khoảng thời gian vô cùng lớn, bởi vì 1 giờ chỉ
bằng 3600 giây.

Hình 1.6: TTX chẹn kênh vận chuyển natri làm tê liệt thần kinh
- Với lượng lớn các phân tử TTX này đã không cho natri có cơ hội xâm nhập vào
kênh, sự di chuyển natri bị bao vây với hiệu lực cao và điện thế hoạt động dọc theo
màng thần kinh bị dừng lại. Một miligram TTX hoặc ít hơn (một lượng nhỏ như
đầu kim), cũng đủ giết chết một người trưởng thành.
1.2.2.2. Tác dụng-độc tính
TTX tác dụng cả lên hệ thần kinh trung ương lẫn thần kinh ngoại vi, với các biểu

hiện sau [1], [18]:
- Tim mạch: Mạch nhanh, huyết áp hạ, rối loạn nhịp tim.
- Hô hấp: Khó thở, do liệt cơ hô hấp, da và niêm mạc xanh tím.
- Thần kinh:
+ Thần kinh trung ương: Choáng váng, đau đầu, co giật. Không có rối loạn ý
thức.
+ Thần kinh ngoại vi: Liệt đa dây thần kinh, rối loạn cảm giác (dị cảm) ở lưỡi,
môi, mặt, ngón tay, ngón chân, rối loạn lời nói, khó nuốt.
+ Thần kinh cơ vân và cơ trơn: Liệt, rung giật các cơ, cử động hỗn độn, yếu cơ
và liệt chi dưới, liệt vận động nhãn cầu, đặc biệt nguy hiểm là liệt cơ liên sườn,
cơ ngực và cơ hoành.
+ Mất phản xạ tủy và phản xạ gân xương.
11

Ngoài ra, TTX còn gây độc với gan, tiết niệu, nội tiết và hệ sinh sản, da và vận
mạch (ra nhiều mồ hôi., mắt, mũi, họng, tai, tăng tiết nước bọt, rối loạn vị giác, bạch
cầu tăng, miễn dịch, rối loạn chuyển hoá nước và điện giải, dị ứng và các rối loạn
khác…
Tính độc của TTX gấp 10 đến 100 lần so với liều gây chết của nhện độc và gấp
10000 lần so với cyanid [13].
1.2.3. Ứng dụng điều trị của TTX [4]
Thứ nhất, TTX có tác dụng kích thích hoạt động của hệ tuần hoàn, làm thay
đổi nhịp tim, thay đổi trương lực cơ của thành mạch, dẫn đến sự thay đổi của huyết
áp. Sử dụng TTX với liều lượng 1,3.10
-3
mg/kg trong việc phòng ngừa có hiệu quả
các trạng thái xơ cứng động mạch và bào chế các loại thuốc đặc trị chữa bệnh huyết
áp, rối loạn nhịp tim.
Thứ hai, TTX làm giảm tính thấm của mang tế bào đối với việc vận chuyển
ion Na

+
mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển ion K
+
, trong khi đó các thuốc
gây tê khác lại có tác dụng đối với cả hai kênh vận chuyển này. Điều này rất có ý
nghĩa trong việc nghiên cứu sinh lí màng tế bào.
Thứ ba, TTX được dùng để điều chế thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật.
Ngoài những tác dụng gây tê giống thuốc: novocain, procain, cocain, TTX có nhiều
ưu điểm hơn ở khả năng gây mê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn nhiều so với thuốc gây
tê khác. Ví dụ: để kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải cần đến nồng
độ 500mg, trong khi đó TTX chỉ cần 0,03mg (hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp
60.000 lần cocain).
Thứ tư, TTX còn được dùng như thuốc giảm đau, khi sử dụng TTX với liều
lượng rất nhỏ có khả năng cắt cơn đau của bệnh nhân ung thư gan giai đoạn cuối.
Công ty International Wex Technologies (Canada) đã sử dụng TTX để chế ra tectin
(thuốc giảm đau), Tocudin (thuốc gây tê), và Tetrodin (thuốc cai nghiện ma túy)-một
vài thuốc giúp bệnh nhân ung thư vượt qua được những cơn đau hoặc giúp con nghiện
heroin cắt cơn. Các thử nghiệm ban đầu khi sử dụng thuốc cho kết quả khả quan.
Theo các chuyên gia, các thuốc này có thể ngăn chặn tế bào thần kinh chuyển tín hiệu
12

đau đến não, chúng khác với các thuốc giảm đau khác ở chỗ nó không gây ra tác dụng
phụ như morphin, không xung đột với các loại thuốc khác và cũng không gây nghiện.
Việt Nam cũng đã nghiên cứu thành công biệt dược Thiên Thanh Hoàn có chứa tối
đa 0,1mg TTX và một số vị thuốc Đông y khác.
Thứ năm, nghiên cứu của Lesort cho thấy TTX có khả năng liên kết với protein
của HIV, đặc biệt là gp-120, do đó làm cho genom của HIV không thể gắn vào genom
của người. Vì vậy, HIV không thể phát triển thành AIDS được. Đây là tín hiệu đáng
mừng cho quá trình đi tìm thuốc điều trị căn bệnh thế kỉ HIV-AIDS.
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TTX

Thế giới:
- Năm 1964 tác giả Goto Toshio cùng cộng sự đưa ra phương pháp chiết xuất
phân lập và tinh chế TTX như sau: từ 100 kg trứng cá nóc chiết bằng nước, phân
lập bằng cách cho qua cột trao đổi ion Amberlite IRC-60, than hoạt tính và kết
tinh trong dung dịch amoniac cho 1-2 gam độc tố thô [27].
- Năm 2003 Maoquing Zhou và cộng sự tiến hành chiết xuất, phân lập TTX như
sau: từ 20kg trứng cá nóc chiết bằng acid acetic, đun nóng, làm lạnh, lọc; tách
TTX bằng sử dụng cột trao đổi ion chứa nhựa D-152, diatomaceous silica-than
hoạt, cô đặc và kết tinh thu được 1,2g độc tố toàn phần có chứa TTX [20]. Độc
tố TTX tiếp tục được làm tinh khiết bằng cách tinh chế nhiều lần [21].
Việt Nam
- Năm 1994, Lê Quang Huấn và cộng sự là nhóm tác giả đầu tiên chiết xuất và
phân lập, tinh chế TTX từ cá nóc của biển miền Trung Việt Nam. Phương pháp
này có sử dụng dung môi hữu cơ chloroform, ether để chiết với quy trình còn
phức tạp, nhiều giai đoạn. Tuy nhiên nhóm tác giả mới chỉ tinh chế được ở dạng
thô, số lượng ít và chưa đánh giá chính xác được độ tinh khiết [6].
- Năm 2007, để sản xuất huyết thanh kháng độc tố TTX, nhóm nghiên cứu của
tác giả Lê Văn Hiệp thuộc Viện Vắcxin và Sinh phẩm y tế Nha trang (IVAC)
đã phân lập được TTX từ phủ tạng cá nóc. Nghiên cứu thu được 19,21mg tinh
thể TTX có độ tinh khiết 80-85%, hiệu suất 35-50%. Tuy nhiên nghiên cứu mới
13

chỉ dừng lại ở quy mô nhỏ phục vụ công việc điều chế huyết thanh kháng TTX
[4].

14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu để chiết xuất-phân lập: phủ tạng các loại cá nóc thu mua ở vùng biển
Nha Trang –Khánh Hòa, Việt Nam
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất:
Thiết bị:
- Máy xay GL-1903
- Bể điều nhiệt BÜCHI 461 water bath
- Máy cất quay Buchi RE111 Rotavapor Evaporator
- Bơm hút chân không model DOA-P504-BN
- Cân phân tích, cân kĩ thuật
- Máy sắc kí lỏng khối phổ Thermo Scientific TSQ quantum Ultra
Dụng cụ:
- Bình định mức 20ml, 50ml
- Bình nón 100ml
- Cốc thủy tinh 100ml, 200ml
- Bộ lọc thủy tinh, phễu Buchner, pipet

- Vải lọc, giấy lọc kích thước 5µm; 0,45µm
- Giấy chỉ thị vạn năng
- Ống mao quản chấm sắc ký 10µL
- Bản silica gel 60 GF
254
Merck, kích thước 5 cm x 20 cm
- Bơm tiêm cho HPLC
- Cột: Alltech Apollo C8 (25 cm x 4,6 mm; 5µm)
- Cột trao đổi ion: cột thủy tinh hình trụ, cao 20cm x đường kính trong 5cm,
chứa nhựa trao đổi ion cation ammoniac acid yếu
Hóa chất:
- Acid acetic khan
- Ammoniac đậm đặc, Amoni acetat
15

- Ethanol, methanol, n-butanol
- Thuốc thử hiện màu Weber 5-({2-[(Iodoacetyl)amino]ethyl}amin)-1-
naphthalenesulfonic axit
- Tetrodotoxin (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, hàm lượng: 99%, SKS: 038K1804
- Nhựa trao đổi ion cation ammoniac acid yếu
- Dung môi pha mẫu: hỗn hợp dd a.acetic 0,1% (tt/tt) và MetOH (20:80)
- Đệm acetat; dung dịch trong nước cất chứa 15mM amoni acetat và 15 mM
a.acetic
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chiết xuất độc tố toàn phần
Tham khảo quy trình chiết xuất của Maoquing Zhou (2003) [20], khảo sát một
số thông số: nồng độ dung môi, điều kiện lọc, pH dịch chạy cột trao đổi ion.
2.2.2. Phân lập TTX
Tham khảo quy trình của Maoquing Zhou (2003) [21]: lựa chọn số lần tinh chế
để thu được TTX đạt yêu cầu (> 80%).

2.2.3. Định tính TTX
Định tính TTX trong dịch chiết bằng sắc kí lớp mỏng
Đinh tính TTX trong tinh thể đã phân lập bằng ESI-MS, LC/MS/MS, NMR
2.2.4. Định lượng TTX
Định lượng TTX trong tinh thể, dịch chiết bằng phương pháp LC/MS/MS
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp chiết xuất
Tham khảo phương pháp chiết xuất của Maoquing Zhou (2003) [20], khảo sát một
số thông số, tìm quy trình chiết xuất phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm:
16


Hình 2.1:Sơ đồ chiết xuất TTX từ phủ tạng cá nóc

Ngâm chiết:
Sử dụng phương pháp ngâm lạnh:
+ Nghiền nhỏ 1kg phủ tạng, sau đó thêm vào 1,5L dung dịch acid acetic 0,1%,
khuấy trộn trong 2 giờ, lọc qua vải xô để thu được dịch ngâm chiêt đầu. Thêm
1,5L nước khử ion vào bã, khuấy trộn và lọc như trên. Quá trình chiết tiến hành
lặp lại 3 lần để chiết kiệt.
+ Gộp các dịch chiết lại, đun nóng dịch chiết ở 80
0
C trong 10 phút, sau đó làm
lạnh, lọc để thu được dịch lọc trong.

17

- Quá trình làm giàu bằng trao đổi ion và tách TTX:
+ Điều chỉnh pH dịch lọc thu được về 7,5 bằng dung dịch ammoniac 10% (tt/tt).
Cho dịch lọc chạy qua cột trao đổi ion với tốc độ 100ml/h.

+ Sau khi toàn bộ dịch lọc đã chạy qua cột trao đổi ion, rửa cột với nước khử ion
cho đến khi không còn protein trong nước rửa
+ Rửa giải cột trao đổi ion bằng dung dịch acid acetic 10% (tt/tt) với tốc độ
50ml/h, để thu dịch TTX.
- Sơ tinh chế qua than hoạt:
+ Gộp dịch TTX thu được ở trên. Điều chỉnh tới pH 8,5 bằng dung dịch amoniac
10% (tt/tt). Lọc qua giấy lọc 0,45µm
+ Duy trì pH 8,5 của dịch rửa giải trong 2 giờ. Trong khoảng thời gian này, cho
dịch rửa giải chạy qua cột silica diatomaceous - than hoạt.
+ Rửa cột silica diatomaceous - than hoạt với nước khử ion, rồi rửa giải bằng
dung dịch acid acetic 0,2% trong ethanol 20% cho đến khi hết TTX (kiểm tra
bằng TLC).
- Cô đặc và kết tinh:
+ Cô đặc dung dịch thu được bằng máy cất quay ở nhiệt độ 100
o
C đến khi còn
khoảng 300ml thì lấy ít để nguội, lấy đem sắc kí lớp mỏng.
+ Cô tiếp cho tới khi còn 10ml thì làm lạnh dịch cô đặc tới 20
0
C, điều chỉnh pH
9,0 bằng dung dịch ammoniac đậm đặc.
+ Cho vào tủ lạnh, để yên cho độc tố kết tinh. Lọc lấy độc tố tinh thể rửa 3 lần,
mỗi lần với 5 ml với nước khử ion. Sấy trong tủ sấy chân không (60
o
C; áp suất
không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd; 2 h) cho đến khối lượng không đổi để
thu được tinh thể độc tố toàn phần chứa TTX
2.3.2. Phương pháp phân lập TTX
Phân lập bằng phương pháp tinh chế nhiều lần [21]
1) Hòa tan độc tố tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt).

2) Điều chỉnh tới pH 9,0 bằng dung dịch amoniac đậm đặc.
3) Cho vào tủ lạnh, để yên cho TTX kết tinh.