Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3,4 thiadiazol

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





ĐỖ THỊ MAI DUNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG
1,3,4-THIADIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ MAI DUNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG
1,3,4-THIADIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
1.PGS.TS. Nguyễn Hải Nam
2.DS. Nguyễn Xuân Phong
Nơi thực hiện :
1. Bộ môn Hóa Dược


HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với
những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám
ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, DS. Nguyễn Xuân Phong - Bộ môn
Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn
và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại
học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa
Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè
đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Đỗ Thị Mai Dung







MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2
1.1.2. Phân loại các HDAC 3
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 4
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 8
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 9
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 9
1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 10
1.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC 13

1.4.1. Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 13
1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 14
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 15
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15
2.1.1. Hóa chất 15
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 15
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16


2.2.1. Tổng hợp hóa học 16
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 16
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.3.1. Tổng hợp hóa học 16
2.3.2. Thử tác dụng sinh học 17
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. HÓA HỌC 20
3.1.1. Nghiên cứu Docking 20
3.1.2. Tổng hợp hóa học 21
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết 34
3.1.4. Xác định cấu trúc 34
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40
3.2.1. Thử hoạt tính sinh học 40
3.2.2. Đánh giá mức độ giống thuốc 40
3.3. BÀN LUẬN 41
3.3.1. Tổng hợp hóa học 41
3.3.2. Tác dụng sinh học 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC










DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALL :

Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính
AML :

Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính
APL
CDI
CLL
CTCL
:
:
:
:

Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính
Carbonyldiimidazol
Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia)

Tế bào lymphoT dưới da (Cutaneous T cell lymphoma)
13
C-NMR :

Cộng hưởng từ hạt nhân
13
C
DCM :

Dicloromethan
DMF :

Dimethyl formamid
DMSO :

Dimethyl sulfoxid
EtOH :

Ethanol
HAT :

Histon acetyltranferase
HDAC :

Histon deacetylase
1
H-NMR :

Cộng hưởng từ hạt nhân
1

H
IC
50
:

Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa
IR
MTT
:
:

Phương pháp phổ tử ngoại
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
MeOH :

Methanol
MS
NSCLC
:
:

Phổ khối lượng
Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell)
NST :

Nhiễm sắc thể
SAHA :

Acid suberoylanilid hydroxamic
T

0
nc
:

Nhiệt độ nóng chảy
TLC :

Phương pháp sắc ký lớp mỏng
TMS :

Tetramethylsilan
TSA :

Trichostatin A



DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng Trang
1
B
ả
ng 1
.1:
Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm
sàng 8
2
B

ả
ng 1.2:
Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol-
hydroxamic 13
3
B
ả
ng 3.1:
Kết quả docking của các chất
5a
-
f
với HDAC8 20
4
B
ả
ng 3.
2
:
Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid
hydroxamic từ ester 33
5
B
ả
ng 3
.3:
Giá trị R
f
và nhiệt độ nóng chảy của các chất
5a

-
f

34
6
B
ả
ng 3.4:
Kết quả phân tích phổ MS của các chất
4a
-
f

35
7
B
ả
ng 3.5:
Kết quả phân tích phổ IR của các chất
5a
-
f

36
8
B
ả
ng 3.6:
Kết quả phân tích phổ MS của các chất
5a

-
f
37
9
B
ả
ng 3.7:
Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
5a
-
f
37
10
B
ả
ng 3.8:
Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
5a
-
f
39
11
B
ả
ng 3.8:
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất

5a
-
f
theo
quy tắc Lipinsky 40
12
B
ả
ng 3.
1
0:
Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính
kháng tế bào ung thư 42









DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Tên hình Trang
1
Hình 1.1
: Cấu trúc của histon trong nucleosom
2

2
Hình
1.
2
:
Mô tả đặc điểm của các loại HDAC 4
3
Hình
1.
3
:
Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào
ung thư 6
4
Hình
1.
4
:
Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm
sàng 7
5
Hình
1.
5
:
Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của
HDAC 9
6
Hình
1.6:

Cấu trúc của TSA, oxamflatin và các dẫn chất N-
hydroxy-2-propenamid 10
7
Hình
1.7:
Các dẫn chất amid ngược của SAHA 11
8
Hình 1.8: Các dẫn chất

-alkoxy của SAHA
11
9
Hình
1.9:
Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA 11
10
Hình 1
.
1
0:
Các dẫn chất aicd biphenyl-hydroxamic 12
11
Hình
1.11:
Công thức cấu tạo của WR301849
12
12
Hình
3.1:
Mô hình tương tác của 6 dẫn chất

5a
-
f
với HDAC8 21








DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT

Tên sơ đồ Trang
1
Sơ đ
ồ

1.
1
:
Cơ chế xúc tác của CDI 14
2
Sơ đ
ồ

3.1:
Quy trình tổng hợp chung 21

3
Sơ đ
ồ

3
.2:
Quy trình tổng hợp chất
2a

22
4
Sơ đ
ồ

3.3:
Quy trình tổng hợp chất
3a

23
5
Sơ đ
ồ

3.4:
Quy trình tổng hợp chất
4a

24
6
Sơ đ

ồ

3.5:
Quy trình tổng hợp chất
5a

25
7
Sơ đ
ồ

3.6:
Quy trình tổng hợp chất
5b

26
8
Sơ đ
ồ

3.7:
Quy trình tổng hợp chất
3b

27




1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza
®
,
2006) là chất ức chế histon
deacetylase đầu tiên được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê
duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T. Sau đó, năm 2009 depsipeptid
(Romidepsin
®
) một chất ức chế HDAC khác cũng được cấp phép trong điều trị ung
thư tại Mỹ. Như vậy có thể thấy, HDAC là một mục tiêu phân tử quan trọng trong
điều trị ung thư và các chất ức chế HDAC là các tác nhân chống ung thư đầy triển
vọng.
Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết
kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính
kháng tế bào ung thư tốt [40,41]. Các nghiên cứu gần đây tại bộ môn về các acid
hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy có thế thay thế nhóm nhận diện bề
mặt của SAHA là nhân phenyl bằng vòng thơm khác như benzothiazol cho hoạt tính
in vitro rất khả quan [3]. Tiếp theo đó, trong luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Ánh Tuyết
[4] khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đã được sử dụng làm nhóm nhận diện bề mặt
thay cho benzothiazol. Tuy nhiên nghiên cứu trên mới chỉ tổng hợp được 5 dẫn
chất, chưa đủ để đánh giá khả năng tương tác của nhóm nhận diện bề mặt mới với
HDAC, cũng như chưa tìm được chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro tốt
để tiến hành các thử nghiệm sâu hơn. Trên cơ sở thay đổi các nhóm thế ở vòng
thơm sẽ làm thay đổi tương tác của chất với mục tiêu phân tử, chúng tôi thiết kế các
nhóm thế mới trên khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol và tiến hành đề tài “Tổng hợp
và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3,4-
thiadiazol” với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp N

1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid và 5
dẫn chất.
2. Thử độc tính tế bào và tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được.



2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
Tất cả bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp
đại phân tử protein-ADN. Nhiễm sắc thể có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao
gồm: ADN, các protein histon và protein không phải histon. Đơn vị cấu trúc cơ bản
của NST là nucleosom. Một nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa
của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn
quanh bởi 146 cặp nucleotid [1,48] (hình 1.1):

Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom
Khi đầu amin của histon tích điện dương sẽ tương tác với phần phosphat mang
điện âm trên phân tử ADN làm đóng xoắn NST gây ức chế dịch mã và tổng hợp
protein, làm ức chế sự biển hiện gen. Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu
NST tháo xoắn , quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện
thông qua các tính trạng. Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua
quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon liên quan đến hoạt động của 2
emzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT).
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase

3

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm
acetyl từ -N acetyl lysine amino acid của histon. HDAC có tác dụng đối lập với
histon acetyltransferase (HAT) - enzym xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl
coenzym A đến -amino của lysin ở đầu N của histon [49].
Histons
ngưng tụ các nhiễm sắc thể
ngăn cản phiên mã

Acetyl-histons
kéo giãn các nhiễm sắc thể
kích thích phiên mã
1.1.2. Phân loại các HDAC
Có 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu
trúc của chúng lần lượt với Rpd3, Hdal và Sir2 trong nấm men [22,43] (hình 1.2):
Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8.
Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10.
Nhóm III: Các protein điều hòa chuỗi thông tin bao gồm:
- Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4,
SIRT5, SIRT6, SIRT7).
Nhóm IV: HDAC11.
Các HDAC nhóm I, II, IV được coi là các HDAC “kinh điển” gồm 11 thành
viên, trong khi các thành viên nhóm III được gọi là các sirtuin [22]. Các HDAC
kinh điển và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau. Các HDAC kinh điển là những
enzym phụ thuộc Zn
2+
, chúng có chứa 1 túi xúc tác với 1 ion Zn
2+

ở đáy túi. Do đó
những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo phức với Zn
2+
như các acid
hydroxamic, các thiol… Ngược lại các sirtuin không bị ức chế bởi các hợp chất tạo
chelat với Zn
2+
vì cơ chế hoạt động của chúng phụ thuộc vào NAD
+
như 1 cofactor
thiết yếu [43]. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được sử dụng cho những
hợp chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển và những hợp chất này đang
được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau.
H
A
T
s
H
D
A
C
s

4


Ghi chú: Vùng xúc tác
Vùng tín hiệu nhận diện nhân tế bào
Hình 1.2: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC

HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein không phải histon, làm
tăng sự tích điện dương trên đầu N của histon và đóng xoắn NST, kết quả là ức chế
quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên
ADN. Ngược lại, HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dương trên lysin và giúp
tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các yếu tố sao mã dễ dàng tiếp
cận ADN. Như vậy sự acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai trò quan trọng
trong điều hòa quá trình biểu hiện gen. Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và
HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư
[18,27,30,35,39].

5

HDAC đã được xác định bị rối loạn điều hòa trong ung thư. Sự huy động bất
thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua
tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết
ADN gây ung thư. Ví dụ như receptor α-RAR gắn kết gen PML (promyelocytic
leukemia gen) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch
cầu tiền tủy bào cấp (APL). Trong điều kiện sinh lý, α-RAR là nhân tố sao mã hoạt
hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia
tăng các chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT). Điều này dẫn đến sự acetyl
hóa histon và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào. Trong bệnh bạch cầu tiền tủy
bào cấp (APL), protein gắn kết α-RAR/PML hoặc α-RAR/PLZF giữ HDAC và phối
hợp với phức hợp đồng ức chế. Do đó tăng methyl transferase histon và ADN dẫn
đến ngăn cản sự phiên mã [18,21,27]. Vì vậy, tế bào ung thư không trải qua giai
đoạn biệt hóa và phát triển quá mức. Sự gia tăng bất thường của HDAC còn được
quan sát khi gen đột biến gây ung thư Bcl6 được biểu thị quá mức trong bệnh u
lympho tế bào B [7]. Tương tự, protein gắn kết AML1-ETO tìm thấy trong bệnh
bạch cầu tủy bào cấp (AML) có chức năng như chất ức chế sao mã chủ yếu thông
qua ETO, nên có vai trò như vị trí gắn kết cho phức hợp đồng ức chế N-
Cor/Sin3/HDAC1. Việc chuyển đổi AML1 từ chất hoạt hóa phiên mã thành chất ức

chế được điều khiển bởi protein gắn kết CBFb-SMMHC thông qua sự gia tăng phức
hợp đồng ức chế mSin3A/HDAC. Cuối cùng, biểu thị quá mức nhân tố sao mã
SCL/Tal1 trong bệnh u lympho tế bào T cấp có nguyên nhân là do gia tăng bất
thường HDAC1 nằm trong phức hợp đồng ức chế, dẫn đến ngăn cản gen đích điều
hòa E47/HEB [14]. Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6
còn gặp trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ
dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [23,45,47] cũng như trong các bệnh lý ác
tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T
ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [37]. Hơn nữa,
việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, E2F, Rb, Bcl6, Gli1 liên
quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của

6

HDAC trong ung thư [12,36]. Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể
làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này
liên quan đến quá trình phiên mã của các gen gây ung thư.
Các nghiên cứu có tính thống kê còn chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến
nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu
trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình kể cả sự xâm lấn, sự di
chuyển và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học
của tế bào ung thư được tóm tắt trong hình 1.3 [9,20,28,44].
Như vậy ức phiên mã được điều hòa bởi sự ra tăng HDAC và có thế kiểm soát
ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC. Các chất ức chế HDAC đã và đang
được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức
chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư.


Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

7

Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri butyrat, cho
tới nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra rất nhiều hợp chất mới có tác dụng ức chế
HDAC. Trong đó trichostatin A (TSA), một sản phẩm lên men của Streptomyces, là
chất có tác dụng ức chế mạnh nhất tuy nhiên việc sản xuất nó lại không khả thi [38].
Hiện nay, đã có 2 chất có tác dụng ức chế HDAC được FDA cấp phép lưu hành trên
thị trường để điều trị u lympho tế bào T dưới da là SAHA (vorinostat, Zolinza
®
) và
Romidepsin (Istodax
®
). Ngoài ra, còn khoảng 15 chất ức chế HDAC khác cũng
đang được thử nghiệm tác dụng điều trị ung thư trên lâm sàng ở các giai đoạn khác
nhau (hình 1.4) và được chia làm 4 nhóm dựa theo cấu trúc (bảng 1.1).

Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng
Mỗi nhóm dẫn chất này đều có những hạn chế riêng như: các acid hydroxamic
bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các loại enzym HDAC; các
benzamid và các acid béo có hiệu lực kém; các peptid vòng khó tạo thành về mặt
hóa học. Các nhóm khác nhau có tác dụng ức chế các loại HDAC khác nhau: các
acid hydroxamic ức chế mạnh HDAC nhóm I và II, các acid carboxylic và peptid
vòng ức chế mạnh HDAC nhóm I.

8

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng
Nhóm Hợp chất Pha

Lo
ạ
i ung thư

Acid
carboxylic
Butyrat
AN-9 (tiền thuốc)
Acid valproic

Phenyl butyrat
I, II
I, II
I, II

I
Ung thư đại tràng
Tạng đặc, NSCLC
Tạng đặc, ung thư máu, AML,
MDS, CTCL, u trung biểu mô
Tạng đặc, AML/MDS
Acid
hydroxamic
SAHA
PXD101
NVP-LAQ824
LBH-589
ITF-2357
SB-939
CRA 024781

JNJ-16241199
I, II
II
I
II, III
II
I
I
I
Tạng đặc, ung thư máu
Ung thư máu
Tạng đặc, ung thư máu
Tạng đặc, AML, MDS, ALL
U lympho Hodgkin
Tạng đặc, ung thư máu

Các
benzamid
SNDX-275
CI-994
MGCD-0103
I, II
I, II
II
Tạng đặc, u lympho, AML
Tạng đặc, NSCLC, tế bào thận,tụy
Tạng đặc, ung thư bạch cầu, MDS
Peptid vòng
Depsipeptid
(FK228)

I, II Tạng đặc, CLL, AML, u đa tủy
xương, NHL tế bào T ngoại vi, RAI
kháng thyroid, ung thư đại tràng
tiến triển
Ghi chú: NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML: ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS:
hội chứng loạn sản tủy; CTCL: u lympho da tế bào T; ALL: ung thư bạch cầu cấp; CLL: ung thư
bạch cầu mãn.
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc của các chất ức chế HDAC rất đa dạng nhưng nhìn chung đều gồm 3
phần chính:
- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface
recognition group): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt
enzym.
- Vùng cầu nối sơ nước: thường là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng
hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với kênh
enzym.

9

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): tương tác với ion
Zn
2+
tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm
o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton
Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và
một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống
trong lòng kênh enzym. Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với phần
vành trên bề mặt miệng túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt có thể liên kết với phần
cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần
cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC. Việc nghiên cứu thiết kế cấu

trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này.
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đã được
biết đến nhiều, ví dụ như SAHA (hình 1.5).

Hình 1.5: Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC
Cấu trúc của nhóm chất này cũng gồm 3 phần chính có liên quan đến tác dụng
như sau [38]:
- Nhóm khóa hoạt động: liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế enzym
HDAC, thường là các aryl, các nghiên cứu về các chất tổng hợp được cho thấy kích
thước vòng nhân thơm lớn sẽ cho tác dụng tốt hơn vòng nhỏ.

10

- Cầu nối sơ nước: liên quan đến khả năng ức chế enzym, quyết định sự phù
hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzym. Phần này thường có cấu
trúc amid - alkyl, là các hydrocarbon mạch hở hoặc các vòng thơm có kích thước
nhỏ. Trong cầu nối liên kết amid là quan trọng nhưng không phải là then chốt, độ
dài mạch carbon tối ưu là 5 - 6C.
- Nhóm liên kết với Zn
2+
: acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để có tác
dụng ức chế HDAC.
1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới
1.3.2.1. Thay đổi cầu nối
- Các N-hydroxy-2-propenamid, các acid hydroxamic tương tự TSA
Nhóm các N-hydroxy-2-propenamid (hình 1.6) được thiết kế và tổng hợp dựa
trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc của TSA và oxamflatin (hình 1.6). Các chất này có

tác dụng ức chế HDAC yếu hơn TSA song tương tự oxamflatin [29].

Hình 1.6: Cấu trúc của TSA, oxamflatin và các dẫn chất N-hydroxy-2-propenamid
- Các amid ngược của SAHA
Nhóm nghiên cứu thuộc công ty Topo Target (Anh) đã thiết kế và tổng hợp
gần 40 dẫn chất amid ngược của SAHA (hình 1.7) [6]. Nhiều chất trong số này có
hoạt tính ức chế HDAC tương đương thậm chí mạnh hơn SAHA. Trong đó có 2
chất đã được thử nghiệm mô hình ung thư in vivo trên chuột cho kết quả khả quan,
định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.

11


Hình 1.7: Các dẫn chất amid ngược của SAHA
- Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA
Nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đã
thiết kế và tổng hợp dãy dẫn chất ω-alkoxy của SAHA (hình 1.8) [24]:

Hình 1.8: Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA
Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn xuất ω-
alkoxy của SAHA đều cho giá trị IC
50
ở mức rất thấp (0,05 - 0,5 µM). Độc tính của
các chất với tế bào ung thư thể hiện mạnh hơn so với SAHA trên cả 3 dòng tế bào
NB4 (ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp), H460 (ung thư phổi người), HCT-116
(ung thư đại tràng).
1.3.2.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
- Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA
Viện nghiên cứu Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất
acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí phenyl của SAHA

(hình 1.9). Trong đó có nhiều chất có tác dụng ức chế HDAC tương đương hoặc
mạnh hơn SAHA [19].

Hình 1.9: Các acid phenylthiazol - hydroxamic tương tự SAHA
- Các acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA
Nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski đã thiết kế và tổng hợp một dãy
các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA (hình 1.10) [31]. Kết quả

12

các dẫn chất này ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3,
6, 8, 10). Một số acid biphenyl-hydroxamic cũng có độc tính trên 5 dòng tế bào ung
thư tụy thử nghiệm nhưng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazol-
hydroxamic.

Hình 1.10: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic
- Các acid isoxazol-hydroxamic tương tự SAHA
Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất của acid phenylthiazol-hydroxamic,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã
tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.11) [32].
Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC
50
thấp
đến nồng độ nanomol (0,002 nM).

Hình 1.11: Công thức cấu tạo của WR301849
Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol được
đưa vào vị trí ngay sát nhóm acid hydroxamic đã được thiết kế và tổng hợp. Kết
quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy 4 dẫn chất I-IV ức chế cả 5 loại HDAC1,
2, 3, 6 và 10 với IC

50
trung bình khoảng 150 nM, thấp nhất là 25 nM (bảng 1.2).








13

Bảng 1.2: Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol-hydroxamic

Chất Ar
IC
50
(nM)/HDAC
HDAC1

HDAC2

HDAC3

HDAC6

HDAC10

I

303 430 30 68 254
II

139 164 25 82 250
III

328 469 102 51 471
IV

885 3750 7410 885 #
SAHA 96 282 17 14 72
Ghi chú: # : Không thử hoạt tính
Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy acid hydroxamic là nhóm chất có
khả năng ức chế HDAC tốt, một số chất có tác dụng độc tính với tế bào ung thư ở
nồng độ rất thấp. Tổng hợp các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC đang là một
hướng nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tìm kiếm các hợp chất có
tác dụng kháng tế bào ung thư chọn lọc, có hiệu quả điều trị cao và ít gây tác dụng
không mong muốn.
1.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC
Các chất tổng hợp trong đề tài này đều qua 4 bước phản ứng. Trong đó, có 2
phản ứng quan trọng là phản ứng tạo liên kết amid và phản ứng tổng hợp acid
hydroxamic. Qua tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn các phương pháp tổng
hợp phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm như sau:
1.4.1. Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic
Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa yếu, để acyl hóa amin cần có chất xúc
tác. Các tác nhân hoạt hóa acid carboxylic là imidazolium tỏ ra khá hữu hiệu trong
việc tạo thành liên kết amid, trong đó carbonyldiimidazol (CDI) là chất hay được sử

14

dụng nhất trong nhóm. Victor Andrianov và cộng sự đã dùng CDI để xúc tác phản
ứng tạo amid cho hiệu suất cao [6], phương trình phản ứng tổng quát như sau:
RCOOH + R
1
NH
2
RCONHR
1

Cơ chế xúc tác của CDI được biểu diễn trong sơ đồ 1.1:

Sơ đồ 1.1: Cơ chế xúc tác của CDI
1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Có nhiều cách khác nhau để tổng hợp acid hydroxamic từ ester nhưng hay
dùng nhất là sử dụng KCN hoặc NaOH làm xúc tác. Các phản ứng có phương trình
như sau [5,13,16,24]:

Với điều kiện hóa chất, dung môi tại phòng thí nghiệm và tham khảo tài liệu,
chúng tôi lựa chọn xúc tác NaOH và dung môi MeOH để tiến hành phản ứng này.

15

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:

 Các benzaldehyd:
- Benzaldehyd
- 2,6-Diclorobenzaldehyd
- 4-Bromobenzaldehyd
- 4-Flourobenzaldehyd
- 4-Methylbenzaldehyd
- 4-Dimethylaminobenzaldehyd

Thiosemicarbazid

FeCl
3
.6H
2
O

Acid monomethyl suberic

Carbonyldiimidazol (CDI)
 Hydroxylamin hydroclorid

Các hóa chất và dung môi khác: DMF, aceton, acid acetic băng,
dicloromethan, ethanol, methanol, NaOH, HCl, nước cất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn
hồi lưu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-210.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.
- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm.

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital) để xác định
nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ HP 5989B-MS để ghi phổ MS.
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR.

16

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học
* Nghiên cứu Docking với 6 acid hydroxamic dự kiến tổng hợp.
* Tổng hợp 6 acid hydroxamic:
- N
1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid (5a).
- N
1
-{5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}-N
8
-
hydroxyoctandiamid (5b).
- N
1

-[5-(4-flourophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N
8
-hydroxyoctandiamid (5c).
- N
1
-[5-(4-bromophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N
8
-hydroxyoctandiamid (5d).
- N
1
-hydroxy-N
8
-[5-(4-methylphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (5e).
- N
1
-[5-(2,6-diclorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N
8
-hydroxyoctandiamid
(5f).
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được
- Thử tác dụng ức chế HDAC.
- Thử độc tính trên tế bào ung thư đại tràng (SW620).
- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Nghiên cứu Docking
- Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của các chất với HDAC (docking) được
thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seul, Hàn Quốc.
- Để tìm hiểu sơ bộ tương tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành
docking cho các chất tổng hợp được dựa trên cơ sở mạng lưới của HDAC8 tương

tác với SAHA [26]. Cấu trúc của HDAC8 có điểm tương đồng cao với HDAC4 với
điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-mean-
square deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC
của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian được nghiên cứu kỹ nhất. Chúng
tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chương