Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ LAN ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ LAN ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1.PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2.DS. Trần Thị Thanh Huế
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa Phân Tích
2. Phòng Dược lí – Viện KN thuốc TW





HÀ NỘI – 2013



LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa
Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã
nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn DS. Trần Thị Thanh Huế, người đã giúp
đỡ rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong suốt thời gian tôi thực hiện
khóa luận.

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận
này.
Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Lan Anh









MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1
TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3
1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3
1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3
1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5

1.2
TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 6
1.2.1 Công thức cấu tạo 6
1.2.2 Tính chất lí hóa 6
1.2.5 Chỉ định 7
1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7
1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang 7
1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC 7
1.4
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10
1.4.1 Khái niệm 10
1.4.2 Nguyên tắc 10
1.4.3 Phân loại
10
1.4.4 Các thông số đặc trưng 10
1.4.5 Ứng dụng của HPLC 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1.
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15
2.2.
PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15
2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn 15
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 16
2.3.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 17
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí 17
2.3.3. Đánh giá phương pháp 17
2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 18

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19
3.1
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 19
3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 19
3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu 19
3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu 21
3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 23
3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 24
3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 25
3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu 26
3.1.3 Quy trình phân tích 27
3.2.ĐÁNH
GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29
3.2.1.Độ thích hợp của hệ thống 29
3.2.2 Độ đặc hiệu 30
3.2.3 Độ tuyến tính 32
3.2.4. Độ đúng 34
3.2.5 Khảo sát độ chính xác 36
3.2.5.1 Độ lặp lại 36
3.2.5.2 Độ chính xác trung gian 36
3.2.6.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
38
3.2.6.1.Giới hạn phát hiện 38
3.2.5.2 Giới hạn định lượng 39
3.3.BÀN
LUẬN 39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
4.1.

KẾT LUẬN 42
4.2.
ĐỀ XUẤT 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO











DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN
Acetonitril
BP 2010
The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010)
C
18
Octadecyl
DAD
Diode array derector (derector chuỗi diod)
HPLC
High perform liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu năng cao)
HPLC-MS
High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry (sắc kí
lỏng khối phổ)

MeOH
Methanol
mg
miligram
ml
mililit
PA
Pro analysis (tinh khiết phân tích)
SĐK
Số đăng kí
USP 32
The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34)
UV - VIS
Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp
thụ tử ngoại khả kiến)





DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4
Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài 5

Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 27
Bảng 3.3. Kết quả độ thích hợp của hệ thống 29

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính 33
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng 35
Bảng 3.6. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian 37
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát LOD 38



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin 3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim 6
Hình 2.1 Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 16
Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20
Hình 3.2. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lí mẫu 22
Hình 3.3. Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 25
Hình 3.4. Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 26
Hình 3.5. Mối liên quan giữa thể tích tiêm mẫu và diện tích pic 27
Hình 3.6. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn (a), mẫu trắng (b), mẫu thử
(c) 31

Hình 3.7. Phổ cefixim trong dung dịch thử và trong dung dịch chuẩn 31
Hình 3.8. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 6 cephalosporin
khác 32

Hình 3.9.a. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (ng/ml) và diện tích pic
(mAu.s) của cefixim 33

Hình 3.9.b. Sắc kí đồ khảo sát độ tuyến tính 34

Hình 3.10. Sắc kí đồ sát LOD 39



1
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm
Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Từ đó tới nay
đã có rất nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid,
quinolon, cloramphenicol… được ra đời. Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn
và kháng sinh là thành tựu vĩ đại của y học. Các bác sĩ đã có được những loại thuốc
kì diệu giá rẻ và hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn. Kháng sinh cùng với các biện
pháp vệ sinh, tiêm phòng góp phần gia tăng tuổi thọ của con người trong nhiều năm,
thậm chí nhiều thập kỉ. Mỗi lần phát hiện một loài vi khuẩn kháng thuốc, các phòng
thí nghiệm lại đưa ra một loại thuốc kháng sinh mới[7], [25].
Tuy nhiên theo cảnh báo của WHO, những loại kháng sinh công hiệu nhất
trong điều trị bệnh đang dần bị vô hiệu hóa. Trong cuộc chiến giữa vi khuẩn và con
người, phần thắng đang nghiêng về phía các loại vi khuẩn kháng thuốc. Đây gần
như là dấu chấm hết cho thời kì hoàng kim của thuốc kháng sinh [26]. Từ năm 1987
đã không hề có một loại kháng sinh nào được phát hiện còn vi khuẩn lại vẫn đang
không ngừng biến đổi [25], [26]. Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn là
công việc cấp bách hơn bao giờ hết. Một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn
đến vi khuẩn kháng thuốc là do kháng sinh tồn dư trong nước thải đặc biệt là trong
nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh. Việc loại bỏ không hoàn toàn kháng sinh
trong nước thải tại nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm năng ảnh
hưởng đến sức khỏe con người và tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi
khuẩn kháng thuốc ngay cả ở nồng độ dấu vết [24]. Do vậy hướng nghiên cứu về dư
lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con
người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triển
[24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh trong nước thải và ảnh

hưởng của nó lên động thực vật và sức khỏe con người [19].
Tại Việt Nam vấn đề dư lượng kháng sinh trong nước thải cũng đang được
quan tâm nghiên cứu như định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3].
Công nghiệp dược đang phát triển mạnh với gia tăng số lượng các nhà máy sản xuất



2
dược phẩm cùng với lượng kháng sinh thải ra môi trường ngày càng nhiều. Tuy
nhiên lại chưa có nghiên cứu về dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy sản
xuất dược phẩm.
Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có phổ rộng, có hiệu quả
trên nhiều vi khuẩn đã kháng nhiều loại kháng sinh như cephalosporin thế hệ 1,
cephalosporin thế hệ 2, penicillin,… đặc biệt cefixim dùng theo đường uống – một
đường dùng đơn giản và dễ sử dụng hơn so với nhiều cephalosporin khác. Vì vậy
mà cefixim ngày càng được sử dụng nhiều. Để góp phần kiểm soát dư lượng kháng
sinh, cụ thể là kháng sinh cefixim trong nhà máy sản xuất dược phẩm chúng tôi thực
hiện đề tài:
“ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc
kí lỏng hiệu năng cao”
Với mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp xử lí mẫu và điều kiện phân tích định lượng
cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm.
- Thẩm định phương pháp định lượng cefixim trong mẫu nước này.

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN
1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc
Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân
lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường nuôi cấy
nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và
có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người.
Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này
(nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh
cephalosporin P
1
, cephalosporin C và penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia,
Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.
Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc
khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã
tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam.
Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có
hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp. Vì vậy chúng
nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8].
1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

* Công thức chung của cephalosporin:
S
N
NH
R
1
O
R
2
H
O
OOH
H
H
R
3

Hình 1.1: Công thức chung của cephalosporin
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), mang cấu trúc
3
-cephem,
3
mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam
để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C
(6)
và C
(7)
đều có cấu hình R, và hầu như

là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7].



4
* Phân loại và phổ tác dụng
Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác
dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn,
nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế hệ
cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 [9].
Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin
Tên
nhóm
Tên đại
diện
Phổ tác dụng
Thế hệ I
Cephalexin
Cephalothin
Cephazolin
…
- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn
Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu
kháng methicillin).
- Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram
(-) như
E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus
mirabilis và Shigella.
Thế hệ II
Cephaclor

Cephuroxim
Cefotetan…
- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác
dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng
trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn.
Thế hệ III
Cefixim
Cefoperazon
Cefotaxim
- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β-
lactamase, tác dụng trên cả P. aeruginosa.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1.
Thế hệ IV
Cefdinir
Cefepim…
- Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3.
Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn
Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas,
Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu.
- Bền vững với β-lactamase.



5
1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu
Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số
cephalosporin được sử dụng nghiên cứu trong đề tài tại bảng 1.2 [6], [7], [9], [13],
[18], [22].
Bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài
Tên chất

Thế
hệ
Công thức phân tử Tính chất vật lí
1. Cephadroxil
monohydrat
I
C
16
H
17
N
3
O
5
S.H
2
O
- Bột màu trắng hoặc gần như trắng.
- Khó tan trong nước, rấ
t khó tan
trong ethanol 96%.
2.Cefuroxim
II
C
20
H
22
N
4
O

10
S
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Ít tan trong nước, tan trong aceton,
ethyl acetat và methanol, ít tan trong
ethanol.
3.Cefdinir
III
C
14
H
13
N
5
O
5
S
2
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Tan trong dung dịch đệm phosphat
0,1M (pH = 7), ít tan trong nước,
trong alcol và diethyl ether.
4.Ceftazidim
III
C
22
H
22
N
6

O
7
S
2
.5H
2
O
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Tan trong dung dịch kiềm, và trong
dimethyl sulfoxid
, ít tan trong
dimethylformamid, methanol, nước,
không tan trong ace
ton, ethanol,
cloroform, dioxan
, ether, ethyl
acetat, toluen.
5.Cefotaxim
natri
III
C
16
H
16
N
5
NaO
7
S
2

- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Dễ tan trong nước, hơi tan trong
methanol, thực tế
không tan trong
ether.
6.Cefoperazon
III
C
25
H
26
N
9
NaO
8
S
2

- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Dễ tan trong nướ
c, tan trong
methanol, hơi tan trong ethanol 96%.




6
1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM
1.2.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cefixim
+ Công thức phân tử:C
16
H
15
N
5
O
7
S
2
.3H
2
O
+ Khối lượng phân tử: 507,5
+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy
methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo[4.2.0] oct-
2- en- 2- carboxylic trihydrat [6], [13], [22].
1.2.2 Tính chất lí hóa
Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton, glycerin,
tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong
ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và
octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH từ 2,6 đến 4,1 [6],
[13], [22].
1.2.4 Dược lí
Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo đường
uống.
Cefixim có độ bền vững cao với sự thủy phân của beta-lactamase mã hóa bởi
gen nằm trên plasmid và chromosom. Cefixim có tác dụng cả invitro và trên lâm
sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây:

- Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes.
.3H
2
O




7
- Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết beta –
lactamase), Moraxella catarrhalis (đa số tiết beta – lactamase), Escherichia coli,
Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase).
Cefixim không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus,
Pseudomonas aeruginosa và hầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia [5], [9],
[11], [12], [18].
1.2.5 Chỉ định
- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính.
- Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng.
- Viêm niệu đạo do lậu cầu.
- Điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin thế
hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết, viêm
màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm
khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5], [18].
1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim
Nghiên cứu định lượng cefixim rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác
nhau. Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim.
1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang
- Định lượng cefixim trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm,
mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH
2

PO
4
, điều chỉnh
pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22].
1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC
 Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch
- Cột: C
18
(0,125 m x 4 mm, 5µm)
- Pha động: ACN : dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5 (chỉnh
pH bằng dung dịch H
3
PO
4
1,5 M) (1:3)
- Detector: UV λ = 254 nm
- Tốc độ dòng: điều chỉnh cho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút [6],
[13], [22].



8
 Mẫu dịch sinh học
 Phạm Thu Trang: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng dung dịch acid HClO
4
20%
- Điều kiện phân tích:
o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40
o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH

2
PO4 12,5 mM, KH
2
PO
4
5
mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút
o Detector: DAD λ =285nm [10].
 Abbas Khan và cộng sự: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng acid tricloroacetic
- Điều kiện phân tích:
o Cột Supelco Discovery HS C
18
(150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50
o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic(19:81), tốc độ
dòng 2 ml/phút
o Detector: UV λ = 285 nm [16].
 Joy A. McAteer và cộng sự: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng ACN
- Điều kiện sắc kí:
o Cột

Altex Ultrasphere C
8
(150 x 4,6 mm, 5 µl)
o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat pH 2,6 = 20:80, tốc độ dòng 2
ml/phút
o Detector: UV λ = 254 nm [19].
 Emirhan Nemutlu và cộng sự: mẫu huyết tương và nước ối
- Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X)

- Điều kiện sắc kí:
o Cột Xterra C
18
(250 x 4,6 mm, 5 µl), nhiệt độ cột 32
o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40mM pH = 3,2 và MeOH, gradient, tốc
độ dòng 0,85 ml/phút
o Detector: DAD λ = 285 nm [20].



9
 Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống
Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống
đã được công bố
- Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg
- Điều kiện sắc kí:
o Cột Luna C
18
(250 x 2 mm, 5 µm)
o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha động,
tốc độ dòng 0.2 ml/phút
o Detector: MS-MS [23].
Nhận xét
Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều
trường hợp.Vậy nên cefixim là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên
cứu nhiều. Các nghiên cứu về cefixim rất phong phú đa dạng từ định lượng cefixim
trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải.
Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22].
Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm
chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định

lượng cefixim đồng thời với các chất khác [16], [19], [20]. Tại Việt Nam, cũng đã
có những nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương [10].
Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít.
Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng
cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy. Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một
nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17]. Nghiên cứu này sử
dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết pha rắn.
Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, hệ thống
LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam.
Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ
kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích
cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng.



10
1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.4.1 Khái niệm
HPLC là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào
loại pha tĩnh sử dụng [1].
1.4.2 Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng được
cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục. Các chất tan là thành phần của
mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau
các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định
tính và định lượng [1], [2].
1.4.3 Phân loại

Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion,
sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học.
Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố.
Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Có thể phân
thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:
- Sắc kí lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang
rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố
giữa 2 pha lỏng.
- Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví
dụ như silica, alumina [1], [2].
1.4.4 Các thông số đặc trưng
* Hệ số phân bố K

Trong đó C
S



11
C
S
: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.
C
M
: nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của các chất của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách
diễn ra càng dễ dàng hơn [1].
* Thời gian lưu t
R

Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến derector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của
mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các
chất [1].
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động.
* Hệ số dung lượng k’

k’ = = K.
Trong đó:
K: hệ số phân bố
V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu [1].
* Hệ số đối xứng của pic AF
AF =
Ở đây:
W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic,
: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía
trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

12
Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 AF 2 [1].
* Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N:
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột.
2
2/1
2
54,516






=






=
W
t
W
t
N

RR

Trong đó : W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh [1].
* Độ phân giải
- Độ phân giải đánh giá khả năng tách hai chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền kề.
AB
RARB
AB
RARB
S
WW
t
t
WW
tt
R
2
/12/1
)
(18
,1
)(2
+
−
=
+
−
=

- Trong đó : t
RA
, t
RB
: Thời gian lưu của 2 pic liền kề
W
A
, W
B
: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
, W
1/2B
: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic.
Các giá trị t
RA
, t
RB
,W
A
, W
B
, W
1/2A
, W
1/2B
phải tính theo cùng đơn vị [1].
- Yêu cầu R

S
> 1, giá trị tối ưu R
S
= 1,5.
1.4.5 Ứng dụng của HPLC
- Định tính :
- Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc kí đồ của chuẩn và thử là cơ sở của
phép định tính. Trên các máy HPLC hiện đại với detector mảng diod ta có thể quét
phổ UV-VIS của chất phân tích trên sắc kí đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ
với nhau để xác định sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI-
similarity index).
- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn.
- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao.
- Hệ số Match
0,990 : hai phổ tương tự nhau.
- Hệ số 0,900
Match 0,990 : hai phổ có những điểm tương đồng.
- Hệ số Match
0,900 : hai phổ khác nhau.
- Định lượng :



13
Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ chất phân tích trong dung dịch (diện
tích pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc kí là cơ sở của phép định
lượng
Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là :
- Phương pháp dùng chuẩn ngoại.
- Phương pháp dùng chuẩn nội.

- Phương pháp thêm chất chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong đó phương pháp dùng chuẩn ngoại được sử dụng nhiều. Đây cũng là
phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này. Vì vậy sau đây chúng tôi xin trình bày
chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại dùng trong định lượng bằng HPLC.
* Phương pháp dùng chuẩn ngoại
Phương pháp dùng chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản. Trong đó
cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng một điều kiện.
Nguyên tắc : so sánh diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với diện
tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu chuẩn để tính nồng độ các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm : Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử.
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức :
C
X
= C
S
. S
X
/S
S
Trong đó :
C
X
: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
C
S
: nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn
S

X
(H
X
) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử
S
S
(H
S
) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn
 Chuẩn hóa nhiều điểm :Tiến hành qua các bước như sau :
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc kí. Các
đáp ứng thu được là diện tích pic hoặc chiều cao pic của mỗi dung dịch chuẩn.



14
Để tính toán nồng độ của chất phân tích có thể sử dụng 1 trong 2 cách sau :
- Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic S (hoặc
chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Từ diện tích (hoặc chiều cao)
pic của chất thử và đường chuẩn đã xây dựng sẽ suy ra được nồng độ của chất thử.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định.
Y = a. C
X
+ b
Trong đó :
Y : Diện tích pic
b : Giao điểm của đường chuẩn với trục tung
a : Độ dốc của đường chuẩn
C

X
: Nồng độ chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ chất thử :
C
X
= (Y-b)/a
Lưu ý : Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử phải nằm trong
đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [2].














15
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Sử dụng nước thải nhà máy dược phẩm của công ty Mediplantex – một trong
những công ty có dây chuyền sản xuất các cephalosporin trong đó có cefixim làm
nền mẫu trong nghiên cứu này.
Tiến hành lấy mẫu nước thải của công ty Mediplantex vào ngày không sản

xuất cefixim, thêm cefixim chuẩn để từ đó xây dựng phương pháp định lượng
cefixim trong nước thải nhà máy.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn
Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu :
Các chất chuẩn :
- Cefixim : Chuẩn quốc gia, SKS : 0105192, hàm lượng 98,88%, độ ẩm
10,57%, nơi sản xuất VKNTTW.
- Cefuroxim natri, cephadroxil, cefdinir, ceftazidim, cefotaxim, cefoperazon :
chuẩn làm việc.
Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu như sau :
- ACN, MeOH loại tinh khiết dùng cho HPLC, nơi sản xuất Merck, Đức.
- Dicloromethan, cloroform, diethyl ether, natri dihydrophosphat, acid
phosphoric loại PA, nơi sản xuất Merck, Đức.
- Giấy thử pH, nơi sản xuất VKNTTW



16

a.Hệ thống HPLC Merck - Hitachi

b.Một số chất chuẩn – hóa chất

c.Mẫu nước thải của nhà máy Mediplantex
Hình 2.1. Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ tại Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương (được chuẩn
theo ISO/IEC 17025 và GLP ) gồm có :
- Máy lắc siêu âm LK 106 (Đức)

- Cân phân tích Metler Toledo (d=0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ)
- Máy li tâm Hettich zentrifugen (Đức)
- Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck – Hitachi với detector
DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D700, Nhật Bản
- Dụng cụ thủy tinh các loại



17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu
- Mục đích: tìm được loại dung môi, tỉ lệ dung môi xử lí mẫu có hiệu suất cao,
loại được nhiều tạp chất.
- Tiến hành xử lí mẫu thử chứa cefixim bằng các cách khác nhau. Định lượng
hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn. Đánh giá và tìm ra cách xử lí phù hợp.
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí
Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí về cột
sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc kí lỏng
hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc kí phù hợp nhất
để định lượng cefixim.
2.3.3. Đánh giá phương pháp
Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phương pháp xử lí đã xây dựng, tiến hành sắc
kí các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa
trên các chỉ tiêu: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và
độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
 Độ thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian
lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp.
Yêu cầu: RSD% về thời gian lưu và diện tích pic < 2% [15].
 Độ đặc hiệu :Trên sắc kí đồ, mẫu trắng phải không có pic có thời gian lưu
tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn [15].

 Độ tuyến tính: Kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng
nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.
Xây dựng đường chuẩn 6 điểm (X1 đến X6) của dung dịch có chứa chất chuẩn
cefixim ở trong khoảng nồng độ phù hợp.
Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn. Tiêm 3 lần mỗi mẫu. Tính giá trị
trung bình.
Xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r của cefixim.
Yêu cầu: r > 0,997 [15].