Nghiên cứu định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN VĂN ĐỨC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ







HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN VĂN ĐỨC


NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS: Trần Thị Lan Hương
2. ThS: Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương
sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW



HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành
của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời
gian qua.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới ThS.
Trần Thị Lan Hương và ThS. Tạ Mạnh Hùng, những người thầy đã dành rất
nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn các anh chị tại trung tâm đánh giá
tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình giúp đỡ,
chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Trong suốt 5 năm học tập tại trường đại học Dược Hà Nội, em đã nhận được
sự dìu dắt, dạy bảo tận tình của các thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn!

Với tất cả tình thương yêu, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị
em và những người bạn – những người luôn động viên, khích lệ em trong suốt thời
gian qua.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Nguyễn Văn Đức





MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1.Tổng quan về Rifampicin (RIF) 2
1.1.1.Cấu trúc hóa học 2
1.1.2.Tính chất hóa lý 2
1.1.3.Dược động học 3
1.1.4.Phổ tác dụng và cơ chế 3
1.1.5.Chỉ định 3
1.1.6.Một số chế phẩm trên thị trường 4
1.1.7.Một số phương pháp định lượng RIF trong dịch sinh học bằng HPLC 5
1.2.Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
1.2.1.Định nghĩa 7
1.2.2.Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 7
1.2.3.Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC 8
1.2.4.Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 9

1.2.5.Phương pháp định lượng bằng HPLC 13
1.3.Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 14
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 17
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3.Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1.Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu 18
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 20
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 21
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương: 24
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 24
3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có Rifampicin 28
3.1.3. Qui trình phân tích RIF trong huyết tương 31
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 31
3.2.1. Tính chọn lọc 32
3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 34
3.2.3. Giới hạn định lượng dưới 37
3.2.4. Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày 37
3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 40
3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương 42
3.3. Bàn luận 45
3.3.1. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương có Rifampicin 45
3.3.2. Phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương 45
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CC : Đường chuẩn

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control
Sample)
HT : Huyết tương
IS : Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification)
LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control
Sample)
MeCN : Acetonitril
MeOH : Methanol
MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality
Control Sample)
QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample)
RIF : Rifampicin
SKĐ : Sắc ký đồ
SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration)
ULOQ : Nồng độ giới hạn định lượng trên (Upper Limit Of Quantification)
US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and
Drug Administration)
UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible)
WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)





DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Nội dung Trang
1.1 Các chế phẩm rifampicin trên thị trường 4

1.2 Một số nghiên cứu định lượng rifampicin trong dịch sinh học 5
2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 17
2.2 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 18
2.3 Chuẩn bị đường chuẩn 19
2.4 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 20
2.5 Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng dưới 20
3.1
Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng
thời gian lưu của rifampicin và nội chuẩn
34
3.2
Kết quả sự tương quan giữa nồng độ rifampicin trong huyết
tương và tỷ lệ đáp ứng pic
35
3.3 Kết quả thẩm định đường chuẩn 36
3.4 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 37
3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 38
3.6 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 39
3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 40
3.8 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi rifampicin 41
3.9
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu
kỳ đông–rã
42
3.10
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ
phòng trong thời gian ngắn
43
3.11
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ -

80
0
C trong thời gian dài
44



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình

Nội dung Trang

1.1 Cấu trúc cột LC – DB 11
1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 11
3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS của rifampicin 24
3.2
Sắc đồ chuẩn rifampicin trong pha động: methanol - đệm phosphat
(65:35)
26
3.3
Sắc đồ chuẩn nội chuẩn trong pha động: methanol - đệm phosphat
(65:35)
26
3.4
Sắc đồ chuẩn rifampicin trong pha động: methanol - acetonitril -
đệm phosphat (48,8: 16,2: 35)
27
3.5
Sắc đồ chuẩn nội chuẩn trong pha động: methanol - acetonitril - đệm
phosphat (48,8: 16,2: 35)

27
3.6 Sắc đồ chuẩn rifampicin và nội chuẩn với tốc độ dòng khác nhau 28
3.7 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng tủa protein bằng methanol 29
3.8
Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin và nội chuẩn tủa
protein với 1,5 mL methanol
29
3.9
Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin và nội chuẩn tủa
protein với 1,0 mL methanol
29
3.10 Sắc đồ chuẩn rifampicin trong methanol có Vitamin C 1,0 mg/mL 30
3.11 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 32
3.12
Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 0,2
µg/mL) và nội chuẩn
33
3.13
Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 9,0
µg/mL) và nội chuẩn
33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến. Bệnh do vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis gây ra. Cơ quan chịu tác động phổ biến nhất của vi
khuẩn lao là phổi. Ngoài ra, các vị trí khác có thể gây bệnh của vi khuẩn lao là
xương, khớp, hạch và não. Theo tổ chức y tế thế giới, lao là mối đe dọa lớn trên

toàn cầu về vấn đề sức khỏe [21].
Việt Nam nằm trong danh sách các nước có số ca mắc lao cao trên thế giới,
đứng thứ 12/23 nước có số lượng bệnh nhân lao cao trên toàn cầu. Đặc biệt, những
số liệu gần đây cho thấy tỷ lệ số bệnh nhân lao tái phát và thất bại điều trị có xu
hướng gia tăng [20].
Rifampicin là một trong năm thuốc của thuốc điều trị lao nhóm 1 gồm có
isoniazid, rifampicin, pyrazinamid, ethambutol, streptomycin. Vi khuẩn lao kháng
thuốc hiện nay đang có xu hướng gia tăng và là một vấn đề lớn gây thất bại trong
điều trị. Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến kết quả trong điều trị trong đó
nồng độ thuốc chống lao trong máu có liên quan chặt chẽ đến hiệu quả điều trị thực
tế. Để đánh giá chính xác việc điều trị có đạt yêu cầu hay không, việc định lượng
nồng độ thuốc trong máu là một yêu cầu cần thiết được đặt ra. Điều đáng chú ý,
năm 2010 Bộ Y tế đã ra quy định các thuốc chứa hoạt chất rifampicin phải có báo
cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo mới được cấp phép đăng ký và
lưu hành trên thị trường Việt Nam [7]. Do vậy, để xác định nồng độ rifampicin
trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh
học các chế phẩm chứa hoạt chất rifampicin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV.
2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ RIFAMPICIN (RIF)
1.1.1.Cấu trúc hóa học
- Công thức phân tử: C
43
H

58
N
4
O
12
; M=822,95 g/mol
- Công thức cấu tạo:











- Tên khoa học:
(12Z,14E,24E) (2S,16S,17S,18R,19R,20R,21S,22R,23S) – 5,6,9,17,19-
pentahydroxy – 23 – methoxy – 2,4,12,16,18,20,22 – heptamethyl – 8 – [N-(4-
methyl-1-pipeainyl) pentadecatrienoimino] -1,2-dihydronaphtho [2,1-b] furan -21-
yl acetat. [2], [4], [13], [19]
1.1.2.Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh màu đỏ cam, hoặc đỏ nâu, không bền khi bị ẩm.
- Dễ tan trong cloroform; tan trong methanol; tan ít trong nước, ethanol, ether.
- Dung dịch RIF không bền và biến đổi tùy thuộc vào pH và nhiệt độ. Ở pH
kiềm, RIF dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí làm chuyển RIF sang dạng quinon; Ở
pH acid, RIF bị thủy phân ra hợp chất 3-formyl rifamycin SV. Các nhóm ester bị
thủy phân ngay ở pH trung tính. [2], [4], [13], [19]

3

1.1.3.Dược động học
RIF được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng trên 90%. Khi
uống liều 600 mg, sau 2-4 giờ đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 7-9 µg/ml.
Thức ăn làm chậm và giảm hấp thu thuốc. Khoảng 80% thuốc liên kết không bền
với protein huyết tương.
Thuốc phân bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, đặc biệt là phổi và dịch
phế quản. Thuốc vào cả nhau thai, sữa mẹ và dịch não tủy khi màng não bị viêm,
thể tích phân bố là 1,6 L/kg.
RIF chuyển hóa ở gan bằng phản ứng acetyl hóa, thải trừ khoảng 65% qua
phân và khoảng 30% qua nước tiểu, phần còn lại qua mồ hôi, nước bọt, nước mắt.
Sản phẩm thải trừ có màu đỏ, thời gian bán thải 3-5 giờ. [1], [3]
1.1.4.Phổ tác dụng và cơ chế
RIF có tác dụng tốt với các chủng vi khuẩn Mycobacterium đặc biệt là
Mycobacterium tuberculosis, vi khuẩn phong Mycobacterium laprae và các vi
khuẩn cơ hội M.bovis, M.avium. Nồng độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0,1 -
2 µg/ml.
Cơ chế: RIF gắn vào các tiểu phân đơn vị β của ARN-polymerase, làm sai
lệch thông tin của các enzym này, do đó ức chế sự khởi đầu của quá trình tổng hợp
của ARN mới. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn. Vi khuẩn lao kháng thuốc là do sự
thay đổi cấu trúc ở tiểu đơn vị β của enzym ARN – polymerase. RIF không kháng
chéo với các thuốc chống lao khác nhưng khi sử dụng đơn độc và lạm dụng dẫn đến
tăng tỷ lệ kháng thuốc. Theo số liệu chương trình chống lao quốc gia, khoảng 3,6%
bệnh nhân lao có trực khuẩn kháng RIF. Do đó sử dụng RIF cần có sự giám sát
nghiêm ngặt để đảm bảo hiệu quả điều trị. [1], [3]
1.1.5.Chỉ định
- Điều trị tất cả các thể lao bao gồm cả lao màng não (phối hợp với các thuốc
khác theo phác đồ).
- Điều trị phong (theo phác đồ).

- Phòng và điều trị viêm màng não do H.influenzae và N.meningitidis.
4

- Điều trị nhiễm khuẩn nặng do Staphylococus kháng Methicillin. [1], [3]
1.1.6.Một số chế phẩm trên thị trường
RIF là kháng sinh bán tổng hợp, chủ yếu dùng ở dạng viên uống hàm lượng
150 mg hoặc 300 mg. Các chế phẩm trên thị trường có thể chứa thành phần duy
nhất là RIF hoặc dạng kết hợp RIF với các thuốc chống lao khác thuộc nhóm thuốc
điều trị lao nhóm 1 như là Isoniazid (H), Pyrazinamid (Z), Ethambutol(E). Một số
chế phẩm chứa RIF trên thị trường Việt Nam được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1: Các chế phẩm RIF trên thị trường [23]
STT

Biệt dược Thành phần
dược chất
Dạng thuốc Nhà sản xuất
1

-Eremfat 150 và
Eremfat 300

-Rifampicin
150mg
-Rifampicin 300
mg
RIF
-Viên nén bao
phim 150mg và
300mg
-Viên nang

-Viên nang
cứng
-Fatol Arzneimittel
GmbH – Đức

-CTCP Dược phẩm
TW2
-CTCP DP Nam Hà

2 -Rifa H 250

-Rifampicin
INH
RIF + Isoniazid
- Viên nén bao
phim
-Viên nang
-CTCP Dược phẩm
TW2
-CTCP hóa DP
Mekophar-VN
3
Turbezid
RIF + Isoniazid
+ Pyrazinamid
Viên nén bao
phim
CTCP DP Nam Hà
4

Rimstar 4 FDC
RIF + Isoniazid
+ Pyrazinamid
+ Ethambutol
Viên nén bao
phim
Novartis
Bangladesh

5

1.1.7.Một số phương pháp định lượng RIF trong dịch sinh học bằng HPLC
Hiện nay, đối với RIF nguyên liệu có thể định lượng bằng phương pháp đo
quang và HPLC. Nhưng trong dịch sinh học do có nhiều thành phần nên để đảm bảo
chính xác và giảm thiểu sai số định lượng RIF trong huyết tương thì phương pháp
HPLC thường được chọn để tiến hành. Một số phương pháp định lượng RIF trong
dịch sinh học bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2 [2], [13], [19].
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng rifampicin trong dịch sinh học.
TT

Mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký Detector

Nội chuẩn
Tài
liệu

1 HT
người
Chiết pha rắn
SPE

Cột C18, pha động:
Amonium acetat (0,02
M; pH 4,0) : MeCN.
UV, λ
334 nm
Papaverin
hydrochlorid
12
2 HT
người
SPE, thêm
Vitamin C
1,0 mg/mL
Cột C8, pha động:
KH
2
PO
4
0,05 M :
MeCN (55: 45)
UV, λ
340 nm
Sulindac 15
3 HT
người,
nước
tiểu
Tủa protein
bằng MeOH,
thêm

Vitamin C
(0,5 mg/mL)
Cột: C18 (250x 4,6
mm, 5 µm). Pha động:
Đệm phosphat (0,05
M; pH 2,6) : MeCN
(55: 45); tốc độ dòng:
1,2 mL/phút; thể tích
tiêm mẫu: 20 µL.
UV, λ
254 nm
Rifapentine 11
4 HT
người
Tủa protein
bằng dung
môi MeCN.
Cột C18 (25x 4,6 mm;
5 µm); pha động:
MeOH – đệm
phosphat pH 4,5 (65 :
35); tốc độ dòng 1,0
mL/phút; thể tích tiêm
mẫu: 30 µL.
UV, λ
254 nm
9
6

Nhận xét:

Phương pháp 1, 2: có độ chính xác cao, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,5 –
20 µg/mL và 0,5 – 35 µg/mL. Tuy nhiên, cả 2 phương pháp trên đều sử dụng quy
trình xử lý mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao. Trong điều kiện phòng
thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp này gặp nhiều khó khăn
do không đủ kinh phí mua cột chiết và trang thiết bị chiết pha rắn. Vì vậy, 2 phương
pháp này khó có thể áp dụng ngay ở nước ta hiện nay.
Phương pháp 3: qui trình xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong
dung môi MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp sử dụng chất nội
chuẩn là rifapentine, là 1 chất hiện tại trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi
không có nên khó có thể áp dụng phương pháp vào trong nghiên cứu.
Phương pháp 4: qui trình xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong
dung môi MeCN đơn giản, dễ thực hiện. Khoảng nồng độ tuyến tính của phương
pháp từ 1,0 – 30 µg/mL. Tuy nhiên phương pháp không sử dụng bất kỳ chất nội
chuẩn nào để định lượng RIF trong huyết tương do đó khó đảm bảo được độ chính
xác và không giảm được sai số trong quá trình xử lý mẫu.
Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý
hóa của RIF, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng RIF trong huyết
tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn
phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích
trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm
của Việt Nam.
7

1.2.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1.Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,

loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.[5]
1.2.2.Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký
 Thời gian lưu t
R
:
Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó
là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không
đổi. Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng
công thức sau: t
R
’ = t
R
– t
M.
Với: t
M
là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu t
R
quá lớn thì pic bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài.[5]
 Hệ số phân bố k: là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột
k = Trong đó: C
S
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.

C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động
 Hệ số dung lượng k’: cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai
pha và được tính theo sức chứa của cột:
k’ = k x = = =
k’: tối ưu trong khoảng 1≤ k ’≤8 [5]
8

 Hệ số chọn lọc α:
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ
số chọn lọc α :
α = = =
Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α>1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [5]
 Hệ số đối xứng của pic F:
F = Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh
pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic. [5]
 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N:
Hiệu lực cột được đo bằng thống số: Số đĩa lý thuyết N của cột
N = 16 hoặc N = 5,54
Trong đó: W
1/2h
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic. [5]
 Độ phân giải R
s
của cột:
R

s
= hoặc
Trong đó:
t
(R)A
; t
(R)B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
W
B
; W
A
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: R
S
> 1; giá trị tối ưu R
s
= 1,5. [5]
1.2.3.Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
các bộ phận chính sau:
9

 Bơm cao áp:
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất

(thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định,
phù hợp với quá trình sắc ký.
 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi:
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ. Dung
môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm) và đã
đuổi khí hòa tan.
 Hệ tiêm mẫu:
Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng
hệ thống tiêm tự động.
 Cột sắc ký:
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột được nhồi pha tĩnh.
Cột sắc ký có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính
sắc ký. Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính
2 – 5 mm.
 Detector:
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV –
VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang.[5]
1.2.4.Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.2.4.1.Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký
được chia thành 2 loại:
 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân
tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
10

 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích
thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
 R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH
2
-
NH
2
, alkyl nitril – CH
2
– CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận
để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.[22]
 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế
bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của
mạch carbon (C
2
;C
8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân
nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân
cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.[5]
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những
nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH
phân tích.
Trong môi trường quá acid, pH < 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi
nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác
với cột.
11

Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với
chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm
–Si-C
18
, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau
hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảm đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như
trimethylclorosilan ClSi(CH
3
)
3
hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác
với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH
3
)
2

-C
18
bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH,
được trình bày ở hình 1.2.

Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C
18
một số nhóm phân
cực để tăng thêm độ phân cực của dây C
18
làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn
đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)[22]
12

1.2.4.2.Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của
chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký
như: độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R
s
, độ rộng của đáy pic… nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.
Yêu cầu của 1 pha động:
 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

 Hòa tan chất cần phân tích.
 Có độ tinh khiết cao.
 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả:
 Bản chất của dung môi để pha pha động.
 Thành phần các chất trong pha động.
 pH của pha động.
 Tốc độ dòng của pha động.
Chọn đệm – pH:
Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử
dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ
làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.
Tốc độ dòng của pha động:
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá
trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được
tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế. [22]


13

1.2.4.3.Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển
thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV-
VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác
nhau.[22]
1.2.5.Phương pháp định lượng bằng HPLC
1.2.5.1.Cách đánh giá pic
 Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc
dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.

 Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thủ từ thấp đến trung bình.
1.2.5.2.Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp
chuẩn hóa diện tích.
Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng
thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược
điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra
do máy móc, kỹ thuật, nhất là với những qui trình xử lí mẫu phức tạp và các mẫu có
hàm lượng chất cần định lượng thấp.
 Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử
những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký
trong cùng điều kiện.
 Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời
gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
14

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
 Có 2 phương pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm. Trong
khuôn khổ khóa luận tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn nội – chuẩn hóa
nhiều điểm. Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu có nồng độ chất chuẩn khác
nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau. Tiến hành chạy sắc
ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích

(hay chiều cao) pic của chất chuẩn với chuẩn nội (S
S
/ S
IS
) so với nồng độ chất
chuẩn có trong mẫu (C
S
). Dựa vào đường chuẩn để tìm ra nồng độ chất thử. [5], [6],
[10]
1.3.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC
1.3.1.Yêu cầu chung
Mẫu sinh học thường có nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ chất phân
tích thường rất thấp, do vậy phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định
trước khi áp dụng vào phân tích mẫu.
Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để
đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm
chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực
hiện phân tích những mẫu được khảo sát. [8], [10], [16]
1.3.2.Nội dung thẩm định phương pháp
1.3.2.1.Tính chọn lọc
Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có
mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Nói cách khác,
tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận diện chất cần
phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác. Phương pháp đạt yêu cầu về tính
chọn lọc khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Pic của RIF được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp.
15

- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RIF không

được vượt quá 20% đáp ứng của RIF ở nồng độ LLOQ.
- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không
được vượt quá 5% đáp ứng của IS. [16]
1.3.2.2.Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích
hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Khoảng tuyến
tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp
ứng tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với
hệ số tương quan tuyến tính r.
Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
+ Yêu cầu về hệ số tương quan r: r ≥ 0,98
+ Có ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn (bao gồm cả mẫu có nồng độ
thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất) phải có độ đúng nằm trong khoảng từ
85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không
quá 20%. [8], [16]
1.3.2.3. Độ chính xác của phương pháp
 Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị
thực của mẫu đã biết.
Yêu cầu: độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng
từ 85% đến 115%, trừ giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép từ 80 –
120%. [8], [16]
 Độ lặp lại
Độ lặp lại của 1 phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết
quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu
đồng nhất. Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch RSD hoặc CV (%).
Yêu cầu: Độ lặp lại trong ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15%.
Độ lặp lại giữa các ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15%. [16]

16

1.3.2.5.Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với
tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên
đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn:
- Đáp ứng của chất phân tích tại LLOQ ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu
trắng tại cùng thời gian lưu.
- Độ đúng phải bằng 80% – 120% so với nồng độ thực.
- Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV% khi tiến hành phân tích trên ít nhất
5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20% [8], [16]
1.3.2.6.Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ nồng độ hoạt chất sau khi mẫu được chiết tách theo qui
trình đã chọn so với nồng độ không được xử lý qua chiết tách (mẫu pha trong dung
môi pha động).
Yêu cầu:
- Phương pháp xử lý mẫu được coi là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi không quá
110% và không thấp hơn 30%.
- Giá trị CV% giữa các đáp ứng của nội chuẩn và giữa các đáp ứng của chất
phân tích trong các mẫu QC có qua xử lý ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng
15%.
- Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khác nhau quá 15% [16]
1.3.2.7.Độ ổn định
Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong
lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu. Trong thẩm định phương pháp cần xác định
các loại độ ổn định sau:
Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở
điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ ổn định của
dung dịch pha loãng (nếu có). [8], [16]
Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm: độ ổn định sau 3 chu kì đông – rã

đông, độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi
đã xử lý (chiết tách) và độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong
khoảng thời gian dự định. [8], [16]
17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Máy móc, thiết bị
- Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC – Shimadzu gồm: Bơm cao áp LC-20AT;
bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20AC; buồng ổn nhiệt cột CTO-20A; Detector UV
SPD-M20A; phần mềm điểu khiển và xử lý kết quả LC Solution Shimadzu.
- Cân phân tích Sartorius CP-224S, Đức
- Cân kỹ thuật Sartorius E412
- Máy lắc xoáy Velp, Italia.
- Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức
- Tủ lạnh sâu – 40
0
C, Sanyo MDF – 236, Nhật
- Tủ lạnh sâu – 80
0
C, Sanyo MDF – 192, Nhật
- Micropipet, Eppendorf, Đức
- Ống ly tâm nhựa, dung tích 15 mL
- Bơm hút chân không Satorius.
- Bình định mức, ống đong, pipet định mức và các dụng cụ phân tích cần
thiết khác.
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Các hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1 và
bảng 2.2

Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
Tên Mục đích
sử dụng
Nơi sản xuất

Số kiểm soát Hàm
lượng
Độ
ẩm
Rifampicin Chuẩn
Viện KN
thuốc TƯ
0307018 100,82% 0,40%
Dipyridamol

Nội chuẩn
Viện KN
thuốc TƯ
0102127 99,66% 0,15%