Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUỆ

TRIỂN KHAI PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH
GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE IN VITRO TRÊN ĐĨA 96
GIẾNG VÀ ÁP DỤNG VỚI MỘT SỐ
CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG KHAI
THÁC CỦA ĐỒNG BÀO PAKO – VÂN
KIỀU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
T.S. Nguyễn Thùy Duơng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các
tập thể, các thầy cô giáo, bạn bè và những người thân của tôi.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thùy Dương,
người thầy đã hướng dẫn tận tình và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu và các bộ môn trường

Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược
Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận.
PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Huế.
TS. Phương Thiện Thương, Khoa Phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - những người
đã ủng hộ, chia sẻ, động viên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi hoàn thành khóa
luận này.

Hà Nội, tháng 5, năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Huệ








MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về bệnh gút 3

1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và sự tăng acid uric máu, vai trò của enzym
xanthin oxidase 3
1.1.3. Thuốc ức chế xanthin oxidase 5
1.2. Tổng quan về xanthin oxidase 6
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố 6
1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động 7
1.2.3. Động học enzym 9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzym 9
1.3. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro 11
1.3.1. Phƣơng pháp đo quang 12
1.3.2. Phƣơng pháp đo áp 13
1.3.3. Phƣơng pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 14
1.4. Các dƣợc liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase 14
1.5. Thông tin về một số dƣợc liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 17
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 17
2.1.1. Dƣợc liệu nghiên cứu 17
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 18
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 18


2.2.1. Thuốc và hóa chất 18
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 19
2.3. Nội dung nghiên cứu 19
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.4.1. Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
trên đĩa Costar 96 giếng 20
2.4.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar

96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 24
2.4.3. Phƣơng pháp thống kê 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Kết quả 26
3.1.1. Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
trên đĩa Costar 96 giếng 26
3.1.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar
96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 31
3.2. Bàn luận 37
3.2.1. Về triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
trên đĩa Costar 96 giếng 37
3.2.2. Về áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các cây
thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO vii








DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT


ABTS : 2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)
AHP : 2-amino-4-hydroxypteridin
DMSO : dimethyl sulfoxid
HPLC : sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography)

IC
50
: nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration)
IXP : isoxanthopterin
NSAIDs : thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs)

















DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako –
Vân Kiều 16
Bảng 2.1. Danh sách các cây thuốc nghiên cứu 17
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của allopurinol ở các nồng độ khác nhau 28

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của Quercetin ở các nồng độ khác nhau 30
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 100µg/mL 32
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 50µg/mL 33
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 10µg/mL 34
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của cây mán đĩa theo từng nồng độ khác nhau 35











DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa base purin 4
Hình 1.2. Cấu trúc xanthin oxidase 7
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase 8
Hình 1.4. Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] trong sự có mặt
và vắng mặt chất ức chế 11
Hình 2.1. Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym 21
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm xây dựng đồ thị phương trình

Linewweaver – Burk 22
Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin
oxidase của một mẫu thử 23
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm xác định cơ chế ức chế xanthin
oxidase 24
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của
lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD)
với các dung dịch enzym ở nồng độ khác nhau 26
Hình 3.2. Đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase 27
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
allopurinol theo nồng độ 29
Hinh 3.4. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
quercetin theo nồng độ 30
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
cao toàn phần Mán đĩa theo nồng độ 36
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn cơ chế ức chế xanthin oxidase của cao
phần mán đĩa 37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gút là một bệnh chuyển hóa, có liên quan trực tiếp đến chế độ ăn uống giàu
acid nucleic nhƣ thịt (đặc biệt là nội tạng), các loại đậu, một số loại hải sản và nấm
men. Bệnh xảy ra ở mọi dân tộc, mọi điều kiện địa dƣ và khí hậu, có chiều hƣớng
phát triển ở thành thị và các tầng lớp có mức sống cao [1]. Trên thế giới hiện nay, tỉ
lệ mắc gút ở ngƣời trƣởng thành là 1%, đây cũng là bệnh viêm khớp phổ biến nhất
ở nam giới [14]. Ở Việt Nam gần đây, đời sống ngƣời dân ngày càng cao lại đƣợc
quan tâm chẩn đoán nên tỉ lệ phát hiện mắc gút ngày càng lớn [12].

Trƣớc tình hình bệnh gút ngày càng phổ biến, các nghiên cứu phát triển
thuốc điều trị gút ngày càng đƣợc quan tâm. Bên cạnh việc phát triển các thuốc tổng
hợp hóa học, thực vật và dƣợc liệu cũng là một nguồn nguyên liệu to lớn để tìm ra
các hƣớng đi cho quá trình điều trị bệnh gút. Nhiều nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm
dƣợc liệu có tiềm năng điều trị gút đƣợc tiến hành với cả thử nghiệm in vivo lẫn in
vitro. Trong đó, thử nghiệm in vitro thể hiện lợi thế với ƣu điểm nhanh và đỡ tốn
kém hơn. Đặc biệt, đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro là hƣớng
nghiên cứu đƣợc nhiều tác giả lựa chọn nhằm tìm kiếm các dƣợc liệu có tiềm năng
điều trị gút [30]. Có khá nhiều phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin
oxidase, trong đó, phƣơng pháp đo quang dựa trên định lƣợng acid uric là phƣơng
pháp phổ biến, có thể thực hiện dễ dàng ở các điều kiện trong nƣớc. Bên cạnh đó,
Việt Nam cũng là một đất nƣớc có nhiều tài nguyên cây cỏ, cộng với nền y học cổ
truyền phát triển với nguồn tri thức sử dụng thuốc dân gian của 54 dân tộc khác
nhau. Mỗi dân tộc đều có những kinh nghiệm sử dụng dƣợc liệu khác nhau, đó là
nguồn dữ liệu to lớn để nghiên cứu và phát triển các thuốc điều trị bệnh nói chung
và bệnh gút nói riêng.
Trƣớc những yêu cầu và điều kiện nhƣ vậy, đề tài nghiên cứu “ Triển khai
phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96
giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào
Pako – Vân Kiều” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu sau:
2

1. Triển khai đƣợc phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in
vitro trên đĩa Costar 96 giếng.
2. Đánh giá khả năng ức chế và xác định đƣợc IC
50
của cây thuốc có tác
dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất trong các cây thuốc có tiềm năng
khai thác của đồng bào Pako –Vân Kiều.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh gút
1.1.1. Định nghĩa
Gút là một bệnh rối loạn chuyển hóa liên quan đến tình trạng tăng acid máu
[1],[7],[20]. Bệnh biểu hiện bởi các cơn viêm khớp cấp tái diễn lặp đi lặp lại liên
quan đến tinh thể urat kết tinh, bệnh thận do gút, sỏi thận, sự lắng đọng của natri
urat (tophi) ở sụn, gân, màng hoạt dịch và những mô khác của cơ thể [20].
1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu, vai trò của xanthin
oxidase

● Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu
Acid uric là sản phẩm thoái giáng cuối cùng của nucleoprotein có chứa nhân
purin [1],[3],[20]. Khi nồng độ acid uric vƣợt quá giới hạn tối đa hòa tan urat trong
dung dịch có cùng nồng độ natri nhƣ huyết tƣơng – tức là tình trạng tăng acid máu,
liên quan trực tiếp đến bệnh gút. Trong mọi trƣờng hợp, tăng acid uric máu dẫn đến
tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi. Sự lắng đọng urat tại
các mô khác nhau gây ra các biểu hiện khác nhau. Hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ
khởi phát cơn gút cấp; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt
dịch,trong mô sụn và mô xƣơng sẽ dẫn đến bệnh xƣơng khớp mạn tính do gút; sự có
mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo hạt tophi; viêm thận kẽ (bệnh thận do
gút) là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận. Acid uric niệu tăng và sự
toan hóa nƣớc tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu trong bệnh gút [7],[20].
Tăng acid uric máu đƣợc xác định là yếu tố nguy cơ của gút [20]. Nồng độ
acid uric máu càng cao thì nguy cơ mắc gút càng lớn [37]. Bất kì yếu tố nào làm
tăng quá trình tổng hợp hoặc giảm sự thải trừ acid uric đều có thể làm tăng nồng độ
acid uric máu [20].
● Vai trò của xanthin oxidase trong sinh chuyển hóa acid uric
Xanthin oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong việc hình thành
acid uric. Enzym này có vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và
4

xanthin thành sản phẩm là acid uric ( hình 1.1). Bất kì tác động nào ảnh hƣởng đến
hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành acid uric [3].


Hình 1.1.
Sơ đồ chuyển hóa base purin
1.1.3. Thuốc ức chế xanthin oxidase trong điều trị gút
Hiện nay, chứng tăng acid uric máu và hậu quả của nó là bệnh gút đang ngày
càng phổ biến. Vì vậy, có khá nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm ra các loại

thuốc mới đƣợc ứng dụng trong điều trị gút. Một số thuốc điều trị gút cơ bản đang
đƣợc sử dụng hiện nay là thuốc chống viêm và thuốc hạ acid uric máu. Thuốc chống
viêm nhƣ colchicin hay NSAIDs thƣờng đƣợc dùng chủ yếu để điều trị các đợt cấp
của gút với tác dụng giảm đau, chống viêm [4],[11]. Gút là một bệnh mạn tính mà
5

nguyên nhân là chứng tăng acid uric máu. Sử dụng thuốc nhằm mục đích giảm nồng
độ acid máu trong cơ thể sẽ góp phần cải thiện đƣợc gút và ngăn ngừa tái phát. Có 2
con đƣờng để thực hiện đƣợc điều này, một là tăng đào thải, hai là giảm tổng hợp
acid uric. Thuốc tăng đào thải acid uric cũng đƣợc sử dụng trong lâm sàng nhƣng
chúng có tác dụng hạ acid uric máu yếu và dễ gây ra sỏi tiết niệu [2]. Trong khi đó,
cơ chế tổng hợp acid uric từ xanthin và hypoxanthin nhờ sự xúc tác của xanthin
oxidase đã khá rõ ràng. Ức chế xanthin oxidase sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid
uric và làm giảm nồng độ acid uric máu, cải thiện tình trạng bệnh gút [3]. Hiện nay
đã có một số thuốc ức chế xanthin oxidase đƣợc sử dụng trong lâm sàng khá phổ
biến trong điều trị gút.
● Allopurinol
- Cơ chế tác dụng:
Allopurinol làm giảm nồng độ acid uric máu do ức chế cạnh tranh xanthin
oxidase. Ngoài ra, thuốc làm tăng bài xuất các tiền chất của acid uric qua nƣớc tiểu
và làm ổn định các hạt tophi [2].
- Sử dụng trong điều trị gút:
Allopurinol là thuốc đƣợc sử dụng phổ biến nhất để hạ nồng độ acid uric
máu. Thuốc đƣợc dùng trong điều trị gút mạn và các trƣờng hợp tăng acid máu [2].
Thuốc có giá trị đặc biệt ở những bệnh nhân có tình trạng tăng acid uric máu tổng
hợp, bệnh nhân có tophi, bệnh nhân không đáp ứng với các thuốc tăng đào thải acid
uric và bệnh nhân có sỏi acid uric [4],[11].
- Tác dụng không mong muốn:
- Gây kích ứng đƣờng tiêu hóa, độc với gan và dị ứng với da.
- Có thể gặp cơn gút cấp ở giai đoạn đầu điều trị [2].

● Febuxostat
Febuxostat là một thuốc có tác dụng ức chế chọn lọc xanthin oxidase đƣợc
Liên minh châu Âu sử dụng gần đây để điều trị tình trạng tăng acid uric mạn có
xuất hiện sự lắng đọng tinh thể urat. Thuốc ức chế hoạt động của enzym thông qua
việc khóa liên kết của enzym với cơ chất [22]. So với allopurinol, febuxostat ức chế
6

xanthin oxidase và làm giảm nồng độ acid uric máu hiệu quả hơn trong cả thử
nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng [15].
Thuốc có thể có một số tác dụng không mong muốn nhƣ gây rối loạn chức
năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt. Ngoài ra, thuốc có thể gây các nguy cơ về
bệnh tim mạch [22].
1.2. Tổng quan về xanthin oxidase
Xanthin oxidase là một enzym có cấu trúc phức tạp, đƣợc biết đến cách đây
hơn 100 năm và đƣợc xem là enzym chìa khóa trong chuyển hóa purin. Nó xúc tác
cho phản ứng chuyển hypoxanthin và xanthin thành urat. Sự tăng xanthin oxidase
liên quan đến nhiều cơ chế bệnh sinh nên hiểu biết về enzym, động học và kiểm
soát enzym là thực sự cần thiết. Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp và sự phân bố đặc
biệt trong các mô, các chức năng của enzym này vẫn chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ
[24].
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố
Xanthin oxidase đƣợc tìm thấy trong các loài động vật có vú, gan bê và sữa
bò nhƣng cũng có trong chim, côn trùng và vi khuẩn [8]. Trong các loài động vật có
vú, enzym đƣợc phân bố rộng rãi trong các mô nhƣng nồng độ cao nhất là ở gan và
ruột. Xanthin oxidase cũng đƣợc tìm thấy ở bề mặt các tế bào nội mô của bò và lợn
nhà, và cả bề mặt của tế bào nội mô gan chuột. Enzym này chiết xuất từ sữa bò là
đặc trƣng nhất, tuy nhiên cũng có thể đƣợc chiết từ gan chuột, gà, gà tây và từ tuyến
vú của chuột [24].
1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động
● Cấu trúc

Xanthin oxidase là một protein có khối lƣợng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu
đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị chứa bốn thế oxi hóa khử : một phần phụ molybden, một
FAD, 2 Fe
2
S
2
[8],[24]. Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ trị
với 2 nguyên tử lƣu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxi và với 1 nguyên tử
lƣu huỳnh khác [24]. (Hình 1.2)
7


A B

C
Hình 1.2.
Cấu trúc xanthin oxidase
A. Molybdopterin
B. Molybden cofactor
C. Cấu trúc không gian của xanthin oxidase
● Cơ chế hoạt động
Hoạt động xúc tác cho phản ứng tạo thành acid uric từ xanthin xảy ra ở trung
tâm molybden của xanthin oxidase. Ở trạng thái oxi hóa, trung tâm molybden của
enzym có thể đƣợc xây dựng nhƣ mô hình LMo
VI
OS(OH) với L là đại điện cho
đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzym molybden và vonfram đơn nhân.
Cơ chế hoạt động của enzym nhƣ sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công
trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng
ra từ vị trí C-8 tới nhóm Mo=S tạo ra LMo

IV
O(SH)(OR) (Giai đoạn 1). Sản phẩm
trung gian này bị phá vỡ bởi sự vận chuyển electron các trung tâm oxi hóa khử khác
trong enzym, giải phóng H
+
, tạo ra LMo
V
OS(OR) (Giai đoạn 2). Sau đó, hydro từ
8

dung môi thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu LMo
VI
OS(OH) của enzym
(Giai đoạn 3) [18] (Hình 1.3).
Hình1.3.
Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase
1.2.3. Động học enzym
Thông số động học enzym (Km và Vmax) đƣợc xác định bằng hai phƣơng
pháp đo quang (UV) và phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giá trị Km
thu đƣợc nằm trong khoảng 5,32 – 13,8µM [26].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym
● Nồng độ cơ chất
Xanthin oxidase xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin thành xanthin và
xanthin thành acid uric. Khi nồng độ của xanthin trong cơ thể tăng thì tốc độ của
phản ứng chuyển hóa sẽ tăng, acid uric tạo ra sẽ càng nhiều. Tuy nhiên, đến một
mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [3].
Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ xanthin thích hợp trong phản ứng để tốc độ phản ứng
tối đa mà lại không lãng phí cơ chất.
● Nồng độ enzym
Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng. Tuy nhiên, khi

nồng độ enzym tăng đến một mức nào đó, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động
9

vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không
tăng lên nữa [3]. Nồng độ enzym cũng là một yếu tố quan trọng khi xác định động
học enzym, thời gian dừng phản ứng thích hợp.
● Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng enzym lên cực đại nhờ cơ
chế tăng năng lƣợng cung cấp cho các phân tử cơ chất. Mỗi khi tăng nhiệt độ lên
10ºC thì tốc độ phản ứng sẽ tăng lên 2 lần. Tuy nhiên, đến một nhiệt độ quá cao,
enzym sẽ bị biến tính do bị phá vỡ các liên kết trong cấu trúc. Mỗi enzym đều có
một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng enzym
đạt tới tốc độ cao nhất [3]. Nhiệt độ cũng là một yếu tố trong quá trình bảo quản
enzym. Xanthin oxidase bảo quản ở nhiệt độ 4
º
C sẽ không bị giảm hoạt tính trong
vòng sáu tháng. Ở nhiệt độ -20ºC, enzym ổn định trong ít nhất một năm. Có tác giả
cho rằng, nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzym là 65ºC [33]. Tuy nhiên, theo một
nghiên cứu so sánh giữa xanthin oxidase từ sữa bò với xanthin oxidase từ sữa dê,
nhiệt độ tối ƣu cho xanthin oxidase từ sữa bò là 10ºC và từ sữa dê là 20ºC [21].
● pH
Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng, vì vậy pH có tác dụng rất lớn
đối với tốc độ phản ứng enzym. Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho
hoạt động của mình. Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ƣu cũng dẫn đến sự giảm
hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm
hoạt động của enzym [3]. Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 4,7 [8]. Tuy nhiên,
có tác giả cho rằng pH thích hợp cho xanthin oxidase là 7,5 - 8 [33]. Cũng có
nghiên cứu khác lại cho thấy, pH thích hợp cho xanthin oxidase từ sữa bò là 7,5 và
từ sữa dê là 7,2 - 7,4 [21].
● Ion kim loại

Các ion kim loại nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg
2+
, Ag
+
).
Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hƣởng tới cả trung tâm hoạt
động và cơ chế xúc tác của enzym [3].

10

● Các chất ức chế
Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất
dị vòng khác nhƣ purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd. Xanthin
oxidase còn bị ức chế bởi một số thuốc và một số dịch chiết từ các loài thực vật.
Xanthin oxidase bị bất hoạt không thuận nghịch bởi xyarit [8].
Hai cơ chế ức chế enzym là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh.
Chất ức chế cạnh tranh là những chất có cấu trúc tƣơng tự cơ chất, kết hợp với
enzym ở trung tâm hoạt động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất. Ức chế không
cạnh tranh là sự ức chế thể hiện qua liên kết chất ức chế với enzym tự do hay phức
hợp enzym cơ chất, mức độ ức chế không phụ thuộc nồng độ cơ chất [3].
Cơ chế ức chế đƣợc xác định thông qua việc xây dựng đồ thị phƣơng trình
Lineweaver – Burk, là đồ thị hàm số ngƣợc 1/v đối với [S] với sự có mặt và vắng
mặt chất ức chế [3]. (Hình 1.4)


A B
Hình 1.4.
Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] với sự có mặt và vắng mặt chất ức chế
A: ức chế không cạnh tranh
B: ức chế cạnh tranh

11

1.3. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
Để đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, cần so sánh hoạt độ của enzym
trong môi trƣờng có và không có chất thử . Có khá nhiều phƣơng pháp xác định
hoạt độ enzym [19]:
- Dựa vào sự giảm của các tác nhân oxi hóa thích hợp nhƣ oxy, xanh
methylen, cytocrom.
- Dựa vào độ giảm của cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm nhƣ acid uric.
Tƣơng ứng với các nguyên tắc đó là các phép đo áp, đo nhiệt lƣợng, đo
huỳnh quang, đo quang, đo bức xạ hay đo tích điện [32].
1.3.1. Phương pháp đo quang
● Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Đƣợc áp dụng phổ biến nhất là phƣơng pháp của Noro [31], nguyên tắc dựa
trên phản ứng :
Xanthin + H
2
O + O
2
Acid uric + H
2
O
2

Hoạt độ xanthin oxidase đƣợc xác định thông qua việc định lƣợng acid uric
tạo thành đƣợc đo ở bƣớc sóng 290nm ở 25ºC. Một đơn vị enzym đƣợc định nghĩa
là tổng lƣợng enzym sản xuất ra 1 µmol acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 25ºC.

Phƣơng pháp này đƣợc nhiều nhà nghiên cứu áp dụng và có sửa đổi cho phù
hợp điều kiện, chủ yếu sử dụng máy quang phổ UV và một số ít dùng hệ thống
ELISA [16],[30],[31],[35]. Dung dịch đệm thƣờng đƣợc sử dụng là đệm phosphat
có pH từ 7,5 - 8, vì đệm phosphat không ảnh hƣởng đến hoạt động của xanthin
oxidase [19], bƣớc sóng đo cũng dao động từ 290-295nm.
Quy trình đo thƣờng đƣợc áp dụng với hỗn hợp thử bao gồm dung dịch đệm
và dung dịch enzym trong đệm đƣợc ủ trong 15 phút ở 25ºC. Sau đó, thêm dung
dịch cơ chất (xanthin). Tiếp tục ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 25ºC. Dừng phản ứng
bằng acid HCl 1N. Mẫu trắng chuẩn bị tƣơng tự nhƣng enzym cho vào sau khi đã
cho HCl. Tiến hành đo quang để xác định độ hấp thụ của từng mẫu [31].
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thuận tiện, nhanh và nhạy đối với enzym
tinh khiết ( thƣờng dùng trong in vitro), tuy nhiên không thể áp dụng phƣơng pháp
12

này để đo hoạt độ enzym trong tổ chức vì có sự có mặt của uricase [25]. Có thể
khắc phục hạn chế này bằng cách cho vào hỗn hợp thử kali oxonat 0,1 mM, acid
uric tạo thành sẽ không bị ảnh hƣởng bởi uricase [25].
● Phương pháp đo quang dựa trên chất ABTS (2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-
6-sulphonate)
Đây là một phƣơng pháp mới sử dụng chất màu ABTS nhƣ một chất hấp thụ
mật độ quang thông qua việc sử dụng 2 enzym uricase và peroxidase. Phƣơng pháp
này có độ nhạy khá cao, có thể xác định đƣợc hoạt độ lên tới 20 U/mL và có thể áp
dụng cho các bệnh lý huyết thanh khác [29].
Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa trên chuỗi phản ứng:

Hypoxanthin + 2 H
2
O + 2 O
2
uric acid + 2 H

2
O
2
Acid uric + O
2
allantoin + H
2
O
2
+ CO
2

H
2
O
2
+ ABTS
red
ABTS
ox
+ 2 H
2
O
Hoạt độ của xanthin oxidase đƣợc xác định thông qua việc đo độ hấp thụ của
ABTS
ox
tạo thành sau 10 phút ở bƣớc sóng 410nm [29].
1.3.2. Phương pháp đo áp
Trong phản ứng, xanthin oxidase đóng vai trò nhƣ một chất cho electron nên
có thể xác định hoạt độ enzym thông qua việc đánh giá sự khử của các chất nhận

electron phù hợp nhƣ oxi, xanh methylen và cytochrom C.
Phƣơng pháp đo tỉ lệ tiêu thụ oxi cũng đƣợc một số tác giả áp dụng. Tuy
nhiên, ứng dụng của phƣơng pháp này có một số hạn chế nếu trong gan có sự tiêu
thụ oxi với tỉ lệ cao mà không có cơ chất [19].
Quy trình đo đƣợc áp dụng với hỗn hợp gồm một lƣợng gan đã đƣợc làm
đồng nhất và ƣớp lạnh, đệm phosphat pH 8,6, dung dịch natri xanthat, dung dịch
KOH. Oxi tiêu thụ đƣợc đo áp ở 37ºC [19].
13

Để đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro, thƣờng dùng enzym
tinh khiết phản ứng với cơ chất cùng sự có mặt của chất thử trong dung dịch đệm
[30].
1.3.3. Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang
Nguyên tắc dựa trên phản ứng oxi hóa 2-amino-4-hydroxypteridin (AHP)
thành isoxanthopterin (IXP) dƣới sự xúc tác của xanthin oxidase. Lƣợng IXP tạo ra
đƣợc đo bởi hệ thống HPLC sẽ tỉ lệ với hoạt độ xanthin oxidase [32].
Trên thực nghiệm, có thể tiến hành phƣơng pháp này nhƣ sau: hỗn hợp phản
ứng gồm đệm phosphat, dung dịch AHP, dung dịch 2,6-diclorophenonlindophenol
natri, enzym và nƣớc đủ thể tích; hỗn hợp đƣợc ủ trong 10 phút ở 37ºC; dừng phản
ứng bằng HClO
4
và làm lạnh trong 10 phút. Phổ huỳnh quang kích thích và phát xạ
của IXP đƣợc đo ở 343 nm và 410 nm [32].
Phƣơng pháp này có ƣu điểm đơn giản và nhạy (nhạy hơn phƣơng pháp
huỳnh quang thông thƣờng khoảng 100 lần). Mặt khác, hỗn hợp phản ứng đƣợc
phân tích trực tiếp bởi HPLC không cần phải tách IXP nhƣ trong phƣơng pháp
phóng xạ [32].
1.4. Các dƣợc liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase
Các thuốc tổng hợp hóa học đang đƣợc sử dụng khá phổ biến trong điều trị
gút. Tuy nhiên, các thuốc tổng hợp hóa học có nhiều tác dụng phụ, trong khi đó, gút

là một bệnh mạn tính cần điều trị lâu dài. Do đó, việc nghiên cứu tìm nhằm tìm ra
thuốc điều trị gút từ dƣợc liệu thiên nhiên ngày càng đƣợc ƣu tiên vì có ít tác dụng
không mong muốn. Bên cạnh đó, hƣớng nghiên cứu dựa trên cơ chế ức chế xanthin
oxidase đang đƣợc quan tâm gần đây. Vì vậy, trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc,
ngày càng có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành để tìm hiểu tác dụng ức chế xanthin
oxidase của các dƣợc liệu, từ đó tìm ra phƣơng hƣớng cho việc phát triển thuốc điều
trị gút từ dƣợc liệu. Có khá nhiều dƣợc liệu đã đƣợc nghiên cứu và thể hiện tiềm
năng ức chế xanthin oxidase.
Ở các nƣớc trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu sàng lọc các dƣợc liệu
có tác dụng ức chế xanthin oxidase. Trong một nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc ở
14

Ấn Độ, có 14 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100
µg/mL trong 18 dịch chiết; trong đó có 10 dịch chiết ức chế hơn 50% với IC
50
bé
hơn 100 µg/mL; những cây thuốc có tiềm năng nhất tiếp tục đƣợc đánh giá tác dụng
hạ acid uric máu [34]. Một nghiên cứu khác nghiên cứu trên 95 dịch chiết các cây từ
New Caledonia và Vanuatu, 82 % trong số đó thể hiện tác dụng ức chế xanthin
oxidase; một số dịch chiết thể hiện tác dụng tốt với IC
50
thấp [17]. Một nghiên cứu
trên 122 dịch chiết methanol của dƣợc liệu ở Trung Quốc, có 69 dịch chiết thể hiện
tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL với 29 cây ức chế hơn 50%,
58 dịch chiết thể hiện tác dụng ở nồng độ 50 µg/mL với 15 dịch chiết ức chế hơn
50%. Các cây tiềm năng nhất bao gồm Quế (IC
50
= 18 µ/mL), Cúc hoa (IC
50
= 22

µg/mL), Cỏ Gípxi (IC
50
= 26 µg/mL) [27].
Trong nƣớc cũng đã có một số nghiên cứu sàng lọc đƣợc thực hiện. Một
nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Mai và các đồng sự tiến hành đánh giá tác dụng
của 288 dịch chiết đƣợc lấy từ 96 dƣợc liệu chọn lọc, đã thu đƣợc một số kết quả
khả quan. Trong 288 dịch chiết, có 188 dịch chiết (65,3%) thể hiện tác dụng ức chế
xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL, trong đó có 46 (24,5%) ức chế với tỉ lệ hơn
50%. Ở nồng độ 50 µg/mL, có 168 (58,3%) dịch chiết thể hiện tác dụng với 21
(12,5%) ức chế hơn 50%. Tại nồng độ 25 µg/mL, có 146 (50,7%) dịch chiết thể
hiện tác dụng và 8 (5,5%) ức chế với tỉ lệ hơn 50%. Trong khi đó, ở nồng độ 10
µg/mL, có 126 (43,8%) dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế với 2 (1,6%) dịch chiết
ức chế hơn 50%. Tổng cộng có 49 dịch chiết có IC
50
dƣới 100 µg/mL [30].
1.5. Thông tin về một số dƣợc liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều.
Việt Nam là quốc gia có 54 dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau.
Mỗi dân tộc lại có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc
thù của dân tộc mình. Tộc ngƣời Pako và Vân Kiều là những cƣ dân có mặt sớm
nhất ở vùng Trƣờng Sơn trải dài từ Quảng Nam đến Quảng Bình, nhiều nhất là ở
địa bàn miền núi Quảng Trị với hơn 70% ngƣời Pako - Vân Kiều sinh sống. Qua
thời gian họ đã tích lũy đƣợc những kinh nghiệm, tri thức về sử dụng các loài thực
vật để làm thuốc chữa bệnh. Trong thời gian qua, đã có một số công trình nghiên
15

cứu bảo tồn tài nguyên cây thuốc, tuy nhiên, những kết quả này mới chỉ dừng lại ở
điều tra kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của cộng đồng, chứ chƣa có những đánh giá
kiểm chứng khoa học về tác dụng của các loài này [9],[10]. Trong đề tài này, 10 cây
thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều đƣợc lựa chọn từ các cây thuốc đƣợc sử dụng
nhiều nhất trong dân gian ở vùng đồng bào sinh sống nhƣng chƣa có các nghiên cứu

cụ thể kiểm chứng thành phần hóa học và hoạt tính. Các cây thuốc này chủ yếu có
tác dụng chống viêm, giảm đau, lợi tiểu dùng trong các bệnh xƣơng khớp hay các
bệnh về đƣờng tiết niệu. Một số thông tin thu thập đƣợc từ những ngƣời dân bản xứ
về 10 cây thuốc đƣợc tổng hợp trong bảng 1.1.
Bảng 1.1.Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều
STT
Tên khoa học
Tên Việt
Nam
Kinh nghiệm dân gian
1
Leea rubra Blume ex
Spreng
Gối hạc
Đau nhức xƣơng khớp,
chống viêm
2
Archidendron clyearia
(Jack.)I. Niels
Mán đỉa

Chống viêm tốt, viêm cầu
thận, viêm gan, viêm phần
phụ
3
Erythropalum
scandens Blume
Dây
hƣơng
Lợi tiểu, chống viêm

4
Ficus fulva Reinw. ex
Blume
Ngõa lông
Chữa đau nhức xƣơng khớp,
lợi tiểu, chữa phù
5
Nepenthes mirabilis
(Lour.) Druce
Nắp ấm
Lợi tiểu, chữa sỏi đƣờng tiết
niệu, cao huyết áp
6
Helminthostachys
zeylanica (L.) Hook
Sâm bòng
bong
Các bệnh xƣơng khớp, bệnh
liên quan đến tiểu tiện
7
Flemingia stricta
Roxb.ex Ait.f
Tóp mỡ
thẳng
Chữa sỏi thận
8
Stachytarpheta
jamaicensis (L.) Vahl
Đuôi
chuột

Chữa đái buốt, đái ra sỏi và
viêm đƣờng tiết niệu
9
Phyllanthus
reticulatus Poir
Phèn đen
Chữa tiểu tiện khó, đi tiểu ra
máu
10
Caesalpinia
pulcherrima (L.) Sw
Kim
Phƣợng
Lợi tiểu, chữa sỏi thận
16

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Dƣợc liệu nghiên cứu bao gồm 10 cây thuốc của đồng bào dân tộc Pako -
Vân Kiều ở Quảng Trị đã và đang dùng để phòng và chữa bệnh liên quan đến tác
dụng chống viêm, chống oxy hoá và chống ung thƣ.
Các mẫu cây nghiên cứu đƣợc PGS. TS. Ninh Khắc Bản, ThS. Nguyễn Thế
Cƣờng – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam xác định tên khoa học.
Các mẫu đƣợc thu hái bởi PGS.TS Nguyễn Thị Hoài – Khoa Dƣợc – Đại học
Y Dƣợc Huế.
Danh sách dƣợc liệu nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu

Chiết xuất dược liệu: mẫu cây thuốc đƣợc phơi sấy khô, xay nhỏ thành bột
mịn, sau đó chiết với methanol tuyệt đối bằng pháp ngâm lạnh (48 giờ/lần x 3 lần).
Gộp dịch chiết methanol và cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao.
Cao toàn phần đƣợc sấy chân không đến khối lƣợng không đổi.
Chuẩn bị mẫu thử hoạt tính: hòa tan cao methanol trong dimethyl sulfoxid
(DMSO), pha loãng bằng đệm thành các nồng độ khác nhau sử dụng cho nghiên
cứu.







17

Bảng 2.1. Danh sách các cây thuốc nghiên cứu
STT
Ký
hiệu
mẫu
Tên khoa học
Họ
Tên phổ
thông
Bộ phận
dùng

1
AV08

Leea rubra Blume ex
Spreng
Leeaceae
Gối hạc
Cành
mang lá,
rễ
2
BM 87
Archidendron
clyearia (Jack.) I.
Niels
Mimosaceae
Mán đỉa

Cành
mang lá
3
BM
130
Erythropalum
scandens Blume
Erythropalaceae
Dây
hƣơng
Phần trên
mặt đất
4
BM
135

Ficus fulva Reinw.
ex Blume
Moraceae
Ngõa
lông
Cành
mang lá
5
BM
157
Nepenthes mirabilis
(Lour.) Druce
Nepenthaceae
Nắp ấm
Phần trên
mặt đất
6
DK 40
Helminthostachys
zeylanica (L.) Hook
Ophioglossaceae
Sâm bòng
bong
Phần trên
mặt đất
7
DK 56
Flemingia stricta
Roxb.ex Ait.f
Fabaceae

Tóp mỡ
thẳng
Cành
mang lá
8
QT01
Stachytarpheta
jamaicensis (L.)
Vahl
Verbenaceae
Đuôi
chuột
Phần trên
mặt đất
9
QT02
Phyllanthus
reticulatus Poir
Euphorbiaceae
Phèn đen
Phần trên
mặt đất
10
QT03
Caesalpinia
pulcherrima (L.)
Sw
Fabaceae
Kim
Phƣợng

Cành
mang lá



18

2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.2.1. Thuốc và hóa chất
- Allopurinol (Sigma Aldrich).
- Xanthin, ≥99% (Sigma Aldrich).
- Xanthin oxidase (9 đơn vị/mg protein, 8mg protein/ml; Sigma Aldrich).
- Dimethyl sulfoxid (Meck).
- Hóa chất pha đệm Na
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
(Vel, Bỉ).
- Một số dung môi, hóa chất, thuốc thử khác dùng trong chiết xuất và hóa chất
đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng khác.
2.2.2.Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo pH (EUTECH).
- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU).
- Hệ thống máy ELISA gồm máy dọc khay vi tinh thể (Biotek, Mỹ) và máy ủ
lắc khay (Awareness, Mỹ).
- Máy cất nƣớc 2 lần (Halminton, Mỹ).

- Máy khuấy từ ( Heidolph, Đức).
- Máy ly tâm (HERMILE Z300).
- Micro pipet một đầu kênh 2-20µl, 10-100µl, 100-1000µl (Eppendorf, Đức).
- Micro pipet đa kênh 30-100µl (Eppendorf, Đức).
- Đĩa Costar 96 giếng 3596 (Corning, Mỹ).
- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: đầu côn, micro tube các loại,
pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
2.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu đƣợc
thiết kế với các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
● Thực hiện mục tiêu 1: Triển khai đƣợc phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế
xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng:
- Khảo sát động học enzym: nhằm mục đích
+ Lựa chọn hoạt độ enzym thích hợp cho khảo sát.