Xác định adenosine trong thực phẩm chức năng có chứa đông trùng hạ thỏa bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VÂN ANH


XÁC ĐỊNH ADENOSINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ






HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VÂN ANH


XÁC ĐỊNH ADENOSINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Bùi Đình S
ơn
Nơi thực hiện:
Viện KNVSATTP Quố
c gia




HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Đình Sơn đã
giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm Vệ sinh
an toàn thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban,
cùng các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất và các bộ môn
khác trong Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 09 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Anh

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
…………………………………………………………………

1
Chương 1. TỔNG QUAN
…………………………………………………….

2
1.1. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo

2

1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2

1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo 2

1.1.3. Thành phần của Đông trùng hạ thảo……………………………

3

1.1.4. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo……………………………… 4
1. 2. Giới thiệu về adenosine………………….………………………………. 6

1.2.1. Cấu tạo của adenosine…………………………………………… 6

1.2.2. Chuyển hóa và tác dụng của adenosine……………………

7
1.3. Phương pháp xác định adenosine………………………………………… 8

1.3.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC…………………………… 8

1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (CE)…………… 9

1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng……………………………………… 9
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…………

11

1.4.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng……………………………… 11

1.4.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC………………… 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


15
2.1. Đối tượng 15
2.2. Hóa chất và dụng cụ 15
2.2.1. Thiết bị 15
2.2.2. Dụng cụ 15
2.2.3. Hóa chất

14
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu…………………………………………

16
2.3.2. Phương pháp phân tích………………………………………

16
2.4. Thẩm định phương pháp phân tích…………………………………

17
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN


19
3.1. Lựa chọn phương pháp phân tích

19
3.2. Tối ưu điều kiện xác định adenosine trên hệ thống HPLC…………

19

3.2.1. Lựa chọn cột tách sắc ký…………………………………………
…
3.2.2. Khảo sát thành phần pha động…………………………………

3.2.3. Khảo sát chương trình rửa giải gradient

3.2.4. Điều kiện tối ưu của quá trình sắc ký

19
21
23
26
3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

27

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết …………………………………………
…
3.3.2. Khảo sát dung môi loại béo……………………………………

3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết…………………………………………

3.3.4. Khảo sát thời gian chiết … ……………………………………
…
3.3.5. Khảo sát số lần chiết……………………………………………

27
28
29
30
30
3.4. Đánh giá phương pháp phân tích……………………………………

32

3.4.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn………………

3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của

phương pháp ……………………………………………………………
…
3.4.3. Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp

3.4.4. Đánh giá độ lặp lại của hệ thống

3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

32

33
35
36
37
3.5. Đánh giá chất lượng của TPCN có chứa ĐTHT

40
3.6. Bàn luậ
n
41
3.6.1. Đối tượng nghiên cứu

41
3.6.2. Xây dự
ng quy trình phân tích
41
3.6.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

41
3.6.4. Thẩm đị

nh phương pháp
42
3.6.5. Kết quả phân tích mẫu thự
c
42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


43
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt
ACN Acetonitrile
AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà Hóa phân
tích
AMP Adenosine monophosphat
CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản
CMC Carboxyl methyl cellulose
ĐTHT Đông trùng hạ thảo
EtOH Ethanol
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
MS Mass spectrometry Khối phổ
PDA Photo diode array Dãy diod quang

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
SD Standard deviation Độ lệch chuẩn
TB Trung bình
TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng
TPCN Thực phẩm chức năng
USFDA
The united states food and drug
administration
Cục quản lý thực phẩm và
dược phẩm Mỹ
USP The united states pharmacopeia Dược điển Mỹ
UV Ultra violet Tử ngoại
Vis Visible Khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Khảo sát thành phần pha động…………… …………………
Trang

22
Bảng 3.2. Khảo sát số lần chiết mẫu…………………………… 30
Bảng 3.3 . Khảo sát khoảng tuyến tính…………………………………….

32
Bảng 3.4. LOD và LOQ của adenosine

34
Bảng 3.5. Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 36
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang mềm 38
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang cứng

38
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng lỏng 39

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh của Cordyceps sinensis………………………………
…….
3
Hình 1.2. Hình ảnh của Cordyceps militaris………………………………
……
3
Hình 1.3. Cấu tạo của một số nucleoside trong Đông trùng hạ thảo…………

4
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của adenosine…………………………………
…
7
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC………………………………………

13
Hình 1.6. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký……………………………………

13
Hình 2.1. Quy trình phân tích mẫu dự kiến………………………………
…….
17
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của adenosine……………………………………

19

Hình 3.2. Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C
18…………………………………………
……
20
Hình 3.3. Sắc đồ phân tích trên cột Symmetry C
18………………………………………
…….
20
Hình 3.4. Sắc đồ phân tích trên cột IntertSustain C
18…………………………………
………
21
Hình 3.5. Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H
2
O và ACN………………
…
22
Hình 3.6. Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H
2
O và MeOH…………

22
Hình 3.7. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 1…………………
…….
23
Hình 3.8. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 2…………………
…….
24
Hình 3.9. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 3…………………
…….

24
Hình 3.10. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 4…………………
…
25
Hình 3.11. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 5…………………
…
26
Hình 3.12. Sắc đồ phân tích với điều kiện tối ưu………………………

27
Hình 3.13. Khảo sát dung môi chiết …….………………………… ……
……
27
Hình 3.14: Khảo sát nhiệt độ chiết………………………………………
……
29
Hình 3.15: Khảo sát thời gian chiết ………………………………………
……
30
Hình 3.16. Quy trình phân tích mẫu thực ………………………………
…….
31
Hình 3.17. Khảo sát khoảng tuyến tính ……………………………………
….
32
Hình 3.18. Đường chuẩn của adenosine……………………………………
….
33
Hình 3.19. Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng viên nang tại LOD

34
Hình 3.20. Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng lỏng tại LOD

34

Hình 3.21. Độ đặc hiệu của chuẩn adenosine

35
Hình 3.22. Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dạng nang cứng

35
Hình 3.23: Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫ dạng nang mềm

36
Hình 3.24: Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dạng lỏng

36
Hình 3.25: Đánh giá chất lượng mẫu TPCN có chứa ĐTHT

40
-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc
có tác dụng “Bổ phế ích can, bổ tinh điền tuỷ, chỉ huyết hoá đàm”, “Bổ phế ích
thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “Tư âm tráng dương, khư bệnh kiện thân”, là loại thuốc
có thể chữa được “Bách hư bách tổn”. Trên lâm sàng, các nghiên cứu cổ truyền
cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không
có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật. Trong thành phần hóa học của
Đông trùng hạ thảo, adenosine là một trong những hoạt chất chính có tác dụng.

Adenosine có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá năng lượng của cơ
thể. Nó giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cơ bắp,
giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu…. Vì vậy, việc bổ sung
adenosine hàm lượng cao giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu
quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi.
Tuy nhiên, hiện nay tại Việt nam chưa có phương pháp chuẩn để xác định hàm
lượng hoạt chất chính trong Đông trùng hạ thảo nên việc phát triển phương pháp
phân tích các hoạt chất chính nói chung và adenosine nói riêng trong nguyên liệu
hay các sản phẩm có chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết. Nó là công cụ
giúp cho các nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng và giúp cho người tiêu dùng được
sử dụng các sản phẩm đảm bảo chất lượng.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Xác định adenosine trong
thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC"
với các mục tiêu sau:
+ Xây dựng phương pháp xác định adenosine trong TPCN có chứa ĐTHT
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
+ Ứng dụng phương pháp để phân tích sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT trên
thị trường. Từ đó, đánh giá chất lượng sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT.

-2-

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo
1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo [10], [14], [21], [22], [23]
Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) là một loại nấm thuộc ngành Ascomycotina,
lớp Asiomycetes, được coi là một thần dược có giá trị cao trong y học Trung Quốc
trong nhiều thế kỷ. Đó là một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học
là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus.
Thường gặp nhất là loài Hepialus armoricanus, ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi
Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh.

Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh "Cord" = "chùy", "ceps" = "đầu". Nấm có
dạng giống con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô có mùi tanh như
cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11 cm,
trọng lượng khoảng 0,06g do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu
sâu non giống như con tằm, dài chừng 3 – 5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm.
Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20 - 30 vằn khía, vằn khía ở
gần đầu nhỏ hơn, có 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình
que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy,
ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, chất đệm nấm khá dai và bên trong
ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ
đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu và sâu biến thành xác khô. Vào mùa đông, sâu
bị nhiễm bào tử nấm do ăn phải hoặc hít phải bào tử nấm. Vào mùa hè, nấm phát
triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất. Đông trùng hạ thảo chỉ
được phát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến
5000m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam
1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo [14]
Chi nấm Cordyceps có tới 680 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy
60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được 2 loài
Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris.
-3-


Hình 1.1. Hình ảnh của Cordyceps sinensis

Hình 1.2. Hình ảnh của Cordyceps militaris
1.1.3. Thành phần của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [18], [19], [21], [23]
Trong Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý: các
hợp chất nucleoside, các polysaccharide, protein và các hợp chất nitragenous, sterol,
vitamin, khoáng chất
* Các nucleoside

Đây là thành phần chính có giá trị đặc biệt trong Đông trùng hạ thảo, gồm một
số hợp chất như: deoxyuridine, 2’-3’-dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine,
cordycepin [3’-deoxyadenosine], uridine, guanidine, deoxyguanidine, cordycepin
triphosphate. Trong đó, adenosine là một nucleoside có hoạt tính sinh học chính để
đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo.
-4-


. Hình 1.3. Cấu tạo của một số nucleoside trong Đông trùng hạ thảo
* Các nhóm hợp chất khác
Nakamura và cộng sự [18], [19] đã nghiên cứu cho thấy các polysaccharide
trong ĐTHT có hiệu quả trong việc điều tiết đường trong máu, chống di căn, có
hiệu quả chống ung thư và tăng cường miễn dịch.
Cordyceps chứa protein, peptide và 17 acid amin thiết yếu khác. Ngoài ra,
Cordyceps còn chứa một số dipeptide cyclic không phổ biến như cyclo-[Gly-Pro],
cyclo-[Leu-Pro],… , lượng nhỏ các polyamin như 1,3-diamino propane,…. Các hợp
chất này được chứng minh là có tác dụng kháng sinh [14]
Một số các sterol có trong Đông trùng hạ thảo như ergosterol, ergosterol
peroxide, có tác dụng chống rối loạn tình dục.
Các vitamin cần thiết cho cơ thể: trong 100g Đông trùng hạ thảo có 0,12mg
vitamin B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin
B2, vitamin E, vitamin K….
Ngoài ra còn có hợp chất hydrocarbon, alcohol và aldehyde,…
1.1.4. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [16], [23]
Đông trùng hạ thảo được sử dụng khá phổ biến trong khoảng 200 năm trước
đây ở Trung Quốc và các nước ở Phương Đông. Đến năm 1976, nó đã được biết đến
và sử dụng rộng rãi tại các nước phương tây.
-5-

Đông trùng hạ thảo có tác dụng bổ phổi, thận, cầm máu, tan đờm, điều trị ho

mãn tính, điều trị ra mồ hôi trộm và đảm bảo phục hồi sức khỏe nhanh cho người bị
bệnh và tăng cường sức đề kháng.
Cải thiện chức năng gan: chống xơ gan, viêm gan mãn tính và các bệnh liên
quan đến gan khác. Thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi sử dụng TPCN có chứa
ĐTHT trên 33 bệnh nhân viêm gan B và 8 bệnh nhân xơ gan cho thấy trên 71%
bệnh nhân có cải thiện tình trạng bệnh lý.
Cải thiện chức năng thận: nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy 51% số bệnh
nhân đã cải thiện được bệnh thận mãn tính khi sử dụng 1 tháng các sản phẩm từ
Cordyceps.
Tăng khả năng hấp thụ O
2
, có khả năng làm giảm bệnh phổi mãn tính
Cải thiện chức năng tim: điều trị rối loạn nhịp tim và suy tim mãn tính
Bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do
Giảm kích thước của khối u và chống lại ung thư: dùng polysaccharide chiết
xuất từ Cordyceps với liều 1-10mg/kg trọng lượng mỗi ngày cho chuột có khối u
cho thấy có tác dụng chống khối u sarcoma 180. Mizuno [16], năm 1999 đã nghiên
cứu dùng -(1,3)-D-glucan, phân đoạn CO-N, dẫn xuất từ ĐTHT C.ophioglossoides
để chống lại chuỗi tế bào sarcoma 180 với liều 0,5mg/kg trên chuột. Kết quả, khối u
bị hạn chế phát triển với tỷ lệ đạt đến 98%. Trong một nghiên cứu điều trị 50 bệnh
nhân bị ung thư phổi với liều điều trị 6g/ngày cùng với hoá trị, khối u giảm xuống
46%. Khi điều trị các loại ung thư khác nhau với liều 6g/ngày trong vòng hai tháng
cho thấy bệnh được cải thiện đáng kể, kiểm tra tế bào bạch cầu thấy tăng cao ở các
bệnh nhân có khối u giảm 50%.
Điều tiết khả năng miễn dịch: khi các bệnh nhân bị thiếu khả năng miễn dịch,
như ở bệnh nhân ung thư, viêm gan B và HIV được sử dụng Đông trùng hạ thảo hỗ
trợ điều trị, kết quả cho thấy số lượng và tác động của bạch cầu trong máu tăng.
Ngược lại, với bệnh nhân tăng miễn dịch quá cao như bệnh bạch cầu lympho hoặc
thấp khớp khi dùng Đông trùng hạ thảo cho thấy số lượng và tác động của bạch cầu
trong máu giảm và số lượng hồng cầu lại tăng.

-6-

Duy trì lượng cholesterol tốt: Theo một số nghiên cứu C.sinensis có khả
năng giảm lượng cholesterol tổng xuống 10-21% và triglycerid xuống 9-26% đồng
thời làm tăng hàm lượng cholesterol có tỷ trọng cao (HDL - High density
Lipoprotein) từ 27 - 30%
Hỗ trợ các triệu chứng lão hóa: Nghiên cứu lâm sàng trên một số bệnh nhân
lớn tuổi bị mệt mỏi và các triệu chứng liên quan đến lão hóa sau khi sử dụng các sản
phẩm từ Đông trùng hạ thảo trong 30 ngày. Mệt mỏi của họ đã giảm 92%, cảm giác
của họ về lạnh giảm 89% và hiện tượng chóng mặt giảm 83%, một số bệnh nhân có
vấn đề hô hấp được cải thiện rõ rệt.
Cải thiện chức năng tình dục
Một số hợp chất có hoạt tính sinh học được sử dụng nhiều trong lĩnh vực y học
như 2’,3’- dideoxyadenosine (được coi là chất antiretroviruses) dùng cho điều trị lây
nhiễm HIV (các biệt dược: Didannosine
TM
hay Videx
TM
)
Các nghiên cứu cổ truyền cũng như hiện đại đều xác định Đông trùng hạ
thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật. Liều uống
ĐTHT an toàn đối với chuột thí nghiệm là trên 45g/1kg thể trọng.
Với những tác dụng như trên, Đông trùng hạ thảo được coi là một thần dược
được sử dụng rộng rãi trong y học. Trong đó, adenosine là thành phần hoạt chất
chính để đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo.
1. 2. Giới thiệu về adenosine
1.2.1. Cấu tạo của adenosine [13], [20], [22]
Adenosine là một nucleoside nhân purin. Đây là hợp chất chứa N có cấu trúc
phân tử hai vòng gồm một phân tử adenine liên kết với một đường ribose nhờ liên
kết β-N

9
-glycosidic.
Công thức phân tử C
10
H
13
N
5
O
4,
khối lượng phân tử 267,241g/mol
Tên thương mại: adenocard
Công

thức cấu tạo của adenosine:
-7-


Hình 1.4. Công thức cấu tạo của adenosine
Adenosine ở dạng bột tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước. Độ hòa tan tăng lên
khi nhiệt độ tăng và pH giảm.
1.2.2. Chuyển hóa và tác dụng của adenosine [1], [7], [13], [20]
Trong cơ thể, adenosine được tạo thành do sự thủy phân AMP bởi enzym 5'-
nucleotidase, một phần bị chuyển hóa ngược trở lại tạo thành AMP bởi enzym
adenosine kinase, một phần chuyển hóa thành inosine nhờ enzym adenosine
deaminase, sau đó chuyển hóa thành hypoxanthine nhờ enzym nucleosidase và
thành xanthin nhờ enzym xanthin oxydase, sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hóa
là tạo thành acid uric.
Adenosine là một nucleoside nội sinh ảnh hưởng nhiều quá trình sinh lý của
cơ thể, nó có mặt ở khắp các cơ quan trong cơ thể và đóng vai trò quan trọng trong

qúa trình trao đổi chất của cơ thể như chuyển hóa năng lượng cũng như truyền tín
hiệu cho AMP vòng.
* Đặc tính kháng viêm
Adenosine được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể
A2A. Nồng độ adenosine ngoại bào ở tế bào bình thường là khoảng 300nM. Tuy
nhiên, để đáp ứng với tổn thương tế bào nồng độ này được nhanh chóng nâng lên
600 - 1200nM. Vì vậy, chức năng chính của adenosine là ngăn ngừa tổn thương mô
trong trường hợp thiếu oxy, thiếu máu cục bộ, co giật, tăng cường tuần hoàn mạch
vành, mạch não và điều hòa nhịp tim
-8-

* Tác dụng trên tim
Adenosine trực tiếp kiểm soát các chức năng của mô tim, đồng thời nó có khả
năng bảo vệ tim chống lại một số chuyển hóa có hại bằng cách giảm sự trao đổi chất
tại cơ tim và tăng lưu lượng máu ở động mạch vành.
Adenosine được coi là thuốc điều trị hiệu quả rối loạn nhịp nút nhĩ – thất, rối
loạn nhịp trên thất cấp. Hồi phục được nhịp xoang ở người bị rối loạn nhịp nhanh
trên thất kịch phát.
* Tác dụng trên phổi
Adenosine có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau
liên quan đến viêm đường hô hấp như bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa acid, tế bào
lympho và đại thực bào.
* Tác dụng trên hệ thống thần kinh trung ương
Adenosine có tác dụng tốt với rối loạn thần kinh như: thiếu não cục bộ, động
kinh, các bệnh thoái hóa thần kinh và đau dây thần kinh. Vì vậy, adenosine đã được
sử dụng nhiều trong y học để sản xuất thuốc dùng để điều trị rối loạn nhịp tim,
thuốc chống loạn nhịp tim, bệnh liên quan đến hệ thống thần kinh
* Tác dụng trên tóc
Adenosine được chứng mính có khả năng kích thích sự phát triển của tóc ở
những người có tóc thưa

1.3. Phương pháp xác định adenosine
1.3.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC [8], [15]
Ma Yan và cộng sự [15] đã tiến hành xác định các nucleoside trong Cordyceps
sinensis bằng phương pháp TLC. Dịch chiết được phân tích trên bản mỏng silica
GF
254
có chứa 1% CMC-Na, dung môi gồm cloroform-ethylacetate-isopropanol-
nước-amoniac tỷ lệ 8 ∶ 2 ∶ 6 ∶ 0,5 ∶ 0,12 (theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại 2
bước sóng 254nm và 300nm. Phương pháp rất đơn giản, độ lệch chuẩn tương đối
trong khoảng 0,73 - 0,98% và độ thu hồi cao từ 95,270% - 96,366%.
L.Wuqing và cộng sự [8] xác định adenosine trong viên nang Jinshuibao.
Adenosine được tách trên bản mỏng silica GF
254
– CMC - Na
2
HPO
4
với dung môi
-9-

tương tự như trên, phát hiện tại 2 bước sóng là 260nm và 300nm. Đường chuẩn
được xây dựng trong khoảng 0,65 - 5,2μg với r = 0,9995, độ thu hồi của phương
pháp là 99,5% và hệ số biến thiên 3,7 %.
1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (CE) [6], [12]
Li Hai Ying và cộng sự [12] đã tách và định lượng adenosine, adenin, uridine
bằng dung dịch đệm dinatri tetraborat 15mM và natridihydrophosphat 14mM (pH =
9,5) với 5% MeOH theo thể tích, điện thế 18kV và detector UV bước sóng 254nm.
Hệ số tương quan của phương pháp R≥ 0,9985.
Feng-Qing Yang và cộng sự [6] đã tiến hành xác định 12 nucleoside và
nucleobase (cytosine, adenine, guanine, cytidine, cordycepin, adenosine,

hypoxanthine, guanosine, inosine, 2-deoxyuridine, uridine và thymidine) trong một
số loài Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS).
Mẫu được hòa tan bằng H
2
O 95
0
C, rung siêu âm ở nhiệt độ 75
o
C trong 30 phút. Sau
đó đưa dịch chiết về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,25μm. Dịch chiết được bơm
vào hệ thống CE-MS với pha động là đệm formic 10mM chứa 10% methanol, tốc
độ dòng 3μL/phút. Phương pháp cho kết quả hàm lượng nucleoside và nucleobase
trong cordyceps sinensis là 9138 ± 4823μg/g cao hơn so với C.militaris là 3722 ±
1446μg/g.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng [9], [11], [17], [24], [25]
Lan -Fang Huang và cộng sự [9] đã tiến hành xác định thành phần hoạt tính
của Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris gồm adenin, hypoxanthin,
cordycepin và các sản phẩm chuyển hóa của nó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ LC/ESI-MS. Phương pháp sử dụng pha động gồm H
2
O, methanol và acid
formic với tỷ lệ 85 : 14 : 1 (theo thể tích), cột VP - ODS (2,0 x 150mm) của hãng
Shimadzu, lựa chọn ion [M + H]
+
tại m/z là 136, 137, 268, 252, 302 để phân tích
định lượng cho 4 thành phần hoạt tính. Đường chuẩn được xây dựng cho adenin với
nồng độ từ 1,4 - 140μg/mL, hypoxanthine từ 0,6 - 117,5μg/mL, cho adenosine từ
0,5 - 128,5μg/mL và cordycepin từ 0,5 - 131,5μg/mL. Giới hạn phát hiện và giới
hạn định lượng của adenin là 0,5 và 1,4μg/mL, hypoxanthin là 0,2 và 0,6μg/mL,
-10-

adenosine và cordycepin là 0,1 và 0,5μg/mL. Độ thu hồi của phương pháp trong
khoảng 93,7 - 107%.
Xiao Feng Xue và cộng sự [25] tiến hành phân tích adenosine trong sữa ong
chúa. Adenosine được chiết bằng ethanol : H
2
O tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích. Dịch
chiết mẫu được bơm vào hệ thống HPLC với cột sắc ký C
18
và dung môi gồm 2
kênh: kênh A là acid phosphoric 0,4% và kênh B là MeOH. Detector UV bước sóng
257nm. Độ thu hồi của phương pháp trong khoảng 91,6 - 98,3% với độ lệch chuẩn
nhỏ hơn 5,3%. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng là 0,017 và
0,048μg/mL.
Li chen và cộng sự [11] xác định adenosine và cordycepin trong Đông trùng
hạ thảo. Mẫu được chiết với H
2
O, sau đó dịch chiết được phân tích trên cột Eclipse
XDB -CN. Pha động gồm MeOH : H
2
O theo tỷ lệ 7 : 93, sử dụng detector PDA tại
bước sóng 260nm. Phương pháp có độ thu hồi trong khoảng từ 93,8 - 102,9%, với
độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 3,62%. Giới hạn định lượng của adenosine và
cordycepin là 0,21 và 0,083mg/lít. Phương pháp đơn giản, nhanh, độ chính xác cao
và giá thành thấp.
Hemanth Kumar, M.Spandana [17] phân tích đồng thời adenosine, cordycepin
và sản phẩm chuyển hóa của cordyceps sinensis bằng phương pháp HPLC. Điều
kiện phân tích: cột C
18
ProtoSIL (250nm x 4,6mm x 5μm), pha động MeOH : H

2
O
tỷ lệ 20 : 80 theo thể tích, tốc độ dòng 1mL/phút, detector UV bước sóng 254nm,
nhiệt độ buồng cột 30
0
C. Hàm lượng của adenosine và cordycepin khoảng 0,288 và
0,346mg/g. Độ thu hồi 101,1%, độ lệch chuẩn tương đối là 1,33%.
Theo dược điển Trung Quốc [24], adenosine được chiết tách từ nguồn
nguyên liệu Đông trùng hạ thảo như sau: cân chính xác 0,5g mẫu cho vào bình cầu,
thêm 10mL MeOH 90%, đậy nắp, lắc đều, gia nhiệt và đun hồi lưu trong 30 phút,
làm nguội, thêm methanol 90% đến lượng chính xác, lắc đều, lọc. Chạy sắc ký với
điều kiện như sau: pha động là đệm phosphat (pH = 6,5) và MeOH tỷ lệ 17 : 3, cột
pha tĩnh octandecylsilane, phát hiện tại bước sóng 260nm.
-11-

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng [2], [3], [4]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc
chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng). Mẫu phân tích
được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất
phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất
phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả
năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với
tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.4.1.1. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức

phân cực: -NH
2
, -CN…)
+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân
cực, loại thông dụng nhất là –C
18
H
37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa
dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực. Hơn nữa, trong rất nhiều
trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế.
1.4.1.2. Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân
tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh
+ Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký
+ Hoà tan được mẫu
+ Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector
Có thể chia pha động làm hai loại:
-12-

+ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động
loại này được dùng trong sắc ký pha ngược.
+ Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan,
n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS
2
), CCl
4

, toluene…
Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không
đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có
được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay
đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi
là gradient pha động.
1.4.1.3. Detector trong sắc ký
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc
bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp
+ Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (Vis).
+ Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh
quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất
phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản
ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp
chất có tính dẫn điện…
+ Detector PDA: dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ
của hợp chất có trong hỗn hợp mà chùm tia bức xạ chiếu qua. Dựa vào sự thay đổi
cường độ bức xạ, xác định được chất phân tích.
1.4.1.4. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.
- Phần tách là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ
trợ.
-13-

- Phần phát hiện và xử lí số liệu gồm các detector, phần khuếch đại, computer và
phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
1.4.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [2], [3]
Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu
của các chất. Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung
dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp.

Hình 1.6. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký
Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, so sánh hoặc
thêm chuẩn.
* Phương pháp đường chuẩn
- Pha chế một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau
- Đo đáp ứng Si của các dung dịch chuẩn và lập đường cong phụ thuộc của S
vào C:
S = f(C)
- Chọn khoảng nồng độ phụ thuộc tuyến tính
- Đo tín hiệu đáp ứng S
x
và nội suy nồng độ C
x
từ đường chuẩn
-14-

* Phương pháp so sánh
- Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn
- Đo mật độ quang của dung dịch cần xác định X
- Tính nồng độ của dung dịch X theo công thức sau:
ch
chX
X
D

CD
C
.


* Phương pháp thêm chuẩn
- Đo cường độ đáp ứng của mẫu phân tích S
x
.
- Pha chế một số dung dịch có nồng độ C
x

- Đo nồng độ chất chuẩn đối chiếu C
R
khác nhau: C
x
+ C
R, i

- Đo đáp ứng của các dung dịch S
i

- Xây dựng đồ thị sự phụ thuộc S
i
= f(C
R,i
)
- Chọn khoảng phụ thuộc tuyến tính. Tính nồng độ C
x

-15-

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu: TPCN có chứa ĐTHT
2.2. Hóa chất và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu
- Máy lắc vortex VELP, máy đồng nhất mẫu, máy li tâm lạnh Hermle, máy rung
siêu âm có chế độ gia nhiệt, cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg), cân
kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g)
2.2.2. Dụng cụ
- Ống ly tâm, ống đong, các loại pipet, bình định mức
- Ống nghiệm,
2.2.3. Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích
* Chuẩn adenososine từ sigma aldrich độ tinh khiết ≥ 99%
- Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/mL: cân chính xác khoảng 0,1000g adenosine
chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác 10
-4
, hòa tan và định mức 100mL
bằng H
2
O. Bảo quản trong tủ lạnh 4
0
C, sử dụng trong 1 tháng.
- Dung dịch chuẩn trung gian (200µg/mL): lấy 2mL dung dịch chuẩn gốc vào
bình định mức 10mL và định mức tới vạch bằng H
2
O.

- Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0µg/mL
được pha trong H
2
O.
* Các loại hóa chất, dung môi khác:
- Methanol (Merck 99,9%), n-hexan (Merck 99,9%), ethanol (Merck 99,9%),
diethyl ether (Merck 99,9%), ether dầu hỏa (Merck 99,9%), ethyl acetate
(Merck 99,9%)…
- Nước cất dùng cho sắc ký lỏng