Xác định collagen trong một số chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




VŨ THỊ TRÀ

XÁC ĐỊNH COLLAGEN
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




VŨ THỊ TRÀ

XÁC ĐỊNH COLLAGEN
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất
2. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2015




LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm
Quốc gia, 48 Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội.
Để có thể hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các
thầy cô và anh chị tại trường và viện. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
TS. Lê Đình Chi, bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, đại học Dược Hà Nội. Thầy
đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và
kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
TS. Lê Thị Hồng Hảo, viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã
giao và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
ThS. Vũ Thị Kim Oanh, ThS. Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh chị trong labo
Hóa độc đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo động viên tôi trong suốt quá
trình thực hiện tại Viện.
Các thầy cô trong trường, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Hóa phân tích và Độc chất,
đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá và cần thiết để có thể tham gia nghiên
cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã ở bên, quan tâm động viên tôi.
Mặc dù đã có cố gắng, nghiên cứu của tôi còn nhiều thiếu sót và hạn chế do kiến
thức và kỹ năng còn chưa được đầy đủ. Rất mong nhận được những nhận xét, góp ý
từ thầy cô, anh chị và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn. Xin chân
thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên
Vũ Thị Trà



MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng. 2
1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng 2
1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng 2
1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng 3
1.2. Collagen. 3
1.2.1. Định nghĩa 3
1.2.2. Thành phần collagen 4
1.2.3. Cấu trúc collagen 4
1.2.4. Ứng dụng của collagen 5
1.2.5. Các phương pháp xác định collagen 7
1.2.6. Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin 9
1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11
1.3.1. Định nghĩa 11
1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 12
1.3.3. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng 13
1.3.4. Pha động trong sắc ký lỏng 14
1.3.5. Detector trong sắc ký lỏng 14
1.4. Thẩm định phương pháp phân tích 15
1.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc. 15
1.4.2. Khoảng tuyến tính. 16
1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 16
1.4.4. Giới hạn định lượng (LOQ) 17

1.4.5. Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) 17
1.4.6. Độ thu hồi 18
1.4.7. Tính phù hợp của hệ thống 18



CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu. 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu 19
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 19
2.2.2. Dụng cụ 19
2.2.3. Hóa chất 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Lấy mẫu 20
2.3.2. Xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 20
2.3.3. Xây dựng quy trình phân tích hydroxyprolin bằng phương pháp
HPLC 22
2.3.4. Thẩm định quy trình HPLC 22
2.3.6. Đánh giá kết quả 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Tối ưu các điều kiện xác định collagen bằng phương pháp HPLC 23
3.1.1. Khảo sát quá trình thủy phân mẫu 23
3.1.2. Khảo sát điều kiện dẫn xuất 26
3.1.3. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC. 29
3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 34
3.2.1. Đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 34
3.2.2. Xây dựng khoảng tuyến tính 36
3.2.3. Sự phù hợp hệ thống 37
3.2.4. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ) 37

3.2.5. Độ đúng 38
3.2.6. Độ lặp lại 40
3.3. Kết quả phân tích mẫu thực 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 435



DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ACN
Acetonitrile
Acetonitril
ACQ
6-aminoquinolyl-N-
hydroxy succinimidyl
6-aminoquinolyl-N-
hydroxy succinimidyl
DABS-Cl
Dimethylaminoazobenzene
Sulfonyl Chloride
Dimethylaminoazobenzen
Sulfonyl Chlorid
FMOC
Fluorenyl
Methyloxycarbonyl
Chloride

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IFIC
International Food
Information Council

Hội đồng thông tin thực
phẩm quốc tế
ILSI
International Life Science
Institute
Viện khoa học và đời
sống quốc tế
IUPAC
International Union Of
Pure And Applied
Chemistry
Liên minh Quốc tế về hóa
học thuần túy và hóa học
ứng dụng
LC-MS/MS
Liquid Chromatography
tandem mass spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ

Limit of quantitation
Giới hạn định lượng
RSD
Relative standard devition
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
TEA
Trietylamine
Trietylamin
TPCN
Functional food
Thực phẩm chức năng
UV-VIS
Ultraviolet - Visible
Tử ngoại- khả kiến


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số phương pháp xác định collagen 8
Bảng 3. 1. Khảo sát nồng độ acid 23
Bảng 3. 2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân 24
Bảng 3. 3. Khảo sát thời gian thủy phân 25
Bảng 3. 4. Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất 27
Bảng 3. 5. Khảo sát thời gian dẫn xuất 28
Bảng 3. 6. Các điều kiện tối ưu thủy phân và tạo dẫn xuất mẫu 29
Bảng 3. 7. Các chế độ gradient 31
Bảng 3. 8. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin. 36
Bảng 3. 9. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống 37

Bảng 3. 10. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 38
Bảng 3. 11. Khảo sát độ thu hồi 39
Bảng 3. 12. Khảo sát độ chụm 40
Bảng 3. 13. Kết quả phân tích mẫu thực 41




DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1. Collagen: protein dạng sợi. 4
Hình 1. 2. Cấu trúc xoắn ba của collagen 4
Hình 1. 3. Hình ảnh ba bậc cấu trúc của collagen 5
Hình 1. 4. Một số chế phẩm có chứa collagen 7
Hình 1. 5. Cấu trúc phân tử hydroxyprolin 9
Hình 1. 6. Sơ đồ máy HPLC 11
Hình 1. 7. Quá trình sắc ký. 12
Hình 2. 1. Quy trình xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 21
Hình 3. 1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hàm lượng collagen thu được vào nồng độ
acid thủy phân 24
Hình 3. 2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng collagen thu được vào
nhiệt độ thủy phân 25
Hình 3. 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ collagen thu được vào thời
gian thủy phân 26
Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào nhiệt độ dẫn
xuất 27
Hình 3. 5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào thời gian
dẫn xuất 28
Hình 3. 6. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn detector với detector UV (A) và detector
huỳnh quang (B) 30

Hình 3. 7. Sắc ký đồ của dung dịch hydroxyprolin thu được với chương trình
gradient 1(A), 2(B), 3(C) và 4(D). 33
Hình 3. 8. Quy trình phân tích collagen trong chế phẩm thực phẩm chức năng bằng
phương pháp HPLC 34
Hình 3. 9. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 35
Hình 3. 10. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin 36

1

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, khi mức sống của con người không ngừng được cải thiện, nhu cầu
nâng cao chất lượng cuộc sống ngày càng được quan tâm. Chăm sóc sức khỏe và
làm đẹp là những nhu cầu như vậy, đặc biệt là đối với phụ nữ. Người ta bắt đầu tìm
đến những dịch vụ, sản phẩm giúp chăm sóc sức khỏe và làm đẹp nhanh hơn, tốt
hơn, tiện dụng hơn. Chính vì thế, thực phẩm chức năng (TPCN) là một trong những
lựa chọn đầu tiên của nhiều người.
Gần đây, một trong những thành phần hay được sử dụng trong nhiều nhóm
sản phẩm khác nhau là collagen. Trong đó, nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng
chứa collagen hiện đang lưu hành trên thị trường như Collagen Tây Thi, Nippi, My
Vita Collagen,…. Collagen là một loại protein chiếm 70% cấu trúc da, phân bố chủ
yếu ở lớp hạ bì của da, có vai trò quan trọng với sức khỏe, đặc biệt là với làn da,
mạch máu, xương khớp, mắt [11] … Chính vì tác dụng rất lớn của collagen mà
nhiều nhà sản xuất đã lạm dụng nó trong các sản phẩm của mình hoặc làm giả, làm
nhái các sản phẩm có chứa collagen. Do vậy, cần phải có phương pháp phân tích
phù hợp để xác định hàm lượng collagen trong các sản phẩm trên thị trường.
Cho tới nay đã có khá nhiều phương pháp xác định collagen trong các đối
tượng khác nhau như sắc ký lỏng hiệu năng cao các loại, tạo màu đo quang,…Tuy
nhiên, mỗi phương pháp có những nhược điểm nhất định như quy trình xử lý phức
tạp, dẫn xuất kéo dài, tốn kém, khó áp dụng vào điều kiện tại Việt Nam…Do đó

chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định collagen trong một số chế phẩm thực phẩm
chức năng bằng phương pháp HPLC” nhằm đáp ứng được một phần những yêu cầu
kiểm nghiệm.
Mục tiêu của nghiên cứu:
+ Thiết lập quy trình định lượng hydroxyprolin thu được khi thủy phân collagen,
qua đó xác định hàm lượng collagen trong TPCN.
+ Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng collagen trong một
số mẫu TPCN.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng.
1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng
Hiện nay, vẫn chưa có một định nghĩa duy nhất nào của TPCN được công nhận trên
toàn thế giới. Theo Viện khoa học và đời sống quốc tế (International Life Science
Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều
hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc
bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại". Theo IFIC, thực phẩm chức
năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho
sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản [18]
Theo định nghĩa của Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam thì: thực phẩm chức
năng là thực phẩm (hay sản phẩm) có tác dụng hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng
cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có hoặc không tác dụng dinh
dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ
bệnh tật.
Bộ Y tế Việt Nam trong thông tư “Hướng dẫn quản lý sản phẩm thực phẩm chức
năng” dự thảo 15 ngày 19/11/2012 định nghĩa “Thực phẩm chức năng là thực phẩm
dùng để hỗ trợ chức năng của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái,
tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực
phẩm bảo vệ sức khoẻ, thực phẩm dinh dưỡng y học”.

Như vậy, có thể thấy có rất nhiều định nghĩa về thực phẩm chức năng nhưng nhìn
chung đều có các đặc điểm chung: là thực phẩm hoặc sản phẩm dùng để hỗ trợ,
phục hồi chức năng của các bộ phận trong cơ thể, giúp cơ thể tăng cường đề kháng,
giảm bớt nguy cơ bệnh tật.
1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng
Có nhiều cách để phân loại thực phẩm chức năng, cách phổ biến thường được sử
dụng là phân loại theo tác dụng của chúng. Theo cách phân loại này thì thực phẩm
chức năng bao gồm các nhóm sau:
• Nhóm bổ sung vitamin và khoáng chất
3

• Nhóm thực phẩm chức năng “không béo”, “không đường”, “giảm năng lượng”
• Nhóm các loại nước giải khát, tăng lực
• Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa
• Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột
• Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt, bao gồm thức ăn cho phụ nữ có thai, người
cao tuổi, vận động viên, phi hành gia, người đái đường, cao huyết áp,…
1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng
Theo Thông tư quy định về quản lý thực phẩm chức năng của Bộ Y tế ban hành
ngày 24/11/2014 [1], TPCN cần đạt các yêu cầu sau:
+ Công bố hợp quy và phù hợp quy định an toàn thực phẩm
+ Yêu cầu về báo cáo thử nghiệm hiệu quả về công dụng
+ Yêu cầu kiểm nghiệm
+ Yêu cầu đối với ghi nhãn thực phẩm chức năng
+ Quảng cáo thực phẩm chức năng
TPCN cần đạt các yêu cầu về điều kiện sản xuất, kinh doanh và hướng dẫn sử dụng
TPCN.
1.2. Collagen
1.2.1. Định nghĩa
Collagen là một loại protein được tìm thấy ở động vật, đặc biệt là trong các mô thịt

và mô liên kết của động vật có vú. Nó là thành phần chính của mô liên kết và là
loại protein có nhiều nhất trong các loài động vật có vú, chiếm khoảng 25% đến
35% protein cơ thể. Collagen chủ yếu được tìm thấy trong các mô xơ như dây
chằng, gân và da, và cũng có nhiều trong giác mạc, sụn, xương, mạch máu, ruột, và
đĩa đệm [17].
4


Hình 1. 1. Collagen: protein dạng sợi [20]

1.2.2. Thành phần collagen
Collagen được tạo thành từ 3150 acid amin, trong đó chứa một lượng lớn glycine
(Gly), chiếm tỷ lệ 33% và prolin (Pro) chiếm tỷ lệ 12%.
1.2.3. Cấu trúc collagen
Để đảm bảo được chức năng của các tổ chức trên, collagen tự nhiên có cấu trúc bậc
cao rất phức tạp. Đại phân tử cơ bản của nó là tropocollagen gồm ba chuỗi
polypeptide xoắn vào nhau, nối với nhau bằng cầu nối hydro có chiều dài khoảng
300 nm, đường kính 1,5 nm. Ba chuỗi này là 3 chuỗi α, mỗi chuỗi đều được sắp
xếp theo một đường xoắn ốc phía tay trái [7], [10]

Hình 1. 2. Cấu trúc xoắn ba của collagen

5


Hình 1. 3. Hình ảnh ba bậc cấu trúc của collagen

Ba xoắn tay trái được xoắn lại với nhau thành một cuộn dây cuộn thuận tay
phải, ổn định bằng nhiều liên kết hydro. Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự
sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc

collagen này. Thông thường các chuỗi theo mẫu Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây
X và Y là các acid amin còn lại [10]
1.2.4. Ứng dụng của collagen
Collagen là một loại vật liệu đa năng, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
1.2.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp
Ngày nay, collagen được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:
- Trong công nghiệp thực phẩm: collagen được sử dụng như chất đông, chất
gây lắng trong thực phẩm, dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo,
nguyên liệu sản xuất một số thực phẩm dinh dưỡng,…Collagen hydrolysate
được sử dụng nhằm ngăn chặn sự mất nước trong các sản phẩm phomat, tạo
độ dẻo, dai, mềm trong kẹo dẻo; làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp
trong kẹo mứt,…
- Collagen được dùng thay thế cao su, keo dán, xi măng, là chất tạo kết dính
trong diêm quẹt. Chúng được dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân.
6

1.2.4.2. Ứng dụng trong y học và dược phẩm
Collagen có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau như da trâu, bò, lợn, gân, ruột
động vật nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi như một loại nguyên liệu y khoa [13],
[17]
- Màng collagen được sử dụng trong nha chu và các liệu pháp cấy ghép như
những rào cản để ngăn chặn sự di chuyển của biểu mô tế bào.
- Bác sỹ da liễu và phẫu thuật thẩm mỹ sử dụng collagen để tăng thêm mô
mềm, sửa chữa vết sẹo, làm mịn da, giảm nếp nhăn.
- Với bệnh nhân bỏng, phong, collagen được sử dụng để bảo vệ bề mặt da.
Collagen đang được dùng rộng rãi để thay thế da nhân tạo, được sử dụng
trong việc chữa trị bỏng nặng. Collagen có thể được sử dụng trực tiếp hoặc
sử dụng kết hợp với silicon, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các yếu tố
tăng trưởng và các chất khác.
- Collagen có thể ứng dụng trong tái tạo mạch máu, tái sinh dây thần kinh

ngoại biên.
1.2.4.3. Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm
Mỹ phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng của collagen và do tính chất
đặc biệt của lĩnh vực này, việc kiểm soát collagen trong các loại mỹ phẩm cần phải
được thực hiện nghiêm ngặt.
- Collagen là một chất giữ ẩm tự nhiên hiệu quả do tác dụng hydrat hóa mạnh
mẽ, sâu rộng bao quanh phân tử, liên kết chặt chẽ với bề mặt da. Trong mô,
phân tử collagen là liên kết ngang để tạo thành một mạng lưới mở rộng, làm
tăng sức mạnh và độ bền cho mô.
- Khi được sử dụng trong mỹ phẩm, có một số trường hợp collagen gây phản
ứng dị ứng kéo dài, tuy nhiên, điều này có thể giảm thiểu được bằng cách thử
nghiệm ở một vùng da nhỏ trước khi sử dụng trên diện rộng. Mặc dù khó hấp
thụ qua da, collagen đang được sử dụng như một thành phần chính cho một
số mỹ phẩm dùng qua da.
7


Hình 1. 4. Một số chế phẩm có chứa collagen

1.2.5. Các phương pháp xác định collagen
Có nhiều phương pháp để xác định collagen.
Hướng phổ biến nhất là xác định collagen thông qua hydroxyprolin (mục 1.2.6 –
Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin), do đó để xác định
collagen cần xác định được lượng hydroxyprolin.
Nguyên tắc chung là thủy phân collagen trong điều kiện thích hợp, sau đó định
lượng hydroxyprolin giải phóng ra sau quá trình thủy phân. Từ lượng
hydroxyprolin cho phép suy ra lượng collagen có trong mẫu. Quá trình định lượng
hydroxyprolin có thể được thực hiện bằng phương pháp tạo màu đo quang [14], tạo
dẫn xuất để phân tích bằng HPLC sử dụng detector UV hay huỳnh quang [12], [30]
hoặc phân tích trực tiếp bằng LC-MS/MS [28].

Tuy nhiên, vì lượng collagen trong mẫu TPCN thường tương đối lớn, sử dụng LC-
MS/MS phải pha loãng nhiều dễ gây sai số, điều kiện trang thiết bị không sẵn có ở
đa số phòng thí nghiệm, nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp
tạo dẫn xuất để phân tích trên hệ thống HPLC thông dụng với detector UV-VIS
hoặc huỳnh quang.

8

Bảng 1. 1. Một số phương pháp xác định collagen
STT
Phương
pháp
Đối tượng
phân tích
Quy trình
Điều kiện phân tích
1
Tạo màu đo
quang [8]
[9]
Mô, nước
tiểu
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
Ehrlich, đo
quang
+ Hóa chất: đệm (natri

pyrophosphat, kali borat),
alanin, chloramin T, natri
thiosulfat, thuốc thử Ehrlich
+ pH tối ưu: 8,0-8,5
+ Bước sóng hấp thụ: 560 µm


2
HPLC sử
dụng dẫn
xuất
FMOC-
ADAM
[30]
Cơ, gân
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
FMOC,
chạy sắc ký.
+ Dẫn xuất: FMOC, ADAM,
OPA
+ Pha động: A: dung dịch đệm
acid phosphoric 100mM,
B:100% ACN.
+ Tốc độ dòng pha động:
2ml/phút
+ Thể tích tiêm: 10 µl

+ Detector huỳnh quang, Ex:
260 nm, Em: 310nm
+ Cột C18 4,6×150 mm, 5 µm
3
HPLC sử
dụng kết
hợp dẫn
xuất FMOC
và OPA
[12], [21]
Mô cơ
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
FMOC và
OPA, chạy
sắc ký.
+ Pha động: A (NaH
2
PO
4
40mM


pH 7,8), B (ACN:MeOH:H
2
O
45:45:10 v/v/v)

+ Cột C18 250×4 mm, 5 µm.
Tốc độ dòng pha động: 2
mL/phút, nhiệt độ cột: 40
0
C
+ Detector UV, bước sóng phát
hiện 338 nm
9

4
HPLC sử
dụng dẫn
xuất
DABS-Cl
[29]
Thịt, cơ,
gân
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
DABS-Cl,
chạy sắc ký
+ Cột C8 125×4mm, hạt 5µm,
tốc độ dòng pha động: 1ml/phút
+ Pha động: KH
2
PO
4

0,01M:
ACN 65:35
5
Xác định
collagen sử
dụng
HPLC-
MS/MS
[38]
Collagen
thương
mại, da,
cơ chuột
Xử lý mẫu,
tạo dẫn
xuất, chạy
HPLC-
MS/MS
+ Tốc độ dòng pha động: 0,25
ml/phút, thể tích tiêm: 40µl
+ Nhiệt độ cột: 25
0
C
+ Detector hấp thụ UV: 214 nm
+ Pha động: A (nước/acid
formic 100:0,03 v/v), B
(ACN/acid fomic 100:0,025 v/v)
+ Cột C12 250×2mm, 4µm
+ Chế độ ion hóa: API-ESI sử
dụng N

2
, nhiệt độ khí: 350
0
C, 25 psi

Ngoài ra còn 1 số phương pháp hóa lý khác xác định riêng cho collagen:
- Phương pháp phổ hồng ngoại
- Phổ UV- VIS
- Kiểm tra nhiệt độ biến tính.
1.2.6. Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin
1.2.6.1. Đặc điểm của hydroxyprolin


Hình 1. 5. Cấu trúc phân tử hydroxyprolin
10

Danh pháp IUPAC: (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid
Công thức phân tử: C
5
H
9
NO
3
Hydroxyprolin được hình thành qua quá trình hydroxyl hóa prolin bởi các enzyme
prolyl hydroxylase. Hydroxyprolin khác với prolin ở nhóm -OH ở vị trí Cγ.
1.2.6.2. Vai trò của hydroxyprolin trong collagen
Hydroxyprolin là một acid amin bậc 2, là thành phần cấu tạo của collagen.
Mỗi phân tử collagen có cấu trúc không gian hợp thành từ ba peptid. Ba phân tử
peptid được sắp xếp thành một cấu trúc xoắn ốc, được ổn định chủ yếu bởi liên kết
hydro giữa các phần khác nhau [29]. Hydroxyprolin và prolin đóng vai trò quan

trọng trong sự ổn định collagen.
Năm 1975, Darwin và cộng sự đã phát hiện nhóm OH của hydroxyprolin có vai trò
chủ yếu trong việc ổn định vòng xoắn ba của collagen. Chuỗi polypeptid collagen
nếu thiếu hydroxyprolin thì có thể vẫn tạo thành xoắn ba ở nhiệt độ thấp nhưng
không vững bền ở thân nhiệt. Nghiên cứu trên peptid tổng hợp người ta đã chứng
minh được rằng nếu mạch alpha chỉ chứa prolin, hydroxyprolin và glycin thì sẽ tạo
xoắn ba rất vững bền [7].
1.2.6.3. Tỷ lệ hydroxyprolin/collagen
Hydroxyprolin là acid amin đặc trưng của collagen. Hydroxyprolin không có trong
bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có
thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyprolin.
Lượng hydroxyprolin có trong các chế phẩm collagen từ các nguồn động vật có vú
đã được tìm thấy vào khoảng 13,4 0,24%. Hydroxyprolin có thể chuyển đổi
tương đương sang collagen thông qua hệ số 7,46. Phần trăm collagen của mẫu có
thể được tính như sau [24], [23]:

%collagen 
microgam hydroxyprolin trong 1 ml dịch thủy phân
microgam mô cơ trong 1 ml dịch thủy phân
   
11

1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký (chromatography) là quá trình tách trong đó hỗn hợp mẫu được phân bố giữa
hai pha, một pha đứng yên (pha tĩnh) trong khi pha còn lại (pha động) chuyển động
qua pha tĩnh.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) là
kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng
và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.

Hình 1. 6. Sơ đồ máy HPLC
12


Hình 1. 7. Quá trình sắc ký [32]
Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất
hóa học vừa có tính chất lý học. Nó là sự vận chuyển và phân bố lặp đi lặp lại nhiều
lần liên tục của các chất tan X
i
(hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi
cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó, chất tan X
i
luôn
được phân bố qua lại giữa hai pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách
với một tốc độ nhất định hay gradient [3]
1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký
Khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cần chú ý những khái niệm sau
[6]:

13

Thời gian lưu:
Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian lưu
t
R
. Thời gian chết: thời gian t
M
của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó

bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t
R’
= t
R
- t
M
Hệ số phân bố K:
 






Trong đó, C
S
, C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong hỗn
hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn.
Hệ số dung lượng k’:
 


 




 

 







 




V
S
, V
M
tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
Thường chọn k’ = 1-5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:














 



 


K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A
,

k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
t
RA
, t
RB
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.

Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1.
Thường chọn α = 1,05 - 2. Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài.
1.3.3. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh (stationary phase) là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách
hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ. Tùy
theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng liên kết thường chia làm
2 loại: sắc ký lỏng pha thường (NP HPLC) và sắc ký lỏng pha đảo (RP HPLC).
14

Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (silica trần, silica
được gắn các nhóm chức phân cực: NH
2
, CN,…). Sắc ký lỏng pha đảo: pha tĩnh
trong sắc ký pha đảo sử dụng organochlorosilane với các nhóm R là gốc alkyl có
mạch carbon dài, phổ biến nhất là n-octadecyl (C18) [2]
1.3.4. Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho qua cột liên tục để phân tách
các hợp chất trong mẫu. Có thể chia pha động làm 2 loại: pha động có độ phân cực
cao và pha động có độ phân cực thấp.
Pha động có độ phân cực cao: thường được dùng trong sắc ký pha đảo, thành phần
chủ yếu là nước, nhiều trường hợp phải thêm dung môi để giảm độ phân cực.
Pha động có độ phân cực thấp: cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan,
toluen,…
Đối với sắc ký pha đảo, pha động đầu tiên sẽ có thành phần tương đối phân cực,
giảm dần theo thời gian trong suốt quá trình phân tách. Kỹ thuật thay đổi thành
phần pha động như vậy được gọi là gradient nồng độ.
1.3.5. Detector trong sắc ký lỏng
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục.
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Hiện có
nhiều loại detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc hai nhóm quang

học và điện hóa: detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số
khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn. Tùy thuộc bản
chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
Detector UV-VIS (Ultraviolet/visible detector) được dùng phổ biến nhất trong sắc
ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS (trong khoảng 190-800 nm), áp dụng
cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng
khả kiến (VIS).
Detector huỳnh quang (Fluorescence detector FLD) sử dụng để phát hiện các chất
có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng phát huỳnh
quang, cần dẫn xuất chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang
15

hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử tạo thành sản phẩm có khả năng phát
huỳnh quang.
Đối với detector hấp thu UV/VIS, sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đổi độ hấp
thu theo thời gian. Các loại detector hấp thu có giới hạn phát hiện từ 0,1 đến 1 ng
chất phân tích. Detector huỳnh quang chỉ chọn lọc đối với một số chất phân tích có
khả năng phát huỳnh quang . Sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đồi của cường độ
huỳnh quang theo thời gian, giới hạn phát hiện của detector huỳnh quang từ 1 đến
10 pg.
Detector huỳnh quang chọn lọc hơn và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector
hấp thụ UV. Detector huỳnh quang có độ nhạy 10
-9
mg/mL, khoảng tuyến tính là
10
4
. Nó đáp ứng với các chất phát huỳnh quang như: hợp chất thơm đa vòng, dẫn
chất quinolin steroid và alcaloid…[6]
1.4. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp là việc tiến hành kiểm tra và cung cấp các bằng chứng

khách quan cho thấy phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra.
1.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc.
* Định nghĩa
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất
khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích
một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ
với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
* Cách xác định
So sánh đáp ứng tín hiệu với detector của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng,
mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không được cho tín hiệu của chất phân
tích, mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng
thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
16

1.4.2. Khoảng tuyến tính.
* Định nghĩa
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự
phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu detector và nồng độ chất phân tích.
* Cách xác định
Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ
thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đường cong phụ
thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không
còn tuyến tính. Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong
đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng.
1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
* Định nghĩa
Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng
chưa thể định lượng được.
* Cách xác định

Đối với phương pháp định lượng, có thể xác định LOD dựa trên độ lệch chuẩn
hoặc dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) hoặc dựa trên đường chuẩn. Ở đây
chúng tôi sử dụng phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn, làm trên mẫu thử. Làm 10
lần song song.
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x
tb
và độ lệch chuẩn SD
LOD = 3×SD
 




 



  



Đánh giá LOD đã tính được: tính R= x
tb
/LOD.
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin
cậy
17

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn
vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thử đã
dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
1.4.4. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng
bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
* Cách tính: Dựa trên đường chuẩn
Cách tính tương tự như trong phần LOD nhưng theo công thức: LOQ= 10×SD.
1.4.5. Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)
1.4.5.1. Độ chụm.
Độ chụm dùng để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ x
i
của các phép đo
lặp lại. Nói cách khác, độ chụm được dùng để chỉ sự sai khác giữa các giá trị x
i
so
với giá trị trung bình [4]
* Cách xác định
Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng 1 mẫu, ở các nồng
độ khác nhau (trung bình, thấp, cao) trong khoảng làm việc. Tính độ lệch chuẩn SD
và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức:
 




 



  



 



  
Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn, n: số lần thí nghiệm
x
i
:

giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i, x
tb
: giá trị trung bình của các lần thử
nghiệm
RSD%: độ lệch chuẩn tương đối, CV%: hệ số biến thiên