Xây dựng phương pháp định lượng gentoipicrin trong chế phẩm kem viêm da AD bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ DỊU


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ
PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ DỊU


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ
PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:

1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. Ds. Nguyễn Thị Quỳnh
Nơi thực hiện:
1.Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất
2.Viện công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia


HÀ NỘI - 2014

Lời cảm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn
tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, cô đã hướng dẫn trực tiếp, chỉ bảo tận tình
và giải quyết những khó khăn giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của
mình.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các thầy cô giáo bộ môn Hóa Phân
Tích và độc chất đã tạo điều kiện cho em bảo vệ khóa luận tại bộ môn. Em
xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS. Nguyễn Thị Quỳnh và DS.Ngô Quang
Trung, người trực tiếp giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin đồng cảm ơn các thầy cô và anh chị đang làm việc tại Viện Công nghệ
Dược phẩm Quốc Gia, các thầy cô trong bộ môn Vật lý-hóa lý đã tạo điều
kiện cho em tiến hành thực nghiệm tại phòng thí nghiệm.
Và không thể thiếu, em xin chân thành cảm ơn và gửi lới chúc sức khỏe
đến toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà nội đã dạy dỗ, truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt năm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin giửi lời cảm ơn đặc biệt này đến gia đình, người

thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, theo sát và động viên em trong suốt thời gian
qua.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!


Hà nội, ngày 20 tháng 4 năm 2014
Sinh viên

NGUYỄN THỊ DỊU




MỤC LỤC
Danh mục kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục hình vẽ và đồ thị
Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Long đởm 2
1.2. Kem Viemda AD 4
1.3. Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5
1.3.1 Khái niệm 5
1.3.2 Cấu tạo của hệ thống máy HPLC 6
1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng……………………………………………………………………… 8
1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong sắc ký phân bố 10
1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 14
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG- HÓA CHẤT- THIẾT BỊ-NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16
2.2 Thiết bị - hóa chất 16
2.2.1 Thiết bị…………………………………………………………… 16
2.2.2 Hóa chất…………………………………………………………… 16
2.3 Nội dung nghiên cứu 16
2.3.1 Nghiên cứu điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp 16
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm
Kem Viemda AD 17
2.4 Phương pháp nghiên cứu 17
2.4.1 Điều kiện xử lý mẫu 17
2.4.2 Điều kiện chạy sắc ký 18
2.4.3 Thẩm định phương pháp định lượng 19
2.4.4 Đánh giá kết quả…………………………………………………….22
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin……………23
3.1.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu 23
3.1.2 Lựa chọn điều kiện chạy sắc ký 25
3.1.3 Kết quả lựa chọn…………………………………………………… 29
3.2 Thẩm định phương pháp định lượng băng HPLC 29
3.3 Định lượng gentiopicrin trong mẫu thử kem Viemda AD…………….34
BÀN LUẬN……………………………………………………………… 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD: Viêm da cơ địa
DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV
HPLC: Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
DĐTQ: Dược điển Trung Quốc
H
2
O: Nước
MeOH: Methanol
EtOH: Ethanol
A: diện tích pic
m : khối lượng cân
tt/tt: thể tích trên thể tích









DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng Trang

1.1

Thành phần công thức kem Viemda AD
4
3.1
Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu
23
3.2
Kết quả khảo sát thời gian đun cách thủy
24
3.3
Kết quả khảo sát thành phần pha động
26
3.4
Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động
26
3.5
Kết quả tính thích hợp của hệ thống
29
3.7
Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
31
3.8
Kết quả độlặp lại của phương pháp
32
3.9
Kết quả độ chính xác khác ngày của phương pháp
33
3.10
Kết quả độ thu hồi của phương pháp
34
3.11

Bảng định lượng gentiopicrin trong mẫu thử
34





DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình Trang

1.1
Công thức cấu tạo của Gentiopicrin
2
1.2
Bao bì chế phẩm kem Viemda AD
5
1.3
Cấu tạo hạt silica đã silan hóa
11
1.4
Cấu trúc cột LC-DB
12
1.5
Cấu trúc cột có gốc isopropyl
13
3.1
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A/m vào thời gian chiết
24

3.2
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A/m vào thời gian đun cách
thủy
25
3.3
Sắc ký đồ của chất phân tích ở tốc độ dòng đã chọn
28
3.4
Phổ hấp thụ cực đại của chất phân tích
28
3.5
Sắc ký đồ mẫu placebo
30
3.6
Sắc ký đồ mẫu gentiopicrin chất chuẩn
30
3.7
Đồ thị mẫu Gentiopicrin trong kem Viemda AD
31
3.8
Đồ thị đường chuẩn gentiopicrin
32
3.9
Sắc ký đồ dung dịch chế phẩm kem Viemda AD
35



1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic dermatitis - AD), là
một bệnh viêm da mạn tính, bệnh thường xuất hiện ở trẻ em và có thể kéo dài
đến tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh có thể gặp ở người lớn [10]. Chàm thể
tạng là bệnh liên quan đến yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường. Ngày
nay, sự phát triển của xã hội, ô nhiễm của môi trường đã làm cho bệnh chàm
thể tạng có xu hướng tăng [6]. Điều trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu,
chủ yếu sử dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm và giảm các phản
ứng dị ứng. Tuy nhiên, nhóm thuốc này gây rất nhiều tác dụng phụ như: lệ
thuộc thuốc, dị ứng thuốc, viêm nhiễm mắc kèm, Do vậycần phát triển
thuốc có khả năng điều trị chàm thể tạng nhưng ít hoặc không có tác dụng
phụ.
Một trong các biện pháp đang được nghiên cứu hiện nay là các chế
phẩm từ dược liệu. Trong đó, Long đởm đã được biết đến trong y học cổ
truyền có tác dụng điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, và các bệnh viên
nhiễm khác [2], [4]. Chế phẩm kem Viemda AD được điều chế từ cao đặc
long đởm có thành phần chính là gentiopicrin đang được nghiên cứu để có thể
dùng trong điều trị chàm thể tạng. Để đưa thuốc vào sản xuất và sử dụng cần
đảm bảo yêu cầu chất lượng theo quy định.
Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và tiêu
chuẩn hóa một chế phẩm sản xuất từ dược liệu nói riêng chúng tôi thực hiện
đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm
kem Viemda AD bằng HPLC”
Với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích gentiopicrin trong Kem
viemda AD bằng HPLC
2. Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin trong chế
phẩm

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Long đởm
Long đởm thuộc họ long đởm (gentianaceae). Trong đó hay dùng trong
đông y là loài Gentiana lutea. Tại Việt Nam, có hai loài được sử dụng làm
thuốc là G. Loureirii phân bố ở cao nguyên Lang Biang - Đà Lạt - Lâm Đồng
và G. Rigescens có ở Tây Nguyên [2].
Vị thuốc Long đởm sử dụng thân rễ và rễ, thu hái vào mùa thu và mùa
xuân, mùa thu là tốt nhất. Đào lấy thân rễ và rễ, rửa sạch, phơi âm can, cắt
đoạn 2-3cm phơi hoặc sấy khô. Theo Muscre’,[3] hàm lượng gentiopicrin
trong rễ tươi đạt 2,48%, sấy bằng tủ sấy tỉ lệ này giảm còn 2,10%, rễ sấy trên
gác bếp còn 1,61%, rễ đã lên men chỉ còn lại vết. Do đó, thu hái rễ long đởm
cần rửa và sấy khô sớm (dưới 3 ngày) .
Thành phần hóa học trong rễ long đởm:
- Dược liệu họ gentianaceae thường chứa những iridoid glucosid và
monoterpen alcaloid. Iridoid chính (chiếm khoảng 85% iridoid) được xác định
là gentiopicrosid (gentiopicrin - C
16
H
20
O
9
), hàm lượng trong rễ khoảng 0,35%
[5].
- Ngoài ra còn có: gentioflavin, gentisin, scabrosid, triflorosid
Hàm lượng gentiocrosid phụ thuộc vào tuổi cây và thời gian thu hái,
cao nhất đạt 7,8% (lúc cây 3 tuổi), phần trên mặt đất đạt khoảng 1% [2].
Gentiopicrin có công thức hóa học như sau:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Gentiopicrin
3
Tên khoa học: (5R-trans)-5-Ethenyl-6-(-D-glucopyranosyloxy)-5,6-
dihydro-1H,3H-pyrano[3,4-c]pyran-1-one
Trọng lượng phân tử: 356.32
Tính chất:
Phân tử có màu trắng hoặc vàng nhạt thậm chí có kết tinh màu đỏ; dễ tan
trong nước, methanol hoặc ethanol; dễ biến sắc dưới ánh sáng mặt trời. Độ tan
trong nước: 43g/l (25
0
C), điểm chảy: 191
0
C, điểm sôi: 668
0
C.Kết tinh từ ethyl
acetat hoặc alcohol tuyệt đối. Điểm chảy 191°C. []
D
20 là 199° (ethanol). uv
max (c = 0,0285 g/l methanol): 270 nm (log  3.96) [17].
Công dụng của Long đởm đã được biết trong y học cổ truyền là thanh
nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thực, tiêu viêm, sưng mù [2], [4]. Trong y học
hiện đại, long đởm được biết đến là vị thuốc có tác dụng phòng sự lên men
(uống ít, nửa giờ trước bữa ăn), tác dụng kích thích sự bài tiết dịch tiêu hóa,
khỏe dạ dày [4], [1]. Các iridoid có tác dụng ức chế và thu gom các gốc tự do
như peroxyd, superoxyd, do đó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm oxy hóa
tế bào, đẩy nhanh quá trình nhu mô hóa tế bào, đồng thời giảm nồng độ men
gan. Ngoài ra, các alcaloid trong long đởm có tác dụng kháng khuẩn, chống
viêm do tác dụng hạ thấp men chuyển hóa amin, trên thực tế có thể dùng
trong dự phòng viêm màng não truyền nhiễm, nước sắc long đởm có tác dụng
ức chế trực khuẩn mủ xanh, tụ cầu vàng, trực khuẩn lị [4], [1], [12].

Gentiopicrin trong dược liệu cũng như trong chế phẩm được một số nhà
khoa học nghiên cứu và xác định bằng phương pháp sắc ký.
Yin H, Zhao Q, Sun FM, An T. [16] đã xác định gentiopicrin trong
Gentianamacrophylla bằng sắc ký lớp mỏng sau đó hiện màu bằng thuốc thử
Dragendorff và HPLC.
4
Huang Z, Lin S. [15] đã xác định gentiopicrin trong biyanqingdugranulae
bằng SPE-HPLC. Quá trình tách dùng cột Hypersil ODS 2 (250 mm x 4,6
mm, 5 µm). Pha động gồm methanol - nước (30:70, tt/tt). Lưu lượng dòng 1
ml/phút. Bước sóng phát hiện 275 nm. Kết quả cho thấy có sự tương quan
tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ gentiopicrin trong khoảng
0,02235 – 0,1676 mg/ml, độ thu hồi trung bình 98,1% với RSD 1,7%.
Dược điển Trung Quốc 2010 [13], phân tích gentiopicrin bằng cột C18
(250 x 4,6 cm, 5 µm), pha động gồm methanol – nước (25:75), bước sóng
phát hiện 270 nm. Yêu cầu số đĩa lý thuyết phải lớn hơn 3000 tính theo pic
gentiopicrin.
1.2 Kem Viemda AD
KemViemda AD được bào chế theo phương pháp nhũ hóa với thành
phần như sau [8]:
Bảng 1.1: Thành phần công thức kem Viemda AD
Stt Thành phần Khối lượng (g)
1 Cao đặc Long Đởm (Hàm lượng gentiopicrin
không dưới 2% cao khô tuyệt đối)
100
2 Dầu parafin 120
3 Alcol béo 80
4 Glycerin stearic 50
5 Acid stearat 50
6 Propylen glycol 50
7 Tá dược khác vừa đủ 1000

Kem Viemda AD đóng gói trong tuýp nhựa, 20 g, kín. Hình 1, trình
bày nhãn và chế phẩm đóng gói kem Viemda AD [8].

5


TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ HÀ NỘI
VIEMDA AD CREAM

Kem bôi ngoài da 20gam
(Sản phẩm nghiên cứu, không bán)
TCCS:
SĐK: SKS: HD:
Thành phần:
Cao đặc Long đở
m
10g
Tá dượ
c vđ
100g
Công dụng:
Chống viêm, dị ứng,
nhiễm khuẩn ngoài
da.
Cách dùng:
Bôi kem lên vùng tổn
thương ngày 3-4 lần
Chỉ định:
Viêm da cơ địa

(chàm, eczema),
mẩn ngứa, viêm da
nhiễm khuẩn, côn
trùng đốt

Chống chỉ định:
Mẫn cảm với thành
phần của thuốc.
Để xa tầm tay trẻ
em















Nhãn Tuýp kem Viemda AD
Hình 1.2: Chế phẩm kem Viemda AD

1.3 Tổng quan về phương pháp HPLC
1.3.1 Khái niệm [12]

- Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành
phần trong một hỗn hợp. Sự tách các chất được dựa trên sự phân chia
6
khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào
nhau: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh được cố định trên cột hay
trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển
qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác
pha tĩnh-pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các
thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân
tích định tính, định lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatoghraphy - HPLC) là một nhóm các phương pháp hóa lý dựa
vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc
và không đồng tan với nhau. Pha động là một chất lỏng chảy qua cột
với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất rắn dưới
dạng hạt mịn hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hóa học.
1.3.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.2.1 Hệ thống cấp pha động [12]
Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai hay nhiều dung môi hòa tan
vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Trước khi chạy mẫu,
pha động cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động. Khí
hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền.
Có hai cách dùng để rửa giải pha động:
- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình
sắc ký.
- Gradient: Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4 loại
được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần dung
môi, lưu lượng dòng hoặc cả tỷ lệ các thành phần và lưu lượng
dòng thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định.
1.3.2.2 Bơm cao áp [12]

7
Hệ thống bơm có chức năng tạo áp suất cao đẩy pha động từ bình dung
môi qua hệ thống sắc ký. Hệ thống bơm hiện nay được điều khiển bằng máy
tính có thể lập chương trình để thay đổi tỉ lệ các thành phần pha động theo
yêu cầu (sắc ký gradient).
Bơm HPLC cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Tạo được áp suất cao từ 3000-6000 psi (250-500 atm)
- Lưu lượng bơm khoảng 0,1-10 ml/phút
- Không bị ăn mòn bởi các thành phần pha động
- Có tốc độ bơm không đổi.
Các máy sắc ký hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn.
1.3.2.3 Bộ phận tiêm mẫu [12]
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu bằng hệ
thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu
(tiêm tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động. Sai số tiêm mẫu dùng van khoảng
0,5%.
1.3.2.4 Cột sắc ký [12]
Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh chiều dài
10-30 cm, thường có cột tách và cột bảo vệ.
Hạt nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm, gần đây có loại cột nhỏ đường kính
trong1-2 mm, dài 3-7,5 cm, loại này nhồi được cỡ hạt 1,7-5 µm. Cột loại này
có ưu điểm là chạy sắc ký tốn ít dung môi và ít thời gian hơn. Có thể điều
nhiệt để tăng nhiệt độ cột nhằm tăng hiệu quả phân tách tốt hơn nhưng hiếm
khi tiến hành ở nhiệt độ cao hơn 60
o
C vì ở nhiệt độ này có thể làm suy giảm
hiệu lực cột và bay hơi pha động. Chất nhồi cột thường là silicagel có tráng
một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một số chất hữu cơ).
Ngoài ra còn có các chất nhồi khác từ nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi
ion.

8
Cột bảo vệ được lắp trước cột sắc ký để loại các tạp chất có trong mẫu
phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký,
được nhồi hạt cùng loại.
1.3.2.5 Detector [12]
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín
hiệu ghi trên sắc ký đồ. Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:
- Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích đối với detector hấp thụ UV
hoặc huỳnh quang.
- Tính chất chung của chất phân tích trong pha động như detector
chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện.
Detector trong sắc ký cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc
nồng độ thấp
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
- Khoảng tuyến tính rộng
- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
1.3.2.6 Hệ thu nhận và xử lý số liệu [12]
Máy tính kết nối trực tiếp với hệ thống sắc ký, có phần mềm điều khiển
xử lý các số liệu về thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý
thuyết
1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng:
 Thời gian lưu t
R
[12]
Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ
nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, đến detector và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc
tiêm mẫu đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt

9
định tính của quá trình sắc ký, nó có giá trị xác định đối với một chất khi tiến
hành sắc ký trong điều kiện xác định. Ngoài ra trong một phép phân tích còn
thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: t
R
’
= t
R
– t
0.
Trong đó: t
0
là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, nếu t
R
quá lớn thì pic doãng, thời gian
phân tích kéo dài.
 Hệ số phân bố K [12]
Là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng, xác định tốc độ trung bình của
mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột:
 =
C

C



Trong đó:

C
s
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh
C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động
 Hệ số dung lượng k
’
[12]
Cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được
tính theo sức chứa của cột:
Lý thuyết: k
’
=K ×




Thực nghiệm: k
’
=






Trong đó:
V
S

: Thể tích mẫu trong pha tĩnh
V
M
: Thể tích mẫu trong pha động
k
’
: tối ưu trong khoảng 1 ≤ k
’
≤ 8. k
'
nhỏ thì t
R
nhỏ, k
'
lớn thì pic doãng.
 Hệ số chọn lọc α [9]
Đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B,
10
người ta dùng hệ số chọn lọc α:
α =




=


′



′
=

()



()



Quy ước: Chất B là chất lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1
Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0
 Hệ số đối xứng pic AF
AF =




Trong đó:
W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic
đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic
Yêu cầu: trong định lượng yêu cầu hệ số bất đối xứng pic nằm trong
khoảng 0,8 - 2
 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
N= 16 (




)
2
hoặc N= 5,54 (



/
)
2

Trong đó:
W
1/2
: là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
W: là chiều rộng pic đo ở đáy pic
 Độ phân giải R
s

R
s
=
.(
()

()
)





=
,.(
()

()
)

/

/


Trong đó:
t
(R)A
; t
(R)B
: là thời gian lưu của hai pic liền kề nhau A và B
11
W
A
; W
B
: là chiều rộng của pic đo ở đáy pic
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: R
s
> 1; giá trị tối ưu R
s
= 1,5 trong định tính. Trong định
lượng yêu cầu R
S
2,0
1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong sắc ký phân bố
1.3.4.1 Pha tĩnh
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi trong cột, là yếu tố quan trọng quyết định
sự tách của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha
động sắc ký phân bố được chia làm 2 loại:
 Sắc ký phân bố pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân
cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc dẫn chất các chất
phân cực.
 Sắc ký phân bố pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất
phân tích thường là các chất không phân cực hoặc ít phân cực.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose hay trên mạch carbon). Trong sắc ký phân
bố pha đảo, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.3: cấu tạo hạt silica đã silan hóa
Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan.

- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc alkylamin –CH
2
NH
2
,
alkyl nitril –CH
2
CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân bố pha thuận để
12
phân tích các chất phân cực.
- R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng
cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R
của mạch carbon (C
2
;C
8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm
OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt pha tĩnh trở
nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký phân bố pha
đảo để phân tích các chất không phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn
có những nhóm –OH tự do gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký
tùy theo môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH <2), thì có sự phân ly các nhóm
ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích
không thể tương tác với cột.
Trong môi trường base (pH >7), các nhóm OH trong cột sẽ
tương tác với chất tan có tính base. Trong tương tác này, khác với kiểu

tương tác của chất tan với nhóm –SiC
18
dẫn đến hiện tượng cùng một chất
nhưng sẽ có các đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả
giảm đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các
hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH
3
)
3
hoặc hexamethyl disizan (ít
sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Cấu trúc liên kết được trình
bày như sau:
13

Hình 1.4: cấu trúc cột LC-DB
Có cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH
3
)
2
C
18
bằng các
nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những
nhóm –OH, được trình bày như hình dưới đây:

Hình 1.5: cấu trúc cột có gốc isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên mạch C
18

một số nhóm
phân cực để tăng thêm độ phân cực của mạch C
18
làm cột có khả năng tách
chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh.
1.3.4.2 Lựa chọn pha động
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là
yếu tố thứ 2 quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký
pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril
hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng
nhỏ acid, muối, kiềm hoặc dung môi hữu cơ không phân cực.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng đến rất nhiều thông số của quá trình
14
sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R
s
, độ rộng pic nên
việc phân tích và lựa chọn pha động là rất quan trọng.
Yêu cầu của pha động:
 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian
 Hòa tan chất cần phân tích
 Có độ tinh khiết cao
 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
 Có tính kinh tế và ít gây ô nhiễm môi trường.
Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả:
 Bản chất của dung môi để pha pha động
 Thành phần các chất trong pha động
 pH của pha động
 Tốc độ dòng của pha động

Chọn đệm-pH:
Trong sắc ký phân bố mà chất tan có tính acid hoặc base thường phải
sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích
hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.
Tốc độ dòng của pha động:
Để tăng hiệu lực tách của quá trình sắc ký, phải chọn tốc độ dòng pha
động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu
quả cao về thời gian và kinh tế. Khi tốc độ dòng quá nhỏ có thể tách tốt hơn
nhưng thời gian phân tích kéo dài và doãng pic.
1.3.4.3 Lựa chọn detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi
detector chuyển thành tín hiệu và ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là
detector UV-VIS, sử dụng để phát hiện các chất trong công thức có nhóm
mang màu (nối đôi liên hợp, vòng thơm, ). Tùy theo chất cần phân tích mà
15
người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau dựa vào bước sóng cực đại
của chất phân tích trong điều kiện tiến hành sắc ký đã khảo sát.
1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC
1.3.5.1 Cách đánh giá pic
- Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic sử dụng máy tính với phần
mềm phù hợp hoặc máy tích phân.
- Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo
chiều cao của pic chỉ thích hợp khi pic cân đối, sắc nét.
1.3.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên
tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao và diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký:
 Phương pháp chuẩn ngoại
 Phương pháp chuẩn nội
 Phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được
phân tích trong cùng một điều kiện. Nồng độ (hàm lượng) của chất chưa biết
được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra
từ đường chuẩn hoặc so sánh với chuẩn có nồng độ tương đương.
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn
ngoại, chuẩn hóa một điểm và đường chuẩn:
- Chuẩn hóa một điểm: chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất
thử. Tiến hành song song với nhau. Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn,
chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ chất thử.
- Phương pháp đường chuẩn: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có
nồng độ tăng dần, thường từ 5 - 7 điểm. Tiến hành sắc ký. Thiết lập mối
16
tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ chuẩn
Điều kiện áp dụng phương pháp đường chuẩn là trong khoảng nồng độ
khảo sát, chứng minh luôn có tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân
tích với diện tích pic của chất phân tích.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG - HÓA CHẤT - THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chế phẩm Kem VIEMDA AD của Trường Cao Đẳng Y Hà Nội (tuyp
20g, sản xuất ngày 25/04/2013, hạn dùng 2 năm kể từ ngày sản xuất) thuộc đề
tài cấp thành phố Hà Nội.
2.2 THIẾT BỊ - HÓA CHẤT
2.2.1 Thiết bị:
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent của Mỹ.
- Máy lắc xoáy tốc độ caoVortex mixer VM 300 của Đài Loan.
- Máy lắc siêu âm: Bandelin Sonorex super RK 106 của Đức.
- Nồi đun cách thủy Wisecircu của Tây Ban Nha.

- Cân phân tích Metller Toledo (d = 0,01 mg) của Thụy sĩvà Sartorius (d
= 0,1 mg) của Đức.
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức 10 ml, ống nghiệm 10ml, cốc có mỏ
100ml, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh.
- Màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm, giấy lọc, bơm tiêm, giấy bạc.
2.2.2 Hóa chất:
1. Gentiopicrin chuẩn của Trung Quốc (hàm lượng 100%)
2. MeOH loại dùng cho máy HPLC của Meck Damstaat, Đức
3. Nước cất hai lần
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
17
2.3.1 Nghiên cứu điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp:
 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu:
- Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu: dựa vào độ tan của
gentiopicrin, thành phần chế phẩm và khảo sát thực tế để lựa
chọn dung môi thích hợp.
- Khảo sát thời gian chiết dùng máy siêu âm để hòa tan mẫu: tiến
hành ở các thời gian khác nhau, và giữ nguyên các thông số
khác. Lựa chọn thời gian siêu âm cho tỷ lệ chiết hoạt chất cao
nhất.
- Khảo sát điều kiện cách thủy: tiến hành thay đổi thời gian cách
thủy ở các nhiệt độ khác nhau, lựa chọn thời gian và nhiệt độ cho
hiệu suất chiết hoạt chất cao nhất.
 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký:
- Cột sắc ký: Inertsil ODS-3 là cột thường dùng trong sắc ký
- Khảo sát và lựa chọn pha động, tỉ lệ pha động, lưu lượng dòng
- Bước sóng phát hiện: quét phổ hấp thụ của pic gentiopicrin trên sắc
ký đồ lựa chọn bước sóng cực đại.
Các thông số của quá trình sắc ký được lựa chọn sau khi tiến hành thay
đổi, lựa chọn điều kiện thuận tiện cho quá trình xử lý mẫu, cho sắc ký đồ ổn

định, áp suất cột đảm bảo, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý.
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm Kem
Viemda AD.
 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
 Thẩm định phương pháp phân tíchvới các tiêu chí thẩm định:
- Tính đặc hiệu của phương pháp
- Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Gentiopicrin và đáp ứng phân
tích (diện tích pic)