Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






ĐỖ TRỌNG ĐẠI


XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG HPLC









HÀ NỘI - 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ TRỌNG ĐẠI


XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG HPLC

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi.
2. TS. Đào Danh Sơn.
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất.
2. Công ty cổ phần tập đoàn Merap.









HÀ NỘI - 2014

LỜI CÁM ƠN
***


Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Lê Đình
Chi
, đồng cảm ơn TS.
Đào Danh Sơn
, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Đồng thời, tôi cũng chân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên
trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội; Công ty cổ
phần tập đoàn Merap đã tận tình giúp đỡ và tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin phép được gửi những tình cảm sâu sắc và lòng biết ơn vô hạn
tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014




Đỗ Trọng Đại
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu/

Chữ viết tắt
Tiếng Anh Tiếng Việt
1 HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
2 US-FDA United State-Food Drug
Administration
Cục quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ
3 TĐSH Bioequivalence (BE) Tương đương sinh học
4 SKD Bioavailability (BA) Sinh khả dụng
5 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn
6 RSD Relative Standard
Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
7 SKĐ HPLC chromatography Sắc ký đồ
8 CFC Cefaclor
9 SSS Stock Standard Solution Chuẩn gốc
10 WSS Working Standard
Solution
Chuẩn làm việc
11 QC Quality Control Samples Mẫu kiểm tra chất lượng
12 HQC High Quality Control
Samples
Mẫu kiểm tra nồng độ cao
13 MQC Middle Quality Control
Samples
Mẫu kiểm tra nồng độ
trung bình
14 LQC Low Quality Control

Samples
Mẫu kiểm tra nồng độ
thấp
15 LLOQ Lower Limit of
Quantification
Nồng độ dưới giới hạn
định lượng
16 ULOQ Upper Limit of
Quantification
Nồng độ trên giới hạn
định lượng
17 MeCN Acetonitril
18 MeOH Methanol
19 TB Mean Trung bình


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN…………………………………… 2
1.1 Tổng quan về cefaclor…………………………………

2
1.1.1 Công thức hóa học……………………………………… 2
1.1.2 Tính chất Hóa Lý………………………………………… 2
1.1.3 Dược lý, Dược động học ………………………………… 2
1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…… 4
1.2.1 Cơ sở lý thuyết…………………………………………… 4
1.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC………………… 5
1.2.3 Ứng dụng của HPLC…………………………………… 7

1.2.4 Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học… 8
1.3 Thẩm đinh phương pháp pháp định lượng dược chất
trong dịch sinh học………………………………………
11
1.3.1 Khái niệm………………………………………………… 11
1.3.2 Nội dungthẩm định phương pháp…………………………

11
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………….

15
2.1 Điều kiện thực nghiệm và nội dung nghiên cứu………. 15
2.1.1 Điều kiện thực nghiệm…………………………………… 15
2.1.1.1

Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……………………………….
15
2.1.1.2

Dụng cụ, thiết bị……………………………………………………….
16
2.1.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………… 17
2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………

17
2.2.1
Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor

17

2.2.2
Xây dựng quy trình chiết cefaclor trong huyết tương…

19
2.2.3
Xác định điều kiện sắc ký…………………………………………

21
2.2.4
Thẩm định phương pháp phân tích…………………………….

19
2.2.4.1

Tính đặc hiệu chọn lọc………………………………………………
19
2.2.4.2

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……………………………

19
2.2.4.3

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……………………………
20
2.2.4.4

Độ đúng, độ lặp lại…………………………………………………….
20
2.2.4.5

Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)………………………………….
20
2.2.4.6

Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương………………

20
2.3 Phương pháp xử lý kết quả…………………………… 21
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……………… 22
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng…………………… 22
3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký…………………………………

22
3.1.2
Khảo sát phương pháp chiết tách cefaclor………………….
25
3.2 Thẩm đinh phương pháp phân tích…………………….

27
3.2.1 Độ đặc hiệu chọn lọc……………………………………

27
3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……………………… 28
3.2.3 Giới hạn định lượng dưới LLOQ………………………… 30
3.2.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày………… 31
3.2.5 Hiệu suất chiết…………………………………………….

33
3.2.6 Độ ổn định của mẫu huyết tương………………………… 34

3.3 Bàn luận…………………………………………………. 36
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………… 38
4.1 Kết luận………………………………… 38
4.2 Đề xuất…………………………………………………

39
PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

Bảng 1.1 Một số quy trình định lượng cefaclor (trong dịch sinh học) bằng
HPLC
Bảng 2.1. Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.2. Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.5. Cấu hịnh hệ thống HPLC Agilents 1260
Bảng 2.6. Cách chuẩn bị đường chuẩn mẫu huyết tương tự tạo
Bảng 2.7. Cách chuẩn bị mẫu QC
Bảng 3.1. Bảng so sánh các thông số của píc cefaclor trong dung dịch 10
µg/mL với các chất tạo cặp ion khác nhau
Bảng 3.2. Sự tương quan giữa nồng độ và đáp ứng píc của cefaclor trong
huyết tương
Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn dưới LLOQ
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày
Bảng 3.6.Kết quả khảo sát hiệu suất chiết cefaclor

Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ
đông - rã
Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương thời gian ngắn
Bảng 3.9. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài






DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
Hình 1. 1 .Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Hình 3.1. SKĐ chuẩn cefaclor 10 µg/mL ở nồng độ đệm 10 mM trong pha
động
Hình 3.2. SKĐ chuẩn cefaclor 10 µg/mL ở nồng độ đệm 50 mM trong pha
động
Hình 3.3. SKĐ chuẩn cefaclor nồng độ 10 µg/mL không có chất tạo cặp ion
Hình 3.4. SKĐ chuẩn cefaclor nồng độ 10 µg/mL có chất tạo cặp ion: (a)
tetrabutyl ammonium hydroxgen sulfat; (b) triethanolamin
Hinh 3.5 Sắc ký đồ mẫu huyết tương tủa protein bằng MeCN
Hình 3.6.a. SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit pechloric.
Hình 3.6.b. SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit tricloroacetic.
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu (a) huyết tương trắng và (b) cefaclor 10,0 µg/mL
trong huyết tương trắng
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng
độ và đáp ứng píc của cefaclor trong huyết tương

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cefaclor là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ hai, có nhiều ưu điểm
nổi bật như tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-) và bền với các men -
lactamase của vi khuẩn, do vậy có thể tránh được sự đề kháng
thuốc Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm
với thuốc, điều trị viêm nhiễm trùng đường hô hấp trên, nhiễm khuẩn tai mũi
họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang [5]. Ngày nay cefaclor đã được
sản xuất trong nước dưới dạng bào chế viên nang như viên nang cefaclor
Stada 250 mg của công ty STADA Việt Nam, viên nang Mekocefaclor 250
công ty Cổ phần Hóa-Dược Mekophar Cefaclor cũng là thuốc có tên trong
Danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu thử tương đương sinh học
khi đăng ký thuốc do Bộ y tế ban hành [6].
Tại Việt Nam đã công bố quy trình xử lý mẫu và định lượng cefaclor
trong huyết tương người tình nguyện bằng HPLC [8]. Tuy nhiên, việc áp
dụng tại quy mô phòng thí nghiệm vừa và nhỏ, cơ sở vật chất còn thiếu thốn
tại các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Mỹ phẩm tuyến tỉnh và các công ty sản
xuất thuốc trong nước là còn khó khăn. Hướng tới mục tiêu nâng cao chất
lượng và hiệu quả điều trị của thuốc cefaclor sản xuất trong nước thì các đơn
vị kiểm nghiệm đều muốn được chủ động phân tích, giám sát nồng độ
cefaclor trong huyết tương người.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu, khảo sát điều kiện sắc ký và định lượng
cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng.

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Cefaclor
1.1.1. Công thức hóa học
- Công thức phân tử: C
15
H
14
ClN
3
O
4
S.H
2
O [9],[11]
- Khối lượng phân tử: 367,8g/mol [ 9]
- Công thức cấu tạo:[9],[13]



- Tên khoa học: (6R,7R)-7-[[(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3-
chloro-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic monohydrat
[16]
1.1.2. Tính chất hóa lý
- Bột trắng hoặc vàng nhẹ.
- Khó tan trong nước (10g/L), thực tế không tan trong methanol và
methylene chlorid, chloroform, benzene (0,5g/L).
- Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 220
0
C
- Hằng số phân ly: pKa1= 1,5; pKa2 = 7,17;
- Hệ số phân bố dầu nước logP (octanol/nước) = 0,35 [12] nên việc chiết

cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng là khó khăn.
- Cefaclor hấp thu bước sóng UV có λ
max
= 263 nm, do vậy có thể định
lượng cefaclor bằng HPLC với detector tử ngoại [3],[12],[20].
- Ổn định pH 2,5 - 4,5 [7],[9],[12],[16].
1.1.3. Dược lý, dược động học
*Dược động học:
Cefaclor được hấp thu tốt khi uống lúc đói. Với liều 250 mg và 500 mg
uống lúc đói, C
max
đạt 13 µg/mL sau 60 phút.
3

- Thời gian bán thải của cefaclor trong huyết tương từ 30-60 phút. Chức
năng thận mất hoàn toàn thì thời gián bán thải kéo dài thêm 2, 3 đến 22, 8 giờ.
- Cefaclor phân bố rộng rãi khắp cơ thể, đi qua nhau thai và bài tiết trong
sữa mẹ ở nồng độ thấp.
- Cefaclor thải trừ nhanh qua thận, 85% liều sử dụng được thải trừ qua
nước tiểu ở dạng không đổi trong vòng 8giờ, phần lớn thải trừ trong 2 giờ đầu.
- Tương tác thuốc: Probenecid làm chậm bài tiết cefaclor, một số ít
cefaclor được đào thải qua thẩm tách máu [4], [5], [12].
*Chỉ định
- Điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc
biệt sau khi dùng các kháng sinh thông thường mà thất bại.
- Viêm tai giữa cấp, viêm xoang cấpm viêm họng viêm amidan tái phát.
- Viêm phổ viêm phế quản mạn trong đợt diễn biến.
- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới không biến chứng (viêm bàng
quang).
- Nhiễm khuẩn da và phần mềm do Staphylococus aureus nhạy cảm và

Streptococus pyogenes [4], [5].
*Chống chỉ định
- Người có tiền sử dị ứng với kháng sinh nhóm cephalosporin [4], [5].
*Thận trọng
- Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với penicillin.
- Thận trọng khi chỉ định cho bệnh nhân có tiền sử mẫn cảm với
cephalosporin, đặc biệt là với cefaclor và penecilin.
- Người bệnh có tiền sử đường tiêu hóa, đặc biệt là viêm đại tràng.
- Dùng cefaclor dài ngày có thể gây viêm đại tràng giả mạc [4].
*Liều điều trị và các dụng
- Dùng đường uống, vào lúc đói
+ Người lớn:
- Viêm họng, viêm amidan, viêm phế quản, nhiễm khuẩn da và mô mềm,
nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới: 500-1000mg/lần x ngày 2 lần hoặc
500mg/lần/ngày 3 lần
4

- Nhiễm khuần nặng: 1g/lần/ngày 3 lần
- Liều giới hạn kê đơn: 4g/ngày [4], [5].
+Trẻ em:
- Liều thường dùng : 20-40mg/kg cân nặng/2-3 lần/ngày
- Viêm tai giữa: 40mg/kg/cân nặng/2-3 lần/ngày, liều tổng cộng trong
ngày không quá 1g.
- Liều tố đa: 1,5g/ngày [4], [5].
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1]
1.2.1. Cơ sở lý thuyết [1]
HPLC còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao, là kỹ thuật phân tích dựa
trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ
dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến ái lực tương đối của các chất

này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ
thuộc vào các yếu tố như bản chất của pha tĩnh, độ phân cực của pha động,
pH, nhiệt độ…
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi Detector và sẽ được
chuyển sang bộ phận xử lý kết quả [1]
* Nguyên tắc cấu tạo chung của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao











Hình 1. 1 .Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm Bộ phận tiêm mẫu


Bộ phận điều nhiệt
Cột sắc
ký
Detector
Hệ thống thu nhận
dữ liệu
(PC/Recorder)

Thải
5

Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silica. Nhóm - OH trên bề
mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan:





R là mạch thẳng có 8 hoặc 18 carbon hoặc các nhóm hữu cơ khác như
amin mạch thẳng, nitril, hydrocarbon thơm. Tính phân cực của pha tĩnh thay
đổi tùy theo gốc R [1]
Phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh mà sắc
ký được phân thành sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo:
- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, còn pha động là dung môi ít phân
cực như: hexan, iso propyl ether…Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu
tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu giảm dần.
- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, còn pha động là dung môi
phân cực hơn như : acetonitrile, methanol,…Chất phân cực nhất được rửa giải
đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần [1]
1.2.2. Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC
*Hệ số phân bố (partition coefficient):
Là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh với nồng độ của nó trong
pha động:
 =





Trong đó: K: hệ số phân bố.
C
s:
nồng độ chất tan trong pha tĩnh
C
m
: nồng độ chất tan trong pha động
Hệ số phân bố khác nhau càng nhiều, khả năng tách 2 chất càng lớn.
*Thời gian lưu (retention time, t
R
):
Thời gian lưu của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử tới khi
xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ, là thông tin về mặt định tính. Trong
-HCl
6

một điều kiện sắc ký nhất định, thời gian lưu là một hằng số đối với một chất
tan. Nếu t
R
nhỏ quá thì sự tách kém, nếu t
R
quá lớn thì píc bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài [1].
*Thể tích lưu (retention volum, V
R
):
V
R
của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra khỏi cột từ

lúc bắt đầu tiếm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ.
V
R
= t
R
x F
Trong đó: V
R
: thể tích lưu F: lưu lượng của pha động
t
R
: thời gian lưu
Trên thực tế, thể tích chết là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm
mẫu đến khi ra khỏi hệ thống.
*Hệ số dung lượng (capacity factor, k’):
Là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha
động:
′ =
ượấĩ
ượấđộ

Hệ số dung lượng là một thông số không phụ thuộc vào lưu lượng pha
động F và chiều dài của cột mà chỉ phụ thuộc vào bản chất chất cần phân tích
và đặc tính của pha tĩnh và pha động.
Trị số tối ưu 1≤ k’ ≤ 5; nếu k’> 5 thời gian phân tích sẽ kéo dài, đỉnh bị
dãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp.
*Độ chọn lọc (selectivity,

):
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất A, B.

 =




=






=







Theo quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên

>1
Để tách riêng 2 chất thường chọn

trong khoảng 1,05 - 2,0.
Nếu

quá lớn thời gian phân tích sẽ dài [1], [2]
*Số đĩa lý thuyết N:

Hiệu lực cột được đo bằng số đĩa lý thuyết N của cột
N = 16.




2
= 5.54.


/

2
7

Trong đó: W: chiều rộng đáy píc
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
Số đĩa lý thuyết N càng lớn thì hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp)
*Độ phân giải (resolution - R
s
):
Là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên cùng một
điều kiện sắc ký, được tính theo công thức
R
s
=
()


Trong đó: t
R1,
t
R2
: thời gian lưu của 2 đỉnh 1 và 2
W
1:
chiều rộng của đỉnh 1
W
2
: chiều rộng của đỉnh 2
Độ phân giải R
s
thể hiện 2 yếu tố như độ nhọn và khoảng cách giữa các
đỉnh pic, thường yêu cầu R
s
≥ 5.
1.2.3. Ứng dụng của HPLC:
*Ứng dụng trong phân tích định tính:
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu hoặc vị trí trên pha tĩnh của chất phân
tích; cùng với các điều kiện sắc ký là những thông tin giúp người phân tích
khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.
Định tính bằng sắc ký phối kết hợp với quang phổ hồng ngoại hoặc kết
hợp với khối phổ để cho kết quả chắc chắn hơn. Phổ sắc ký nhận biết sự vắng
mặt của một chất nào đó trong hỗn hợp; do đó ứng dụng để kiểm tra tạp chất
treong mẫu. Trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng
chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiên.
*Ứng dụng trong phân tích định lượng:
Đây là ứng dụng quan trọng nhất của HPLC giúp định lượng nhiều loại
hợp chất khác nhau. Có thể xác định nồng độ chưa biết của một chất trong

dung dịch đã biết trước nồng độ, hay xác định cấu trúc của hoạt chất khi ghép
nối với khối phổ MS/MS… Ngày nay HPLC còn cho phép định lượng các
thành phần có hàm lượng thấp, thậm chí các thành phần dưới dạng vết trong
hỗn hợp phức tạp.
Các phương pháp định lượng gồm có:
8

+ Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn)
+ Phương pháp thêm đường chuẩn
+ Phương pháp nội chuẩn
+ Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
1.2.4. Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học
Những năm vừa qua đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm
mục đích phân tích cefaclor trong dịch sinh học, dựa trên kỹ thuật HPLC.
Dưới đây là một vài phương pháp xử lý mẫu tiêu biểu và điều kiện sắc ký
kèm theo của các tác giả mà chúng tôi đã tham khảo, liệt kê:

9


Tài
liệu
Điều kiện sắc ký
Xử lý mẫu
Cột, Detector

Pha động
[12]
Supelcosil LC
-18 (4,6 x 250

mm; 5 µm).
Detector UV
265 nm
MeOH : THF : Đệm
(1g
Na.heptansulfonat +
5ml T.E.A/1L nước,
chỉnh pH 2,3) =
(16:4:80).
Tốc độ dòng: 1,4
mL/phút
Chiết SPE
Hoạt hóa: 2mL MeOH +
2mL nước cất. Rửa giải:
MeOH bốc hơi dung môi
 hòa tan cắn trong pha
động.
[12]
Cột RP 18
(4x 100mm,
7µm )

MeCN:đệm
phosphate pH 7 =
(10: 90).
Tốc độ dòng : 1,0
mL/phút
Tạo dẫn xuất sau cột
với Fluorescamin
trong MeCN

Tủa protein với axit
Tricloroacetic 6%lắc, ly
tâm 4000vòng/phút x 10phút
 Lấy dịch nổi Tiêm sắc
ký.
[19]
Cột ODS
Rp
(150 x 4,6
mm, 5µm)
Tạo dẫn xuất
trước cột.
A.CN: 0.1M
Triethylamin (pH
8.5) = ( 35:65).
Tốc độ dòng: 0,6
mL/phút

40µL mẫu+ 20 µL IS
(chuẩn nội) + 25µL pyridine
= 50µL 35 mM
CIPIC/80
0
ly tâmlọc,tiêm
mẫu
[11]

Cột phân tích
C18
MS/MS

MeOH - Nước - Acid
fomic = (80:20: 1)
Tốc độ dòng : 0,5
mL/phút
Tủa protein với hỗn hợp acid
fomic: MeOH. Chiết SPE
0,5mL plasma + 100 µL IS
Chiết SPE
[8]
Cột Gemini
C18, 5 µm;
Pha động: MeCN:
MeOH: Đệm
Tủa protein bằng acid
pecloric, chiết loại tạp bằng
10


Bảng 1.1: Một số quy trình định lượng cefaclor trong dịch sinh học bằng
HPLC
Nhận xét:
- Điều kiện sắc ký:
Đa số các tài liệu tham khảo đều sử dụng cột sắc ký pha đảo như C8,
C18 với hệ dung môi pha động chứa MeOH hoặc MeCN phối hợp với hệ đệm
phosphate, phân tích trên máy HPLC - Detector UV. Với điều kiện sắc ký như
trên có thể dễ dàng áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm kiểm nghiệm vừa và
nhỏ của các nhà máy xí nghiệp sản xuất cũng như trung tâm kiểm nghiệm
dược mỹ phẩm tuyến tỉnh.
- Phương pháp xử lý mẫu:
Do cefaclor có hệ số cân bằng dầu nước bằng 0,35 nên khó dùng

phương pháp chiết cefaclor trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ vì vậy
các tài liệu tham khảo trên đều xử lý mẫu với kỹ thuật cơ bản là loại protein
trong huyết tương bằng các tác nhân tạo tủa như MeOH, hỗn hợp acid fomic:
MeOH, acid pecloric, hay axit tricloroacetic….
250 x 4mm.
Detector :
UV
263 nm
phosphate pH3,1
(chứa TBAH)
tỷ lệ 10:14:76.
Tốc độ dòng: 1,0
mL/phút.
CH
2
Cl
2
. Dịch thu được tiêm
sắc ký
[14]
Cột : C18 (4,6
x 250 mm)
Detector: UV
254 nm

Pha động: Đệm
NaH
2
PO
4

0.2 M (pH
3.2 ± 0.05 điều chỉnh
bởi axit phosphoric):
MeOH tỷ lệ 70:30.
Tốc độ dòng: 1,0
mL/phút

Tủa protein. 500 µl huyết
tương +, 100 µl IS (cefaclor)
nồng độ (5 µg/mL) + 400 µL
MeOH ly tâm, lấy dịch lọc
tiêm sắc ký
11

Đối với quy trình xử lý mẫu bằng chiết SPE, hoặc tạo dẫn xuất trước và
sau cột, sử dụng detector quang hóa… tương đối phức tạp và chi phí cao.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta việc áp dụng phương pháp này
thực tế còn gặp nhiều khó khăn do ít phòng thí nghiệm có đủ kinh phí để mua
cột, trang thiết bị chiết pha rắn và kinh nghiệm sử dụng phương pháp chiết cột
pha rắn còn hạn chế.
Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố,
chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng cef trong huyết tương
người chọn quy trình xử lý mẫu là tủa protein và sử dụng máy HPLC detector
UV có độ đúng, độ chính xác phù hợp với nghiên cứu.
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học [7], [8], [19]
1.3.1. Khái niệm:
Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất sinh học là quá trình
xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng
của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng
phân tích thực tế.

Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như
lượng mẫu ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (các muối
vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, nên
phương pháp phân tích phải được thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin
cậy. [7]
1.3.2. Nội dung thẩm định phương pháp
*Tính chọn lọc - đặc hiệu
Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất
phân tích khi có mặt các thành phần khác, có thể là tạp chất, hoặc các thành
phần cản trở khác. Trong HPLC, tính chọn lọc - đặc hiệu được thể hiện khi
kết quảthu được trên sắc ký đồ (từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha
trong mẫu trắng) cho thấy píc của chất cần phân tích được phân tách hoàn
toàn với các píc tạp [8], [19]

12

*Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của píc và
nồng độ chất phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này thường được
đánh giá bằng phương pháp hồi huy, thu được từ phương pháp hồi quy tuyến
tính. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong
một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. [8], [19]
Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng
một mẫu dịch sinh học.
Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu
cần phân tích. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến
tính, có hệ số tương quan r ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:
- Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ điểm gần
LOQ được chấp nhận ≥ 20%.
- Có ít nhất 4/6 điểm trong dãy chuẩn đạt tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LOQ

và điểm có nồng độ cao nhất.
*Giới hạn định lượng dưới LLOQ
Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhạy, độ chính xác, độ đúng của
phương pháp.
Giá trị LLOQ thường nằm trong khoảng 1/30-1/10 C
max

Nồng độ chuẩn thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhậ LLOQ khi thỏa
mãn các điều kiện sau:
- Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng
tại cùng thời gian lưu
- Độ đúng phải bằng 80% - 120% so với nồng độ thực.
- Độ chính xác thể hiện bằng giá trị RSD % khi tiến hành phân tích trên
ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20% [8], [19]
*Độ đúng- Độ chính xác:
Độ đúng của phương pháp: là giá trị phản ánh độ gần sát của kết quả phân
tích thu được bằng phương pháp với giá trị của chất phân tích này.Giá trị này
nằm trong khoảng 85% - 115%, riêng tại các điểm gần giới hạn dưới có thể
trong khoảng 80%-120%.
13

Độ chính xác của phương pháp: là mức độ thống nhất giữa các kết quả
riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng
nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn
tương đối (RSD). [8], [9].
Yêu cầu:
- Đối với độ chính xác trong ngày thì giá trị RSD % phải ≤15%.
- Đối với độ chính xác giữa các ngày thì giá trị RSD % phải ≤15%.
*Hiệu suất chiết:
Hiệu suất chiết hay tỉ lệ thu hồi hoạt chất là tỷ số giữa đáp ứng/nồng độ

hoạt chất có trong mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có
cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách.
Yêu cầu:
- Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi hiệu suất chiết
không quá 11% và không thấp hô 30%.
- Giá trị RSD % giữa các đáp ứng của chất phân tích trong các mẫu kiểm
tra (QC) chiết tách ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
- Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khác nhau quá ± 15%.
*Độ ổn định
Đánh giá độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học cần được đánh
giá trong quá trình lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu. Để đánh giá độ ổn định,
người ta thường so sánh kết quả phân tích mẫu bảo quản với các mẫu mới
chuẩn bị. Kết quả so sánh được đánh giá theo thống kê dựa trên độ tin cậy áp
dụng trong đánh giá sinh học. Trong thẩm định phương pháp cần xác định các
loại độ ổn định sau đây:
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở nhiệt độ
phòng, độ ổn định khi bảo quản dài ngày, độ ổn định khi pha loãng.
- Độ ổn định trong mẫu huyết tương bao gồm
+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông: Nồng độ thuốc trong mẫu
sau 3 chu kỳ “đông - rã “ phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15%
RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%
14

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu
thử sau khi đã chiết tách: Nồng nộ thuốc trong mẫu được xử lý sau khi được
bảo quan một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ
xử lý ngay không quá 15% và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở
mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong thời gian dự
định: Nồng độ cefaclor trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định

lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
+ Độ ổn đinh trong quá trình tiêm mẫu [8], [19].

15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ

PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Điều kiện thực nghiệm và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Điều kiện thực nghiệm
2.1.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất và thuốc thử dùng trong nghiên
cứu được trình bày ở các bảng 2.1, 2.2 và 2.3
Bảng 2.1. Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên Mục đích
sử dụng
Nơi sản
xuất
Số kiểm
soát
Hàm lượng
nguyên
trạng
Độ
ẩm
1 Cefaclor Chuẩn VKNT TW 0309042 94,71% 5,06%

Bảng 2.2. Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên
Độ tinh
khiết
Nơi sản xuất
1 Methanol HPLC J.T.Baker, Mỹ
2 Acetonitril HPLC J.T.Baker, Mỹ
3 Trichloroacetic acid P.A Merck, Đức
4 Perchloric acid P.A Merck, Đức
5 Natri dihydrophosphat P.A Merck, Đức
6
Tetrabutyl ammonium hydroxyl
sulfat
P.A

Acorss, Mỹ
7 Triethanol amin P.A

Merck, Đức


16

Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu
STT

Lô mẫu Nơi cung cấp Hạn dùng Bảo quản
1 13PN07839

Viện huyết học-
truyền máu TW
24/06/2014 -40
0
C
2 13PN07842

Viện huyết học-
truyền máu TW
30/08/2014 -40
0
C

2.1.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị chính và cấu hình hệ thống HPLC-Agilents dùng trong nghiên
cứu được trình bày ở các bảng 2.4 và 2.5
Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên
STT

Tên thiết bị Mục đích sử dụng Nơi sản xuất
1 Cân phân tích M204 Cân chuẩn
Metler toledo,
Thụy sĩ
2
Máy ly tâm
ROTOFIX 32A
Ly tâm mẫu Hettich, Đức

3 Máy lắc xoáy Trộn mẫu IKA, Đức
4 Tủ lạnh sâu - 40
0
C Bảo quản mẫu
Sanyo DMF-236,
Nhật
5 Tủ lạnh Bảo quản mẫu
Samsung, Hàn
Quốc
6 Micopipette Eppendrof, Đức
7
Ống chiết thủy tinh,
dung tích 10 mL
Chuẩn bị mẫu, chiếu
mẫu
Trung Quốc
8
Đầu típ cho
micropipette 0-200 µL
và 0-1000 µ L
Chuẩn bị mẫu, chuyển
mẫu
Trung Quốc
9
Bình định mức,
Pipette chính xác,
thủy tinh Class A
Chuẩn bị mẫu, pha
loãng mẫu
Trung Quốc

Bảng 2.5. Cấu hịnh hệ thống HPLC Agilents 1260
17

STT

Bộ phận Model Nơi sản xuất
1 Bơm 4 kênh 1260 Agilents, Đức
2 Autosampler 1260 Agilents, Đức
3 Detector UV-Vis-DAD 1260 Agilents, Đức
4 Buồng ổn nhiệt cột 1260 Agilents, Đức
5
Phần mềm điều khiển&xử lý kết
quả
1260 Agilents, Đức

2.1.2. Nội dung nghiên cứu
* Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng phương
pháp HPLC:
- Lựa chọn điều kiện chiết tách cefaclor: tiến hành khảo sát các cách xử
lý mẫu như: tủa protein trên các mẫu huyết tương tự tạo để lựa chọn phương
pháp xử lý mẫu thích hợp dựa trên các nguyên lý chiết mẫu.
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo
phân tách cefaclor ra khỏi các thành phần tạp trong huyết tương, cho phép
định lượng cefaclor có trong mẫu với nồng độ chính xác thích hợp.
* Thẩm định phương pháp phân tích về các chỉ tiêu:
Tính đặc hiệu, chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn
định lượng, hiệu suất chiết, độ ổn định của cefaclor trong huyết tương trong
các điều kiện (rã đông, cách ngày…).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor

- Mẫu huyết tương trắng không chứa cefaclor.
- Mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor: Pha dung dịch chuẩn
gốc cefaclor nồng độ chính xác khoảng 1000 µg/mL trong MeOH. Từ dung
dịch chuẩn gốc chuẩn bị 6 dung dịch chuẩn làm việc WSS
1
, WSS
2
, WSS
6

trong MeOH 50% có nồng độ chính xác khoảng 5, 10, 30, 50, 100 và 300
µg/mL.