Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT
ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT
ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Ths.Nguyễn Trung Hiếu
2.Ths. Bùi Đình Sơn
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Hóa phân tích- Trường ĐH Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths.Nguyễn Trung Hiếu và
Ths. Bùi Đình Sơn là những gười thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn , giúp đỡ
em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm , giúp đỡ của thầy cô, anh chị kỹ thuật viên
bộ môn Hóa Phân Tích –Độc Chất Trường Đại Học Dược Hà Nội trong thời gian
làm thực nghi
ệm tại bộ môn.
Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô đã tạo
cho em những điều kiện tốt nhất để hoàn thành khóa học tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn Gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ em trong
suốt thời gian em học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn!


Hà Nội, Tháng 5 năm 2014.
Sinh viên

Nguyễn Thị
Hiền
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Nội dung Trang
Bảng 1 Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường. 7
Bảng 2 Một số kỹ thuật định lượng Azithromycin bằng HPLC. 8

Bảng 3 Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của
các dẫn chất Benzen
12
Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21
Bảng 3.1 Kết quả về cường độ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong
HCl ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm 30 phút
28
Bảng 3.2 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR
10mg/L trong HCl 9M, ở nhiệt độ 21-23
0
C , Δλ=30nm tại các
thời điểm khảo sát
30
Bảng 3.3 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR
10mg/L trong HCl 9M ở các nhiệt độ khác nhau tại các thời
điểm khảo sát.
32
Bảng 3.4 Kết quả về cường độ huỳnh quang của các dung dịch dẫn
xuất AZTR ở các Δλ khác nhau tại thời điểm 30 phút.
35
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 37
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ chính xác. 40
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 42
Bảng 3.8 Kết quả định lượng một số chế phẩm chứa AZTR trên thị
trường
44

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
MeOH : Methanol.
AZTR : Azithromycin.

Kl/kl : Khối lượng / khối lượng.
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối.
TB: Trung bình.
Gr (+): Vi khuẩn gram dương.
Gr (-) : Vi khuẩn gram âm.
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Nội dung Trang
Hình 1 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang- Tăng cường độ huỳnh
quang bằng hệ thống gương
13
Hình 2 Sơ đồ giải thích quét đồng bộ phổ huỳnh quang 19
Hình 3.1

Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M
Δλ=30nm, t=21-23
0
C, tại thời điểm 30 phút
25
Hình 3.2 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong H
2
SO
4
9M,
Δλ=30nm, t=21-23
0
C, tại thời điểm 30 phút

26
Hình 3.3 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HNO
3
9M,
Δλ=30nm, t=21-23
0
C, tại thời điểm 30 phút
26
Hình 3.4 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 7M,
Δλ=30nm t=21-23
0
C tại thời điểm 30 phút
28
Hình 3.5 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 5M,
Δλ=30nm t=21-23
0
C tại thời điểm 30 phút
28
Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng nồng độ acid HCl lên cường độ
huỳnh quang của dẫn xuất AZTR
29
Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tạo dẫn xuất lên
cường độ huỳnh quang của dẫn xuất AZTR
30
Hình 3.8 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,
t=40
0
C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút
31
Hình 3.9 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,

t=55
0
C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút
32
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên
cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR 10mg/L trong HCl
9M.
33
Hình 3.11 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở
t=21-23
0
C, Δλ=40nm, tại thời điểm 30 phút
34
Hình 3.12 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở
t=21-23
0
C, Δλ=35nm, tại thời điểm 30 phút
34
hình 3.13 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở
t=21-23
0
C, Δλ=50nm, tại thời điểm 30 phút
34
Hình 3.14
Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của
Δ
λ
=
λ
em

-
λ
ex
lên cường độ
huỳnh quang của dung dịch AZTR ở các nồng độ khác nhau trong
HCl 9M.

35
Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và cường
độ huỳnh quang của dung dịch AZTR trong HCl 9M.

38
1

ĐẶT VẤN ĐỀ.
Năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra và sau đó phân tách được
penicillin đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc điều trị các bệnh nhiễm
trùng, mà trước đó được coi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử
vong trên thế giới đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển trong đó có
Việt Nam. Trong suốt những thập kỷ tiếp theo và cho đến tận ngày nay cùng
với sự phát triển của khoa học - kỹ thuật nhiều kháng sinh mới đã được tìm
ra và cho hiệu quả điều trị ngày càng cao. Trong đó có Azithromycin (1980)
là một kháng sinh macrolid bán tổng hợp được sử dụng để điều trị các loại
nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn đường hô hấp, da, đường tiêu hóa, đường
sinh dục, đặc biệt AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn nội bào, các vi khuẩn
cơ hội ở bệnh nhân bị nhiễm HIV [4], [15]. Hiện nay trên thị trường dược
phẩm Việt Nam có nhiều loại biệt dược chứa AZTR có xuất xứ khác nhau cả
trong và ngoài nước. Để kiểm tra, kiểm soát , đảm bảo chất lượng của từng
loại biệt dược đang lưu hành trên thị trường và để việc sử dụng được đúng
liều, đảm bảo hiệu quả điều trị thì công tác kiểm nghiệm định lượng AZTR

trong chế phẩm đóng một vai trò rất quan trọng.
Vì vậy nhằm mục đích cung cấp một phương pháp định lượng AZTR
đơn giản, nhanh chóng , có độ chính xác cao và tại Việt Nam chưa được sử
dụng nhiều, để đảm bảo công tác kiểm nghiệm, đảm bảo chất lượng chúng tôi
thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng và khảo sát hàm
lƣợng Azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ
huỳnh quang” với các mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng AZTR bằng kỹ thuật quét đồng bộ
phổ huỳnh quang.
- Thẩm định phương pháp vừa xây dựng
2

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng một vài chế phẩm
chứa AZTR đang lưu hành trên thị trường.

3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ AZITHROMYCIN (AZTR).
1.1.1. Công thức cấu tạo [5]

- Công thức phân tử: C
38
H
72
N
2
O
12

- Khối lượng phân tử: 748,98
- Tên khoa học : 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA
1.1.2.Tính chất vật lý và hóa học
 Tính chất vật lý [4],[5]
- Bột kết tinh màu trắng đến trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng
- Thực tế không tan trong nước rất dễ tan trong methanol, ethanol,
methylen clorid, aceton, chloroform, dung dịch acid hydroclorid loãng…
- Năng suất quay cực từ -45
0
đến -49

0
(dung dịch 20mg/ml trong
Ethanol).
- Trong cấu trúc của AZTR không có các dây nối liên hợp và các nhóm
mang màu nên nó hấp thụ UV kém và không phát huỳnh quang.
 Tính chất hóa học [4], [5]
- Tính base do các Osamin (đường amin) gây ra và một nhóm amin như
là một phần của vòng macrolacton có pKa= 8,74.
- Tạo được muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ.
- Phản ứng màu với acid HCl, H
2
SO
4
. Hòa tan AZTR vào HCl đặc để
yên khoảng 10 phút thấy xuất hiện màu vàng.
4

1.1.3. Dƣợc động học.[4], [15]
Hấp thu:
- AZTR hấp thu nhanh, sinh khả dụng đường uống đạt 40%
- Thức ăn làm giảm hấp thu AZTR khoảng 50%,
- Sau khi dùng thuốc , nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong vòng từ
2 đến 3 giờ.
Phân bố:
- Phân bố rộng rãi trong cơ thể, chủ yếu vào các mô như phổi, amidan,
tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt, đại thực bào…. Với nồng độ cao hơn trong máu
nhiều lần (khoảng 50 lần nồng độ tối đa tìm thấy trong huyết tương) , vì vậy
dùng để điều trị nhiễm khuẩn nội bào tốt.
- Tuy nhiên nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp.
Chuyển hóa- Thải trừ:

- Một lượng nhỏ AZTR bị khử metyl trong gan, được đào thải qua mật ở
dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa.
- Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72h ở dạng
không biến đổi.
1.1.4. Cơ chế tác dụng [4]
- AZTR tác động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom ở vi
khuẩn và qua đó ngăn cản quá trình tổng hợp protein của chúng.
1.1.5.Tác dụng dƣợc lý (phổ tác dụng) [4], [15]
- Là một kháng sinh có hoạt phổ rộng thuộc nhóm Macrolid, được gọi là
azalid. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn mạnh.
- Có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram(+) như: Streptococcus,
Pneumococcus, Staphylococcus aureus….
5

- Một số chủng vi khuẩn khác cũng rất nhạy cảm với AZTR như
Corynebacterium diphteriae, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus,
Propionibacterium acnes…
- AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn Gr(-) như Haemophilus influenza,
Neissria gonorrhoeae, Legionella pneumophilia…Và có tác dụng vừa phải
trên các vi khuẩn Gr(-) như Escheria coli, Salmonella enteritidis, Salmonella
typhi, Klebsiella spp….
- Nhìn chung AZTR tác dụng trên vi khuẩn Gr(+) yếu hơn 1 chút so với
Erythromycin nhưng lại mạnh hơn trên 1 số vi khuẩn Gr(-) trong đó có
Haemophilus.
1.1.6.Tác dụng không mong muốn.[4]
- AZTR dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp
nhất là chứng rối loạn tiêu hóa (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn
nôn, đau bụng, nôn, ỉa chảy, đầy hơi, nhưng thường nhẹ và ít xảy ra hơn
Erythromycin.
- AZTR gây ảnh hưởng trên thính giác: Sử dụng lâu dài AZTR ở liều cao

có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh.
1.1.7.Sự kháng AZTR của vi khuẩn.[4]
- Các nghiên cứu tiến hành ở Việt Nam cho thấy các loài vi khuẩn
Gram(+) như Streptococcus,Pneumococcus,Staphylococcus aureus…. Kháng
nhóm Macrolid ở tỷ lệ khoảng 40%.
- Các chủng Gr(-) thường kháng AZTR là Proteus, Serratia,
Pseudomonas aeruginosa, Morganella
- Các chủng vi sinh vật kháng Erythromycin cũng có thể kháng AZTR
như những chủng Gr(+) ở trên, kể cả loài Enterococcus và hầu hết các chủng
Staphylococcus kháng Methicilin đã hoàn toàn kháng AZTR.

6

1.1.8. Chỉ định[4], [15]
AZTR được chỉ định trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn
nhạy cảm với thuốc như:
- Nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới: Viêm phổi, viêm phế quản, viêm tai
giữa, các nhiễm khuẩn da và mô mềm.
- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên: Viêm xoang, viêm họng, viêm
amidan
- Nhiễm khuẩn đường sinh dục chưa biến chứng do Chlamydia
trachomatis, Nesseria gonorrhoeae… không đa kháng.
1.1.9. Liều dùng, cách dùng[4], [15]
- Dùng mỗi ngày 1 lần, uống trước khi ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ
- Người lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với
liều 250mg/ ngày
- Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ là 10mg/kg thể trọng, và 4 ngày tiếp theo là
5mg/kg thể trọng, ngày uống 1 lần.
1.1.10.Các dạng bào chế của AZTR [10], [11]
- Viên nang AZTR (dạng dihydrat) tương đương AZTR 250mg và

500mg
- Viên nén và viên nén bao phim AZTR 125mg, 250mg, 500mg.
- Viên nén phân tán tương đương AZTR 100mg
- Bột pha hỗn dịch uống AZTR dạng dihydrat tương đương 200mg
AZTR/ 5ml
- Lọ bột đông khô pha tiêm 500mg.


7

1.1.11. Một số chế phẩm chứa AZTR lƣu hành trên thị trƣờng [10]
Bảng 1.Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường.
STT
Tên chế phẩm
Dạng bào chế
Hàm
lượng
Hãng sản xuất
1
Azicine
Viên nang
Gói bột uống
250mg
Công ty TNHH LD
STADA Việt Nam
2
Zitromax
Zithromax IV
Viên nén
Bột pha tiêm tĩnh

mạch
500mg
Pfizer
3
Azithromycin
Viên nén bao phim
250mg
DHG Pharma
4
Zymycin
Viên nang
250mg
Ampharco
5
Azithromycin
Viên nang
250mg
Traphaco
6
Azithral
Viên nén phân tán
Bột pha truyền tĩnh
mạch
250mg,
500mg
Alembic
7
Aziphar
Viên nang
Viên nén bao phim

250mg
500mg
Mekophar
8
Azibiotic
Viên nén bao phim
500mg
Tenamyd
Canada
9
Medpro-
Azithromycin
Viên nén
500mg
Cipla Medpro
10
Cipla-
Azithromycin
Bột pha tiêm
500mg
Cipla Medpro
11
Azimon
Viên nén
500mg
Monicopharma
12
Azicern
Viên nén
250mg

500mg
Chandigarh-India
13
AZibey
Viên nén
500mg
Kolkata- India
8


1.1.12.Một số phƣơng pháp định lƣợng AZTR trong chế phẩm.
 Kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC.[3], [6]
Bảng 2.Một số kỹ thuật định lượng Azithromycin bằng HPLC.
TLTK
[3]
[8]
Cột
C8 (25cm x 4.6mm x
0.5µm)
C18 (15cm x 4.6mm x 5µm)
Pha động
MeOH : Nước : Amoniac
đặc= 80: 19.9: 0.1
Đệm phosphat : MeCN : MeOH
= 35:45:20 , điều chỉnh tới pH=8
bằng NH
4
OH, H
3
PO

4

Detector
Quang phổ tử ngoại đặt ở
bước sóng 215nm
Quang phổ tử ngoại đặt ở bước
sóng 215nm
Thể tích tiêm
20µL
20µL
Tốc độ dòng
1.5mL/ phút
1.5mL/phút
Chuẩn bị
dung dịch
mẫu và
chuẩn
Được pha ở nồng độ
khoảng 1mg/mL trong
pha động
Được pha ở nồng độ khoảng
2mg/mL trong pha động
9


 Phƣơng pháp vi sinh vật [9], [13]
- Khuếch tán trên thạch,nuôi cấy và chế tạo nhũ dịch, đo đường kính
vòng vô khuẩn, có thể dùng các vi khuẩn chỉ thị: Bacillus pumilus NCTC (B)
63202, Bacilus pumilus NCTC 8241 , Micrococcus luteus ATCC 9341.[9]
- Xác định hoạt lực của azithromycin trong dung dịch ophthalmic .Pha

loãng dung dịch azithromycin ophthalmic bằng đệm kali phosphat pH 8 tới
nồng độ thích hợp. Định lượng trên môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ
thị là Bacillus subtilis ATCC 9372. [13]
 Phƣơng pháp tạo cặp ion chiết – đo quang.[7]
- Thuốc thử : Dung dịch lục bromocresol CT2
- Môi trường tạo cặp ion: Dung dịch đệm acetat pH=4.5
- Dung môi chiết: Cloroform CHCl
3

- Khoảng nồng độ AZTR áp dụng là 5-20 µg/ml.
1.2. TỔNG QUAN VỀ HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT QUÉT ĐỒNG
BỘ PHỔ HUỲNH QUANG.
1.2.1.Huỳnh quang.
1.2.1.1.Định nghĩa[1], [2]
Phổ huỳnh quang là phương pháp phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ
năng lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức
xạ kích thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng
năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang F của một dung dịch pha loãng tỉ lệ thuận với
nồng độ C (mol/l) trong điều kiện xác định khi cường độ và bước sóng của
bức xạ kích thích là hằng số.
F= K . I
0
. . C . L
Trong đó:
10

K: hằng số
I
0

: cường độ của bức xạ kích thích
: hiệu suất huỳnh quang = Số photon phát xạ : Số photon hấp thụ
(0 < <1)
hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích.
Rút gọn lại ta có: F= K’ . C với K’= K . I
0
. . L
Chú ý: Việc đo phổ huỳnh quang chỉ nên tiến hành với dung dịch loãng
C < 10
-4
M

để tránh ảnh hưởng suy giảm cường độ của bức xạ phát ra.
1.2.1.2.Đặc điểm của huỳnh quang [1]
- Thời gian huỳnh quang rất ngắn chỉ khoảng 10
-9
giây và sự huỳnh
quang là đa hướng.
- Hiệu suất huỳnh quang là một đặc trưng vật lí cho biết khả năng huỳnh
quang của một chất và được tính bằng tỷ số giữa số photon phát xạ và số
photon hấp thụ.
- Cường độ huỳnh quang là hiệu suất thực nghiệm hoạt tính phát huỳnh
quang của một chất khi nó được kích thích do được hấp thụ một bức xạ thích
hợp. Cường độ huỳnh quang tỷ lệ với cường độ bức xạ kích thích, hiệu suất
huỳnh quang và nồng độ chất phát huỳnh quang.
- Vì huỳnh quang đa hướng nên cường độ huỳnh quang đo dược chỉ là
một phần của cường độ huỳnh quang và người ta thường đo theo phương
vuông góc với chùm tia kích thích.
- Nói chung cường độ huỳnh quang phụ thuộc tuyến tính với nồng độ ở
vùng nồng độ thấp. Sự tuyến tính mất đi khi độ truyền qua chỉ còn dưới 90%

(hay mật độ quang vượt quá 0.05)
- Trong huỳnh quang người ta dùng 2 khái niệm phổ phát xạ huỳnh
quang (
em
) và phổ kích thích huỳnh quang (
ex
)
11

 Phổ phát xạ huỳnh quang là đường biểu diễn mối quan hệ giữa
cường độ huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa và bước sóng của bức xạ
huỳnh quang.
 Phổ kích thích phát huỳnh quang là đường biểu diễn cường độ
hấp thụ của một chất và bước sóng của bức xạ hấp thụ.
 Vì chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái dao động ở cả trạng
thái cơ bản lẫn kích thích nên phổ kích thích và phổ phát xạ huỳnh quang của
các hợp chất thường đối xứng theo kiểu ảnh gương.
1.2.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng huỳnh quang.
 Các yếu tố về cấu trúc [1]
- Huỳnh quang cộng hưởng thường gặp với nguyên tử và một số trường
hợp với phân tử.
- Các hợp chất có chứa vòng thơm đều thuận lợi cho phát huỳnh quang.
Các hợp chất carbonyl mạch thẳng hay vòng no cũng như các cấu trúc có nối
đôi liên hợp cũng có huỳnh quang nhưng không đáng kể so với hợp chất
thơm.
- Hầu hết các Hidrocacbon thơm đều phát huỳnh quang trong dung dịch.
Hiệu quả huỳnh quang tăng lên cùng với số vòng thơm và độ tập trung của
chúng trong cấu trúc.
- Những dị vòng đơn giản nhất như pyridine, furan, thiophen,
pyrrol…không có huỳnh quang phân tử nhưng các cấu trúc ngưng tụ nhiều

vòng như quinolin, isoquinolin, indol…lại thường có huỳnh quang.
- Các nhóm thế trên vòng thơm có thể gây ra sự dịch chuyển bước sóng
cực đại kích thích và thay đổi tương ứng các pic trong phổ huỳnh quang.


12

Bảng 3. Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của các dẫn
chất Benzen
Hợp chất
Cường độ
huỳnh quang
tương đối
Hợp chất
Cường độ
huỳnh quang
tương đối
Benzen
10
Ion phenolat
10
Toluen
17
Anisol
20
Fluorobenzen
10
Anilin
20
Chlorobenzen

7
Ion Anilinic
0
Bromobenzen
5
Acid Benzoic
3
Iodobenzen
0
Benzonitril
20
Phenol
18
Nitrobenzen
0

- Thực nghiệm chỉ ra rằng hiệu ứng không gian cũng có ảnh hưởng đến
khả năng huỳnh quang.
- Ảnh hưởng của sự cố định cấu trúc làm tăng khả năng huỳnh quang
của một số tác nhân tạo phức khi chúng liên kết với các ion kim loại. Ví dụ
cường độ huỳnh quang của 8-hydroxyquinolin bé hơn rất nhiều so với phức
chất của nó với kẽm.
- Nói chung các chất vô cơ không có huỳnh quang trừ một số nguyên tố
đất hiếm và các lantanit.
 Các hợp chất hữu cơ có khả năng phát huỳnh quang chủ yếu là các
hydrocacbon thơm, các alpha diceton.
 Các hợp chất đa vòng làm cho bước sóng của huỳnh quang dài hơn
13

 Những nhóm cho electron như: -OH, -NH

2
, alkyl, aryl….làm tăng
hiệu suất huỳnh quang.
 Ngược lại những nhóm hút huỳnh quang như: NO
2
, -COOH, Cl,
Br….lại làm giảm hiệu suất huỳnh quang.
 Các yếu tố về môi trƣờng [1]
- Nhiệt độ và dung môi là 2 yếu tố có ảnh hưởng đến huỳnh quang. Hầu
hết với các phân tử hiệu suất huỳnh quang giảm khi nhiệt độ tăng bởi vì khi
đó tần suất va chạm tăng lên và sự hồi phục do va chạm dễ dàng xảy ra.
- Việc giảm độ nhớt của dung môi cũng cho kết quả tương tự.
1.2.1.4. Máy quang phổ huỳnh quang.[1], [2]
Bé ®¬n s¾c
kÝch thÝch
Bé ®¬n s¾c
huúnh quang
Nguån s¸ng
G-¬ng

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang - Tăng cường độ huỳnh
quang bằng hệ thống gương.
Cấu tạo máy.
- Nguồn sáng trong máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo ra các
bức xạ kích thích cần thiết. Nguồn sáng thường dùng là đền xeon có khả năng
phát ra bức xạ trong khoảng rộng 200-800nm nhưng phổ bức xạ không đều
các tia UV mạnh hơn các tia VIS. Ngoài ra còn dùng nguồn cảm ứng laser,
đền xeon kém nhạy hơn laser.
- Bộ phận đơn sắc hóa gồm 2 phần đơn sắc hóa bức xạ kích thích và đơn
sắc hóa bức xạ huỳnh quang.Hai bộ phận này bố trí trước và sau buồng đo. Sử

dụng cách tử.
14

- Buồng đo được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín
hiệu vuông góc với nhau.
- Cuvet thường dùng thạch anh (1x1 cm) có 4 mặt trong suốt vuông góc
với nhau .
- Để tăng tín hiệu đến bộ phận thu người ta có thể bố trí thêm gương ở
phía đối diện.
Chuẩn hóa máy.
- Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với
chất chuẩn.
- Tiến hành chuẩn máy theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất máy.
1.2.1.5.Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang.[1], [2]
 Định tính [1]
Có thể dựa vào bước sóng kích thích và bước sóng huỳnh quang phát ra
để định tính các hợp chất.
 Định lƣợng [1], [2]
- Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Có thể đo
trực tiếp cường độ huỳnh quang và dùng phương pháp so sánh để định lượng
các hợp chất phát huỳnh quang mạnh.
- Với những chất không phát huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử
không huỳnh quang để tạo ra các dẫn chất có huỳnh quang hay dùng các
thuốc thử có huỳnh quang để đo và sử dụng các cách xử lý thích hợp.
- Đối với các hợp chất vô cơ, phương pháp đo huỳnh quang có thể được
tiến hành theo 2 kiểu trực tiếp và gián tiếp.
 Phương pháp trực tiếp dựa trên phản ứng của chất phân tích với
một tác nhân tạo phức để tạo ra phức chất phát huỳnh quang.
15

 Phương pháp gián tiếp dựa trên sự giảm hay tắt huỳnh quang của
tác nhân do sự phản ứng của nó với chất phân tích. Sự tắt huỳnh quang đầu
tiên được sử dụng để phát hiện các anion.
- Để xác định các cation, tác nhân sử dụng để đo huỳnh quang chủ yếu là
các hợp chất thơm có 2 hay nhiều nhóm cho khả năng huỳnh quang mà cho
phản ứng tạo phức với ion kim loại như 8-hydroxyquinolin.Với hầu hết tác
nhân này cation được chiết vào dung dịch của tác nhân trong CHCl
3
trước khi
đo huỳnh quang.
- Đối với hợp chất hữu cơ và hóa sinh: Phương pháp huỳnh quang có
ứng dụng quan trọng trong phân tích thực phẩm, dược phẩm, mẫu bệnh phẩm,
các hợp chất tự nhiên nhờ độ nhậy và chọn lọc của phương pháp.
 Nhiều nghiên cứu tiến hành với các chất hữu cơ như Adenin,
Cystein, Indol, Tryptophan…
 Các thuốc như Adrenalin, Penicillin, Phenobarbital, Procain,….
 Với các Enzym, coenzyme và các hợp chất tự nhiên như các
Alkaloid, Flavonoid,…
Một số phƣơng pháp dùng trong định lƣợng bằng huỳnh quang.
Nguyên tắc của các phương pháp định lượng: Nồng độ của chất phân
tích tỷ lệ với cường độ huỳnh quang.
Trong khuôn khổ của khóa luận này chúng tôi xin trình bày cụ thể 3
phương pháp định lượng bằng huỳnh quang là: Phương pháp so sánh, phương
pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn.
 Phƣơng pháp so sánh .
- Mẫu thử luôn luôn được so sánh với mẫu chuẩn
- Kiểm tra vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang và điều chỉnh độ
nhạy của thiết bị với độ pha loãng thích hợp của dung dịch chuẩn.
16

- Ghi cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và các
mẫu trắng tương ứng của chúng.
- Tính toán nồng độ của dung dịch thử:
C
X
= C
S
. (I
X
– I
OX
) / ( I
S
– I
OS
)
Ở đây:
C
X
: nồng độ của dung dịch thử
C
S:
nồng độ của dung dịch chuẩn
I
X
: trị số đo được của dung dịch thử
I
S
: trị số đo được của dung dịch chuẩn
I

OX
và I
OS
: trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng.
Vùng trong đó cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của chất
thường rất hẹp, cho nên tỉ số (I
X
– I
OX
) / ( I
S
– I
OS
) phải không được < 0,5 và
không >2,0. Nếu tỉ số không nằm trong khoảng trên thì phải điều chỉnh nồng
độ và tiến hành đo lại.
 Phƣơng pháp đƣờng chuẩn.
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến
hành quét đồng bộ phổ huỳnh quang. Đáp ứng thu được là cường độ huỳnh
quang. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa cường độ huỳnh quang và
nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đồ thị để tính toán nông
độ của chất cần phân tích theo 2 cách:
- Áp dữ kiện cường độ huỳnh quang của chất thử vào đường chuẩn sẽ
suy ra được nồng độ của nó.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa cường
độ huỳnh quang với nồng độ chất cần phân tích.
Y = aC
x
+ b
Trong đó:

Y là cường độ huỳnh quang
17

C
x
: Nồng độ chất thử
a, b là hệ số của phương trình hồi quy.
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử:
C
x
=
 Phƣơng pháp thêm chuẩn.
Chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và chất chuẩn
với lượng tăng dần. Tiến hành quét đồng bộ phổ huỳnh quang. Dựng đường
chuẩn tương quan giữa cường độ huỳnh quang tổng (thử + chuẩn) với nồng
độ của chất chuẩn thêm vào. Giao điểm của trục hoành và đường chuẩn kéo
dài chính là nồng độ của chất cần phân tích.
 Một số ứng dụng khác [1]
- Phương pháp huỳnh quang còn được sử dụng trong bộ phận phát hiện
của sắc ký lỏng vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó, với nguồn sáng laser
có thể phát hiện tới 10
-12
gam.
- Đối với huỳnh quang nguyên tử có thể áp dụng để định lượng các kim
loại có vạch cộng hưởng có cường độ đủ mạnh hay định lượng gián tiếp một
số chất hữu cơ có tham gia tạo phức như S, P, các halogen… Huỳnh quang
nguyên tử có thể đạt đến độ nhạy 10
-9
gam.
18

1.2.2. Quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]
1.2.2.1.Khái niệm về quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]
Trong huỳnh quang thông thường phổ phát xạ thu được bằng cách quét
các phát xạ đơn sắc ở các bước sóng phát xạ khác nhau, giữ đơn sác kích
thích ở 1 bước sóng cụ thể.
Còn phổ kích thích thu được bằng cách quét các đơn sắc kích thích ở các
bước sóng kích thích khác nhau, giữ đơn sắc phát xạ không đổi ở 1 bước sóng
cụ thể.
Khi quét cả 2 đơn sắc cùng lúc được gọi là quét đồng bộ phổ huỳnh
quang
Nếu tốc độ quét là hằng số cho cả 2 đơn sắc kích thích và phát xạ và
=
em
-
ex
được giữ cố định thì được gọi là kỹ thuật liên tục bước sóng.
Đây là kĩ thuật đơn giản và được sử dụng thường xuyên nhất trong các chế
độ đồng bộ. Vì vậy nói chung quét đồng bộ phổ huỳnh quang đề cập đến kỹ
thuật này.
1.2.2.2.Đặc điểm của quét đồng bộ phổ huỳnh quang [14]
- Thu hẹp dải quang phổ: Tác động này chủ yếu là kết quả của việc đồng
thời tăng hoặc giảm cường độ huỳnh quang
- Đơn giản hóa phổ phát xạ :Trong phổ huỳnh quang thông thường tại 1
bước sóng kích thích cố định (
ex
) nó có thể tăng cường độ của tất cả dải phổ
cùng một lúc. Nhưng quét đồng bộ cho phép pic có cường độ cao nhất được
tăng lên một cách chọn lọc nếu sử dụng một phù hợp.
- Co phạm vi quang phổ: trong một phân tích có thể không quan tâm đến

toàn bộ phổ, nhiều phần không được xem xét, sự có mặt của chúng chỉ gây
nhầm lẫn trong phổ do trùng với sự phát xạ của các thành phần khác trong
mẫu.

19

1.2.2.3.Ƣu điểm của quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14].
- Khả năng phân tích hỗn hợp phức tạp đa thành phần mà không cần tách
riêng từng thành phần là cực kì hữu ích và là một ưu điểm quan trọng của
quét đồng bộ phổ huỳnh quang. Đo huỳnh quang đơn bước sóng để phân tích
mẫu phức tạp nhiều thành phần có sự chồng chéo của phổ phát xạ hoặc kích
thích. Điều này có thể khắc phục bằng cách sử dụng quét đồng bộ, nơi chồng
chéo của phổ có thể được giảm thiểu.
- Phổ huỳnh quang thu được trong quét đồng bộ có độ phân giải cao hơn,
rõ ràng, sắc nét và đỉnh pic hẹp hơn so với phổ huỳnh quang thông thường.
Điều này có thể được giải thích dựa vào hình 2 dưới đây.
- Với những chất phát huỳnh quang yếu quét đồng bộ làm tăng cường độ
huỳnh quang.

Hình 2. Sơ đồ giải thích về quét đồng bộ phổ huỳnh quang.
Một phân tử có thể được kích thích trong toàn bộ dải hấp thụ bắt đầu từ
bước sóng A
1
, A
2
……A
9
và cho huỳnh quang trong khoảng bước sóng F
1
,

F
2
…… F
9
.