Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ QUẾ

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ
PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT
TƯƠNG BẰNG HPLC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUẾ

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ
PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT
TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS. Nguyễn Thị Kim Oanh
Nơi thực hiện:
Trung tâm tương đương sinh học -viện kiểm
nghiệm thuốc trung ương


HÀ NỘI - 2013



LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS
Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá tương đương
sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ
môn Dược lực – Trường đại học Dược Hà Nội, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới DS Nguyễn Thị Kim Oanh –
người thầy, người chị đã giúp đỡ, hướng dẫn và truyền cho tôi những kinh nghiệm
quý báu trong thời để tôi hoàn thành khóa luận.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô giáo của
trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức
và hiểu biết vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập tại trường.

Cuối cùng , tôi cảm ơn toàn thể những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn
giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận.


Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013.
Lê Thị Quế









MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1. Chương 1: TỔNG QUAN 2
1.1. HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN. 2
1.1.1. Hoạt chất Loratadin 2
1.1.1.1. Công thức cấu tạo 2
1.1.1.2. Tính chất lý hóa 2
1.1.1.3. Dược động học. 2
1.1.1.4. Tác dụng 3

1.1.1.5 .Chỉ định, liều dùng 4
1.1.2.2. Tính chất lý hóa 4
1.1.2.2. Dược động học 5
1.1.2.3. Tác dụng. 5
1.1.2.4. Chỉ định ,liều dùng 6

1.1.3. Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin 6
1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 8
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ. 8
1.2.2. Các bộ phận của máy phân tích khối phổ 9
1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu (inlet) 9
1.2.2.2. Bộ nguồn ion ( Ion source) 9
1.2.2.3. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 10
1.2.2.4. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 10

1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze) 10
1.2.2.6. Bộ phận phát hiện (detector). 11
1.2.2.7. Hệ thống bơm chân không (high vacuum system). 11


1.2.3. Ưu nhược điểm của hệ thống 11
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) 11
1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH
SINH HỌC 12
1.3.1. Độ chọn lọc – độ đặc hiệu . 12
1.3.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ). 13
1.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 13
1.3.4. Độ đúng. 13
1.3.5.Độ chính xác. 13
1.3.6. Hiệu suất chiết. 13
1.3.7. Độ ổn định. 14
CHƯƠNG 2 . ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 14
2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ. 14
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. 15
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 15
2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 15

2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu 15
2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích 17
2.4.2.1. Xây dựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội. 17
2.4.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 18
2.4.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu. 18
2.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích. 19

2.4.3.1. Độ chọn lọc – đặc hiệu 19
2.4.3.3. Xác định giới hạn định lượng dưới 19
2.4.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 19
2.4.3.5. Hiệu suất chiết 20
2.4.3.6. Độ ổn định. 20
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20


3.1 . XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG. 20
3.1.1. Xác định điều kiện khối phổ và chuẩn nội 21
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký. 24
3.1.3. Phương pháp xử lý mẫu. 26
3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG. 29
3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 29
3.2.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 30
3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ). 31
3.2.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 32
3.2.5. Hiệu suất chiết. 36
3.2.6. Độ ổn định 38
3.2.7. Bước đầu ứng dụng vào định lượng Loratadin và Pseudoephedrin trên
mẫu thực. 40
3.3. BÀN LUẬN. 42
3.3.1. Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR và PES trong

huyết tương bằng LC – MS. 42
3.3.2. Về xây dựng phương pháp định lượng. 43
3.3.3. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng. 45
3.3.4. Về tính khả thi của phương pháp khi ứng dụng trên phân tích mẫu thực.
45
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
4.1. Kết luận 45
4.2. Kiến nghị. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC






DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CP
Chất phân tích
C
thực
C
max
DD
DĐH
Nồng độ thực
Nồng độ đỉnh
Dung dịch
Dược động học

EtOH
FDA
IS
Ethanol
Cơ quan quản lý thực dược phẩm Mỹ
Chất chuẩn nội
LOR
LLOQ
MeCN
Loratadin
Giới hạn định lượng dưới
Acetonitril
MeOH
MQC
m/z
HESI
Methanol
Mẫu kiểm tra ở nồng độ trung bình
Khối lượng/ điện tích
Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt
HPLC

HQC
LC- MS/MS
LQC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

PA
Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis)
PES
Pseudoephedrin
QC
Mẫu kiểm tra
r
Hệ số tương quan
RSD%
Độ lệch chuẩn tương đối
SKĐ
Sắc ký đồ
STT
TB
Số thứ tự
Trung bình
TLTK
T
max
Tài liệu tham khảo
Thời gian đạt nồng độ đỉnh
t
R

Thời gian lưu

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN
Tên Bảng
Trang
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES và IS trong MeOH…………
16
Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PES…
16
Bảng 2.3:Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn……………………………
17
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC……………………………………
17
Bảng 3.1: Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp…………
30
Bảng 3.2. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính………………
31
Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới…………………
33
Bảng 3.4:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương
pháp với LOR………………………………………………………

34
Bảng 3.5:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương
pháp với PES………………………………………………………………

34
Bảng 3.6 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với LOR…………………
35
Bảng 3.7 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với PES……………………
36
Bảng3.8: Hiệu suất chiết của IS………………………………………………

37
Bảng 3.9: Hiệu suất chiết của LOR…………………………………………
38
Bảng 3.10: Hiệu suất chiết của PES…………………………………………
38
Bảng 3.11: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng…………
40
Bảng 3.12: Độ ổn định của mẫu sau xử lý………………………………
41
Bảng 3.13. Nồng độ LOR và PES trong các mẫu thực…………………
42





DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
Tên hình
trang
Hình 2.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ………………………

9
Hình 3.1: Tối ưu Cone Voltage ………………………………………
23
Hình 3.2: Lựa chọn mảnh con và tối ưu hóa thế phân mảnh ………………
24
Hình 3.3 : Sắc ký đồ mẫu chuẩn LOR,PES và IS với điều kiện sắc ký đã xây
dựng………………………………………………………………………

27

Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng khi chiết lỏng – lỏng bằng hỗn hợp
dung môi Diethyl ether: Chloroforrm (8:2)……………………………

28
Hình 3.5: Quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng với hệ dung môi
Diethyl ether: Chloroform (8: 2)……………………………………………

29
Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa LOR, PES và IS………………….
30
Hình 3.7: Sắc ký đỗ mẫu huyết tương trắng…………………………………
30
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic LOR/IS và
nồng độ LOR trong huyết tương……………………………

32
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic PES/IS và nồng
độ PES trong huyết tương………………………………………………………

32
Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 1.5h sau khi uống
thuốc……………………………………………………………………………

42
Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 7h sau khi uống
thuốc…………………………………………………………………………….

43

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm mũi dị ứng là bệnh thường gặp trong các bệnh lý của đường hô hấp trên.
Bệnh phổ biến ở các nước công nghiệp đang phát triển do tình trạng ô nhiễm môi
trường, nhất là tại những nước có khí hậu cận nhiệt đới như Việt Nam. Đối với bệnh lý
trên việc phối kết hợp các hoạt chất mà đặc biệt là việc phối hợp Loratadin – một thuốc
kháng Histamin thế hệ hai có tác dụng làm giảm các triệu chứng của viêm mũi dị ứng
và Pseudoephedrin – một thuốc có tác dụng làm giảm xung huyết đã ngày càng trở nên
hữu ích và mang đến hiệu quả điều trị rõ rệt. Hiện nay trên thị trường dược phẩm đã có
rất nhiều các sản phẩm bào chế kết hợp hai thành phần hoạt chất trên ở dạng đặc biệt :
viên nén giải phóng chậm, viên giải phóng có kiểm soát. Việc kết hợp này đã giúp làm
đơn giản hóa việc dùng thuốc của bệnh nhân do giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác
dụng bất lợi và do đó làm tăng sinh khả dụng của thuốc.
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu bào chế các dạng thuốc viên giải phóng có
kiểm soát hay giải phóng kéo dài chứa đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin[5], [7].
Hiện tại, bộ môn bào chế – trường đại học dược Hà Nội cũng đang nghiên cứu bào chế
viên giải phóng có kiểm soát với tên Clarinase - VN. Tuy nhiên cho đến nay, mới chỉ
có các nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong chế phẩm[6], [9], [10]
mà vẫn chưa có nghiên cứu nào về phương pháp định lượng đ
ồng thời hai hoạt chất
trên trong dịch sinh học bằng cách sử dụng các phương pháp có độ nhậy và chính xác
cao như LC, GC, LC-MS Để đóng góp một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy, độ
đặc hiệu, độ chính xác ứng dụng phục vụ cho công tác nghiên cứu sinh khả dụng và
tương đương sinh học của các dạng thuốc chứa Loratadin và Pseudoephedrin, chúng tôi
tiến hành đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời
Loratdin và Pseudoephedrin trong huyết tương bằng LC-MS” với các mục tiêu
sau:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích đồng thời Loratdin và Pseudoephedrin
trong huyết tương bằng LC-MS.
2. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng được theo quy định của FDA –

Mỹ.

2

1. Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN.
1.1.1. Hoạt chất Loratadin
1.1.1.1. Công thức cấu tạo [18]

Công thức phân tử : C
22
H
23
ClN
2
O
2.
Trọng lượng phân tử : 382.9
Tên khoa học :
Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[
1,2-b]pyridin-11-ylidene)piperidine-1-carboxylate
1.1.1.2. Tính chất lý hóa [7], [18]
 Dạng bột hoặc tinh thể màu trắng hay trắng ngà
 Nhiệt độ nóng chảy 132- 137ºC
 Độ tan : Thực tế không tan trong nước, tan trong các dung môi aceton,
chloroform, methanol, toluen ở bất kỳ tỷ lệ nào.
1.1.1.3. Dược động học [1], [3],[12], [18].
 Hấp thu
 Loratadin hấp thu nhanh sau khi uống. Với liều uống 10mg, nồng độ đỉnh
trong huyết tương trung bình của Loratadin và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó

(descarboethoxyloratadin) tương ứng là 4 ng/ml và 4,7 ng/ml đạt được sau 1,5 và
3,7 giờ.
 Sau khi uống loratadin, tác dụng kháng histamin của thuốc xuất hiện trong
vòng 1 - 4 giờ, đạt tối đa sau 8 - 12 giờ, và kéo dài hơn 24 giờ. Nồng độ của
3

Loratadin và Descarboethoxyloratadin đạt trạng thái ổn định ở phần lớn người bệnh
vào khoảng ngày thứ năm dùng thuốc.
 Nồng độ thuốc trong huyết tương dao động từ 2,5 – 100 ng/ml (với liều đơn
10mg).
 Phân bố
 97%- 99% loratadin và 73-77% chất chuyển hóa liên kết với protein huyết
tương
 Thể tích phân bố của thuốc là 80 - 120 lít/kg.
 Thuốc không qua được hàng rào máu não nhưng vào được sữa mẹ.
 Chuyển hóa
 Loratadin chuyển hóa nhiều khi qua gan lần đầu bởi hệ enzym microsom
cytocrom P450; Loratadin chủ yếu chuyển hóa thành Descarboethoxyloratadin, là
chất chuyển hóa có tác dụng dược lý
 Ðộ thanh thải của thuốc là 57 - 142 ml/phút/kg.
 Thải trừ
 Khoảng 80% tổng liều của Loratadin bài tiết ra nước tiểu và phân ngang
nhau, dưới dạng chất chuyển hóa, trong vòng 10 ngày
 Thời gian bán thải của Loratadin là 18,2 giờ (6,7 - 37h) và của Descarboetho-
xyloratadin là 17,5 giờ (11-38h). Thời gian bán thải của thuốc biến đổi nhiều giữa
các cá thể, không bị ảnh hưởng bởi urê máu, tăng lên ở người cao tuổi và người xơ
gan.
1.1.1.4. Tác dụng [1], [3],[12], [18].
 Loratadin là thuốc kháng histamin 3 vòng có tác dụng kéo dài đối kháng chọn
lọc trên thụ thể H

1
ngoại biên và không có tác dụng làm dịu trên thần kinh trung
ương
 Loratadin thuộc nhóm thuốc đối kháng thụ thể H
1
thế hệ thứ hai (không an
thần)
4

 Loratadin có tác dụng làm nhẹ bớt triệu chứng của viêm mũi và viêm kết
mạc dị ứng do giải phóng histamin. Loratadin còn có tác dụng chống ngứa và nổi
mày đay liên quan đến histamin
 Có thể kết hợp Loratadin với Pseudoephedrin để làm nhẹ bớt triệu chứng
ngạt mũi trong điều trị viêm mũi dị ứng có kèm ngạt mũi.
1.1.1.5 .Chỉ định, liều dùng [1], [3],[12], [18].
 Chỉ định
Viêm mũi dị ứng
Viêm kết mạc dị ứng
Ngứa và mày đay liên quan tới histamin.
 Liều dùng
Người lớn, người cao tuổi và trẻ em từ 12 tuổi trở lên:
Dùng một viên nén 10 mg Loratadin hoặc 10 ml (1 mg/ml) siro Loratadin, dùng một
lần/ngày hoặc dùng một viên nén Claritin - D (Loratadin 10 mg với Pseudoephedrin
sulfat 240 mg).

1.1.2. Hoạt chất Pseudoephedrin.
1.1.2.1. Công thức cấu tạo pseudoephedrin[18]


Công thức phân tử : C

10
H
15
NO
Trọng lượng phân tử : 165,2
Tên khoa học : (+)-(1S,2S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-ol.
1.1.2.2. Tính chất lý hóa [7], [18]
 Hóa tính : Pseudoephedrin là đồng phân đối quang của Ephedrin, nó dễ bị khử
thành Methamphetamin và bị oxy hóa thành Methcathion.
5

 Lý tính :
 Dạng bột hoặc tinh thể màu trắng
 Nhiệt độ nóng chảy :117ºC – 118 ºC ( dạng muối sulfat 174- 179 ºC)
 Độ tan : 7mg/L, dạng muối tan tự do trong nước và Ethanol.
1.1.2.2. Dược động học [7], [12], [18], [21]
 Hấp thu
Hấp thu dễ dàng và hầu như hoàn toàn từ đường tiêu hóa. Liều uống 60-120mg
psedoephedrin.HCl đạt Cmax trong huyết tương 180-300ng/ml hoặc 397ng/ml –
422ng/ml tương ứng đạt được trong khoảng thời gian 1,39 – 2h hoặc 1,84 – 1,97h.
Hấp thu từ dạng giải phóng có kiểm soát chậm hơn. Thức ăn làm chậm quá trình
hấp thu, dạng giải phóng có kiểm soát không bị ảnh hưởng.
 Phân bố
Thể tích phân bố ở trạng thái ổn định 2,4 – 2,6 L/kg (với liều 30 – 60mg uống ở
trẻ em 6 – 12 tuổi), Pseudoephedrin được cho là có khả năng đi qua nhau thai. Nó
có khả năng vào sữa mẹ (khoảng 0,5% liều uống sau 24h).
 Chuyển hóa
Chuyển hóa không hoàn toàn (<1%) ở gan bằng phản ứng khử Methyl cho chất
chuyển hóa không hoạt tính.
 Thải trừ

Thuốc và chất chuyển hóa (khoảng 55-96%) được bài tiết qua nước tiểu với tốc
độ không đổi. pH nước tiểu ảnh hưởng tới thải trừ, nhanh khi có tính acid và chậm
khi có tính kiềm. Với pH 5, thời gian bán thải là 3- 6h, với
pH 8 là 9- 16h.
1.1.2.3. Tác dụng [7], [12], [18], [21]
Pseudoephedrin là thuốc cường giao cảm chiết xuất từ cây thuộc chi ma hoàng.
Tác động trực tiếp lên thụ thể α adrenergic và β adrenergic (ở mức độ yếu hơn). Và
tương tự Ephedrin, nó cũng tác động gián tiếp bằng cách giải phóng Norephedrine.
Pseudoephedrin tác động trực tiếp lên thụ thể α adrenergic làm co mạch niêm mạc
mũi, kết quả là làm giảm tiết dịch nhày mũi, giảm xung huyết, phù nề và nghẹt
mũi. Tác động giao cảm của Pseudoephedrin cũng có thể xảy ra ở các đường khác
6

của đường hô hấp (ví dụ ống Eustachian). Pseudoephedrin cũng làm giãn cơ trơn
phế quản do kích thích thụ thể β
2
adrenergic.
1.1.2.4. Chỉ định ,liều dùng [7], [12], [18], [21]
 Chỉ định
Giảm các triệu chứng đi kèm với viêm mũi dị ứng và các chứng cảm lạnh thông
thường bao gồm nghẹt mũi, hắt hơi, chảy nước mũi, ngứa và chảy nước mắt.
 Liều dùng
Liều dùng thông thường của pseudoephedrine cho người lớn và trẻ em từ 12 tuổi
trở lên là 60 mg mỗi 4 - 6 giờ với tối đa 240 mg mỗi ngày
Với dạng giải phóng kéo dài dùng liều 120 mg mỗi 12h hoặc 240 mg cho 24h
(dạng viên lõi 180 mg và 60 mg giải phóng ngay bao ngoài).

1.1.3. Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin
 Các nghiên cứu ở Việt Nam
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào định lượng đồng thời LOR và

PES trong dịch sinh học, tuy nhiên đã có một số nghiên cứu định lượng hai hoạt
chất trên trong chế phẩm:
 Tác giả Lê Thị Thu Hiền, Bùi Thu Huê, Đoàn Cao Sơn đã nghiên cứu định
lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin hydroclorid trong thuốc viên bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy khoảng nồng độ tuyến
tính của LOR là 10 - 50 µg/mL (r = 0,9998), của PES là 120- 1800 µg/mL (r =
0,9990); độ đúng của phương pháp cho LOR và PES lần lượt là 100,4% và 99,5%
với giá trị RSD tương ứng là 0,72% và 0,77% [6].
 Tác giả Nguyễn Minh Trí và Nguyễn Mã Huy Thanh đã định lượng đồng
thời hai hoạt chất Loratadin và Pseudoephedrin sulfat trong chế phẩm viên nén bằng
phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm. Kết quả cho khoảng tuyến tính 0,015 –
0,035 mg/mL với LOR và 0,025 – 0,84 mg/mL với PES, độ đúng và độ chính xác
tương ứng cho hai chất lần lượt là 99,46% (RSD = 0,72%) và 100,6% (RSD =
0,58%) [10].
7

 Tác giả Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Điệp, Nguyễn
Thanh Hải cũng đã nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin
bằng phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất. Kết quả cho thấy đây là phương
pháp đơn giản, có độ chính xác đạt yêu cầu, tiến hành nhanh và tiết kiệm thời gian
có thể sử dụng định lượng nhanh hàm lượng PES và LOR trong các chế phẩm bào
chế kết hợp bằng các máy đo quang thông dụng [9].
 Các nghiên cứu nước ngoài
 Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học:
 Nghiên cứu “xác định đồng thời Loratadin và Pseudoephedrine sulfat trong
huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - kỹ thuật phun điện tử”
do các nhà hoa học thuộc đại học dược Trung Quốc tiến hành đánh giá sinh khả
dụng của Loratadin và Pseudoephedrin từ viên giải phóng có kiểm soát.
Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lượng gồm :
- Chiết hoạt chất từ huyết tương người bằng ethyl ether

- Cột sắc ký : ODS Shimazu (5µm ; 2,1 x 150mm)
- Pha động : Acetnitril- nước (80:20) chứa 0,1% acid acetic băng
- Tốc độ dòng : 0,2mL/phút
- Thể tích bơm mẫu : 5µL
- Chuẩn nội : diazepam cho LOR và phenylpropanolamin cho PES
- Kiểu khối phổ : MS/MS, nguồn ion hóa HESI(+)
- Kết quả : Khoảng nồng độ tuyến tính : 5 - 1000 ng/mL với PES và 0,05 – 10
ng/mL với LOR. Giới hạn định lượng : 10 pg/mL với LOR và 50 pg/mL với
PES [16].
 Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc:
 Một nghiên cứu taị đại học Dược hoàng gia Malaysia đã định lượng đồng
thời Loratadin và Pseudoephedrine hydrochlorid trong chế phẩm viên nén bằng
phương pháp HPLC detector UV- VIS
Các điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký : Luna (5µm; 4,6 x 150mm)
8

- Pha động : Dung dịch amonium dihydro orthophosphat 30mM : acetonitrile
(4:6, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1mL/phút.Thể tích tiêmm mẫu: 20 µL. Bước sóng phát hiện:
265nm.
- Kết quả: Khoảng nồng độ tuyến tính: 5 - 200 µg/mL với PES và 0,25 – 10
µg/mL với LOR) [14].
 Tại Ấn Độ, các nhà khoa học đã đồng thời tiến hành nhiều phương pháp
khác nhau để định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc.
- Thứ nhất là phương pháp đo quang ở nhiều bước sóng, với 2 bước sóng cực
đại là 257 và 283nm.
- Thứ hai là phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất, đo độ hấp thụ tại hai
bước sóng là 308,6 và 263 nm
- Thứ ba là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng :

+Cột sắc ký : ODS (5µm; 4,6 x 150mm).
+ Pha động : dd amoni acetat (3,85g/l): Methanol (20:80) pH 7,5
+ Chuẩn nội : nimesulid
Kết quả: Phương pháp thứ nhất cho kết quả khá nhanh, ở phương pháp thứ hai
đã loại bỏ hoàn toàn được ảnh hưởng của các thành phân tá dược và tạp khác,
phương pháp thứ ba khá nhanh (thời gian phân tích một mẫu khoảng 15 phút), cho
kết quả chính xác [15].

1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ.
Khối phổ ( masspectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z).
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, sau đó được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Quá trình này diễn ra trong thiết
bị chân không với áp suất của hệ dao động trong khoảng 10
-8
– 10
-6
Pa. Tín hiệu
9

tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác
nhau tập hợp lại thành khối phổ.
1.2.2. Các bộ phận của máy phân tích khối phổ.[8], [11]



Hình 2.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ.
1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu (Inlet)
Có vai trò nạp mẫu vào máy, ở đây mẫu được nạp gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu

ra của bộ phận sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ.
1.2.2.2. Bộ nguồn ion ( Ion source)
Vai trò là ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.
Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau, hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa
bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI).
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI :
Các phân tử chất phân tích cùng dòng pha động sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được
đưa vào một ống mao quản cao thế 2-5 KV và phun vào nguồn ion hóa dưới dạng
sương mù. Do tác động của điện thế cao mà bề mặt các hạt sương mù được tạo
thành bị nhiễm điện, đồng thời dưới tác động của luồng khí nitơ nóng, xảy ra hiện
tượng bay hơi dung môi làm cho các hạt sương mù bé dần cho đến khi bị phân tách
10

và giải phóng các ion mang điện. Phần lớn các tiểu phân dung môi, tiểu phân không
mang điện hoặc mang điện trái dấu với ion chất phân tích sẽ bị bơm hút ra ngoài.
Ion chất phân tích và một phần các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ đi vào bộ phận
vận chuyển ion nhờ chênh lệch áp suất.
1.2.2.3. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube)
Bộ phận vận chuyển ion có cấu tạo như một ống thép chịu nhiệt, tại đây các ion
dung môi còn sót lại sẽ tiếp tục bị bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao.
1.2.2.4. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense)
Cấu tạo gồm hai thanh kim loại ghép với nhau thành một cặp điện cực. Khi áp
điện thế vào, các ion phân tích và các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ được tập
trung lại thành dòng ion di chuyển với tốc độ cao vào trong bộ phận phân tích khối.
1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze)
Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ
tác dụng của điện từ trường để đi tới detector.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng bộ phân tích tứ cực chập ba
(Triplequadrupoles analyser).
Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau, các tứ cực được cấu tạo bởi

bốn thanh kim loại ghép với nhau tạo thành hai cặp điện cực, trong đó Q1, Q3 làm
nhiệm vụ phân tích.
- Tại Q1: Tách các ion, lựa chọn ion chất phân tích ( ion mẹ - parent ion) để đi
vào Q2
- Tại Q2: Với áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với các phân tử khí
trơ có mặt như nitơ, heli, argon đã được cung cấp động năng. Nhờ va chạm này,
năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng của chúng, phân mảnh tạo
ra các ion con. Các mảnh ion con được tạo thành có số khối khác nhau sẽ tiếp tục đi
vào Q3.
- Tại Q3: Hệ thống điều chỉnh để ưu tiên cho loại ion con đặc trưng của chất
phân tích đi qua và di chuyển đến detector
11

Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần – MS/MS
(nhận diện chất phân tích thông qua số khối của ion mẹ và mảnh ion con).
1.2.2.6. Bộ phận phát hiện (detector).
Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến từ bộ phận phân tích khối thành tín hiệu
điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
1.2.2.7. Hệ thống bơm chân không (high vacuum system).
Hệ thống bơm chân không hoạt động nhằm duy trì môi trường chân không ở
nguồn ion hóa và toàn bộ hệ thống phân tích khối. Áp suất bên trong hệ thống duy
trì trong khoảng 10
-8
– 10
-6
Pa.
1.2.3. Ưu nhược điểm của hệ thống
 Ưu điểm
Kỹ thuật LC- MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, có thể dùng để phân
tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp. Do đó kỹ thuật này ngày

càng được ứng dụng nhiều trong phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch
sinh học cho các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học.
 Nhược điểm
Đòi hỏi hóa chất có độ tinh khiết cao, dụng cụ đảm bảo sạch. Thiết bị có cấu tạo
phức tạp, giá thành cao. Người sử dụng máy có trình độ chuyên môn cao.

1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) [17], [22], [23].
UPLC là phương pháp được phát triển từ HPLC, nguyên tắc hoạt động và các
thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký của UPLC hoàn toàn tương tự với HPLC,
tuy nhiên UPLC có cải tiến về phần cứng cũng như về phần hóa học để tăng về hiệu
năng thiết bị. Máy UPLC thực chất là một máy sắc ký lỏng chạy tại áp suất siêu
cao (từ 9000 psi đến 15000 psi), sử dụng cột sắc ký đường kính nhỏ (thông thường
< 2,1 mm); kích thước tiểu phân pha tĩnh nhỏ (<2,2 µm), số đĩa lý thuyết lớn, chiều
cao đĩa lý thuyết nhỏ. Ngoài ra phần cứng liên quan như phần bơm mẫu, phần thu
nhận dữ liệu (detetor) và xử lý số liệu cũng được cải tiến để đồng bộ trong toàn hệ
thống. UPLC có khả năng đồng thời tăng tốc độ phân tích (lên khoảng 9 lần), tăng
độ nhạy (lên khoảng 2 lần) và độ phân giải (lên khoảng 3 lần) so với khi phân tích
12

trên HPLC. Hiện nay trên thế giới đang coi UPLC là đỉnh cao của thiết bị LC và là
đầu vào tiêu chuẩn của hệ thống khối phổ.
So với HPLC, UPLC có một số ưu điểm sau:
- Tốc độ phân tích nhanh;
- Kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải tốt hơn;
- Tiêu tốn ít dung môi hơn;
- Chi phí nhân công ít hơn;
- Diện tích phòng thí nghiệm cũng cần ít hơn.


1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH

SINH HỌC
Thẩm định một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là quá trình
xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của
phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích
thực tế.
Có khá nhiều hướng dẫn như của FDA – Mỹ (2001), EMEA (2011), ASEAN
(2003) [8], [13], [19], [20], nhưng nhìn chung người ta thường tiến hành thẩm định
với các chỉ tiêu sau :
1.3.1. Độ chọn lọc – độ đặc hiệu .
Độ chọn lọc- đặc hiệu là khả năng phân biệt các chất có trong mẫu thử khi tách
và định lượng hai thành phần trở lên trong một hỗn hợp chất.Theo FDA, phương
pháp phân tích được coi là chọn lọc – đặc hiệu đối với chất phân tích (CP) và chuẩn
nội (IS) khi trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ chất CP tương ứng với nồng
độ thấp nhất của đường chuẩn ), các pic của CP và IS phải được nhận diện rõ ràng
và có hình dạng cân đối .Ngoài ra còn yêu cầu đáp ứng pic của mẫu trắng so với
mẫu chuẩn tại thời gian lưu của CP không vượt quá 20%, tại thời gian lưu của IS
không vượt quá 5%.
13

1.3.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ).
Theo quy định của FDA, mẫu chuẩn có nồng độ CP tương ứng với nồng độ thấp
nhất của đường chuẩn được coi là LLOQ khi pic của CP được nhận diện rõ ràng,
hình dạng cân đối và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại thời
gian lưu của CP, độ đúng đạt 80 -120% so với nồng độ thực và độ chính xác có giá
trị RSD ≤ 20%.
1.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính.
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ CP trong đó có sự tương quan tuyến tính
giữa nồng độ CP và tỷ lệ đáp ứng pic CP/IS
Theo FDA, đường chuẩn phải bao gồm 6 - 8 điểm bao phủ toàn bộ khoảng tuyến
tính, hệ số tương quan lớn hơn 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao

gồm cả điểm có nồng độ thấp nhất và điểm có nồng độ cao nhất phải có độ đúng
nằm trong khoảng từ 85% đến 115% với giá trị RSD ≤ 15%, riêng điểm thấp nhất
của đường chuẩn cho phép có độ đúng nằm trong khoảng từ 80% đến 120% với giá
trị RSD ≤ 20%.
1.3.4. Độ đúng.
Độ đúng là chỉ tiêu phản ánh sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực
hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận
Độ đúng được tính bằng phần trăm giữa giá trị thu được và giá trị thực.Độ đúng
phải đạt từ 85% đến 115%.
1.3.5.Độ chính xác.
Độ chính xác là chỉ tiêu phản ánh mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép
đo từ nhiều lần lấy mẫu phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ
Độ chính xác được thể hiện ở giá trị RSD, yêu cầu RSD phải không lớn hơn
15%.
1.3.6. Hiệu suất chiết.
Hiệu suất chiết là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của CP và IS sau quá trình
chiết tách xử lý mẫu
14

Theo FDA, hiệu suất chiết của CP và IS không được quá cao ( dưới 110%),
không quá thấp (trên 30%) và ổn định (hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ
không được khác nhau quá 15%).
1.3.7. Độ ổn định.
Theo FDA, các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện phân tích nếu giá trị nồng
độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và các giá trị
RSD giữa các lần phân tích không quá 15%.

CHƯƠNG 2 . ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ.
 Chất chuẩn

Loratadin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 99,24%, độ ẩm 0,02%
Pseudoephedrin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 100%, độ ẩm 0,01%.
 Chất chuẩn nội:
Diazepam – chuẩn phòng thí nghiệm;
Domperidol – chuẩn phòng thí nghiệm.
 Dung môi, hóa chất:
Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN ) – Merk, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh
khiết dùng cho HPLC và LC/MS.
Các dung môi hóa chất khác như : Cloroform, Diethylether, Dicloromethan, các
dd: Amoni acetat, Acid acetic, Acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân
tích (p.a)
 Huyết tương trắng : được lấy từ chó khỏe mạnh và chưa dùng thuốc.
 Thiết bị dụng cụ:
Tất cả các thiết bị dụng cụ đều được chuẩn hóa theo quy định ISO/ IEC 17025 -
2005
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD
– Waters (Mỹ);
- Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg) – Sartorious (Đức);
15

- Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K – Sartorious (Đức);
- Thiết bị bay hơi dung môi Reatic – Thermo III – Thermo scientific (Mỹ);
- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP-236 – Velp (Ý);
- Micropipet Eppendorf loại 10- 100, 100- 1000µL – Eppendorf (Đức);
- Bình định mức, pipet thủy tinh classA , Prolabo – Pháp.

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
 Trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích.
 Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó không có LOR và PES.
 Mẫu tự tạo: là các mẫu huyết tương trắng của chó có LOR và PES ở nồng độ

thích hợp.
 Trong ứng dụng định lượng trên mẫu thực:
 Viên Clarinase ® tablet (Shering – Plough Labo N.V);
 Mẫu thử: là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống viên Clarinase
 Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10kg, được chăm sóc và lấy
máu tại bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PES bằng kỹ thuật LC-
MS/MS: Lựa chọn phương pháp chiết tách LOR và PES từ huyết tương chó, lựa
chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội và điều kiện khối phổ.
 Thẩm định phương pháp phân tích : Thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu -
chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng
– độ chính xác,
hiệu suất chiết, độ ổn định.

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu
 Chuẩn bị các mẫu chuẩn.
16

 Chuẩn bị các mẫu chuẩn LOR, PES và IS trong MeOH theo bảng sau:
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES và IS trong MeOH
Dung dịch
Thành phần( pha loãng theo
tỷ lệ thích hợp)
Nồng độ chính xác khoảng
Chuẩn gốc LOR(dd A)
LOR cân+ MeOH

250 µg/mL
Chuẩn gốc PES(dd B)
PES cân + MeOH
250 µg/mL
Chuẩn gốc IS (dd C)
DOM cân+ MeOH
250 µg/mL
Chuẩn trung gian (ddA1)
dd A+ MeOH
1 µg/mL
Chuẩn trung gian (dd B1)
dd B+MeOH
20 µg/mL
Chuẩn IS làm việc
dd C + MeOH
125 ng/mL
Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa LOR và PES chuẩn theo bảng sau:
Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PES.
Dung dịch
Thành phần
Nồng độ chính xác khoảng
LOR
PES
Chuẩn làm việc CC1
0,5 mL dd A1+0,5 mL dd
B1+ huyết tương trắng vừa
đủ 10 mL
50 ng/mL
1000 ng/mL
Chuẩn làm việc CC2

1mL dd CC1+ huyết tương
trắng vừa đủ 10 mL
5 ng/mL
100 ng/mL
Từ các chuẩn làm việc CC1 và CC2 , chuẩn bị dãy mẫu chuẩn như sau:
Bảng 2.3:Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn.
Mẫu
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
Nồng độ
LOR
(ng/mL)
0,5
1,0
2,5
5
10
20
35
50
Nồng độ
PES
(ng/mL)
10

20
50
100
200
400
700
1000
Thể tích dd
CC1 (µL)
0
0
0
0
200
400
700
1000