“Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RTPCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ”

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm gan virus C do virus viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV) gây ra. Hậu
quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan. Hiện nay trên thế giới
có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm hàng triệu người nhiễm
mới. Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó
10 – 20% sẽ chuyển sang xơ gan và 1 – 5% sẽ chuyển thành ung thư gan. HCV còn làm
trầm trọng thêm bệnh viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm. Theo đánh giá của
các chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan virus C là một mối
đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau.
HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của
máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con. Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chống
HCV do tính biến động di truyền cao của virus này.
Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽ
cung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điều
trị. Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn
2x10
6
copies/ml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợp
khác.
Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức năng
gan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân
gây viêm gan virus C. Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm
sinh học có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân
tử nhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus .
Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm
HCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật
phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu
cao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện

trong máu, đặc biệt cần thiết cho các BN bị suy giảm miễn dịch. Mặt khác, một số kỹ
thuật phân tử như Realtime PCR vừa cho phép xác định chính xác nồng độ HCVRNA
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
1
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
trong máu, vừa cho phép xác định chính xác các type HCV, phục vụ hữu hiệu cho việc
tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị. Do nguyên liệu di truyền của virus C là
RNA nên muốn thực hiện PCR phải có một giai đoạn chuyển RNA sang cDNA nhờ men
sao chép ngược RT (reverse transcriptase). Sau khi có được cDNA thì ta thực hiện phản
ứng PCR trực tiếp với đoạn đặc hiệu của virus C.
Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định type và nồng độ virus gây
viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa
khoa Trung ương Cần Thơ” nhằm các mục tiêu sau:
1.2. Mục tiêu đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên
BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định tỉ lệ (+) HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR
- Xác định nồng độ HCVRNA trên BN qua kỹ thuật Realtime RT-PCR
- Xác định type HCV gây bệnh qua kỹ thuật Realtime RT-PCR.
- Tìm mối liên quan giữa type, nồng độ HCVRNA và một số xét nghiệm cận lâm sàng
khác của bệnh nhân.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
2
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về virus gây viêm gan C
2.1.1. Cấu trúc virus viêm gan C

Hepatitis C virus (HCV) thuộc họ Flaviviridae, có đường kính 55 – 65 nm. Trọng lượng
phân tử vào khoảng 4.016 Dalton, hệ gen gồm một dây xoắn đơn RNA, nằm bên trong phần
nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 (Hình 2.1).
Hình 2.1. Cấu trúc của HCV (www.expertreviews.org/)
Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ. Ở protein E2 có hai
vùng siêu biến (HVR: hypervariable region) là HVR1 và HVR2. Vùng siêu biến này thường
xuyên bị biến đổi qua mỗi lần virus nhân đôi tạo ra sự khác biệt giữa các genome của HCV
(Bùi Hữu Hoàng, 2000).
Trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase mà men này
không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp RNA từ đó làm cho bộ gen của virus khá
đa dạng nên người ta đã phân lập được nhiều type khác nhau
(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm).
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), genome của HCV là một chuỗi đơn RNA, gồm khoảng
9400 nucleotide, được chia làm 3 vùng (hình 2.2):
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
3
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.2. Những protein mã hóa cho bộ gen của HCV (www.expertreviews.org/)
- Đầu 5’ không mã hóa (5' NCR: non-coding region, 5' UTR: untranslated region,
5’NTR: non-translated region) gồm 341 – 344 nucleotide.
- Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung đọc duy
nhất gồm 9379 – 9481 nucleotide.
- Đầu 3’ không mã hóa gồm: vùng đầu tiên có chiều dài từ 28 – 42 nucleotide, tiếp theo
là vùng poly U hoặc poly A để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã.
Cho đến nay, theo Dev (2002) và Mindie H. Nguyen (2004), để thực hiện chính xác
type HCV là phải phân tích trên đoạn Core hoặc NS5B của bộ gen HCV
( />2.1.2. Các loại type và yếu tố nguy cơ nhiễm HCV
2.1.2.1. Các loại type của HCV
Theo Châu Hữu Hầu (2006), các tương đồng trình tự giữa các thành viên của các type
khác nhau là 55 – 72%. Các type được gọi bằng chữ số Ả Rập (type 1, 2…). Việc xếp loại các

type dựa trên sự so sánh các vùng khác nhau trên bộ gen.
Theo P. Simmonds (2002), tới nay có 6 type (1 – 6) và hơn 50 subtype (a, b, c ) đã
được xác định, phổ biến là 1a, 1b, 2a, 2b (hình 2.3).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
4
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.3. Các loại type và subtype của HCV theo P.simmonds
Để chuẩn hoá nhiều hệ gọi tên khác nhau, các chuyên gia đã so sánh trình tự ở vùng
NS5 của các biến dị HCV. Các trình tự giữa các thành viên của các type giống nhau từ 55 –
72%. Sự giống nhau giữa chúng với các subtype có liên quan khoảng 75 – 86% và thể phân
lập riêng biệt trong mỗi cụm có các trình tự giống nhau 88%. 6 type (1, 2, 3, 4, 5, 6) với các
subtype (a, b, c ) (bảng 2.1) được xem là hệ thống chuẩn gọi tên các type HCV (McGarvey,
1998).
Bảng 2.1. Các subtype của virus viêm gan C
Type Subtype Type Subtype
1 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 4
a, b, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o,
p, q, r, s, t
2 a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m 5 a
3 a, b, c, d, e, f, g, h, i, k 6
a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o,
p, q
( />2.1.2.2. Các yếu tố nguy cơ nhiễm HCV
 Chủng tộc và giới tính
Chủng tộc và giới tính có thể cũng ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm HCV mạn. Chủng
tộc Mỹ Phi được cho là có khả năng nhiễm bệnh cao hơn. Một nghiên cứu trên 57 trường hợp
cho thấy, nếu BN là nam, thì diễn tiến bệnh xảy ra nhanh hơn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
5
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT

(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114); điều này phù hợp với một
nghiên cứu ở châu thổ sông Nile, nơi có tần suất viêm gan C mạn khá cao thì nam có nguy cơ
nhiễm viêm gan C mạn cao gấp 2,5 lần nữ (Habib et al., 2001).
Theo Lorenzo Rosaro, M.D Đại học California, những tác nhân ảnh hưởng đến bệnh
viêm gan virus C là: nam, tuổi, HBV và HIV (www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ).
 Tình trạng kinh tế xã hội
Theo Desmond (2000), người càng nghèo tỷ lệ nhiễm HCV càng cao
(www.medscape.com/viewarticle/500414).
 Tuổi
Nhiễm HCV ở người lớn trên 40 tuổi thường có bệnh mạn tính tiến triển nhanh hơn.
Ngược lại, nhiễm dưới 10 tuổi chỉ có 50% nguy cơ phát triển viêm gan C mạn và thường có
bệnh gan nhẹ hơn. Nhiễm HCV tăng theo tuổi. Trẻ em dưới 16 tuổi, nhiễm HCV hiếm gặp ở
các nước đã phát triển nhưng hay gặp ở nhiều vùng Châu Phi và Châu Á. Tại Việt Nam, theo
công trình của Lã Thị Nhẫn, anti-HCV tăng dần theo tuổi: 10 – 19 tuổi là 0,72%; 20 – 29 là
1,54%; 30 – 39 là 3,22%; 40 – 49 là 3,81% và trên 50 tuổi là 11,18%. Nhưng công trình của
Trương Xuân Liên lại không thấy hình ảnh này với tỷ lệ nhiễm anti-HCV theo nhóm tuổi như
sau: dưới 15: 2,6%; 16 – 25: 3,2%; 36 – 45: 1,2% và trên 45: 3,4%. Sự khác biệt này có lẽ do
số liệu nghiên cứu còn ít.
Một nghiên cứu ở Mỹ cho thấy chỉ có 30% trẻ mang anti-HCV (+) là có HCVRNA, cho
thấy tỷ lệ mạn tính của HCV ỏ trẻ em chỉ bằng phân nửa ở người lớn. Điều này khác với viêm
gan B, tỷ lệ trở thành viêm gan B mạn ở trẻ em cao hơn rất nhiều so với người lớn (Châu Hữu
Hầu, 2006).
 Các yếu tố nguy cơ khác
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000) và Châu Hữu Hầu (2006), liên quan với các yếu tố nguy
cơ lây truyền bệnh, người ta nhận thấy type 1b thường gặp ở những BN bị nhiễm HCV do
truyền máu, còn type 3a thường thấy ở những BN chích xì ke (bảng 2.2).

Bảng 2.2 Type của HCV và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm
Ý (1) Pháp (2,3)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

6
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Chích xì ke Chứng Chích xì ke Truyền máu Khác
1a
1b
2a
2b
3a
4
5
6
nc
hỗn hợp
Số BN
48%
14%
0%
-
22%
-
-
-
-
-
85
14,5%
37%
32%
-
11,6%

-
-
-
-
-
103
36%
12%
-
4%
44%
4%
-
-
-
5-10%
41
7%
56%
4%
-
21%
5%
-
-
-
5%
75
11%
65%

14%
-
4%
4%
-
-
2%
2%
53
1. Silini. J Hepatol, 1994: 21: S33 (A); 2. Pol. Gastroenterology, 1995
3. Nousbaum, Ann Inter Med, 1995; 122:161-8
Nc: không xếp loại được; Bn: bệnh nhân
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), hiện nay ở các nước Tây Âu, nhờ việc tầm soát nguy cơ
lây nhiễm HCV ở những người hiến máu đã làm giảm rõ rệt tỉ lệ nhiễm HCV thuộc type 1b
sau truyền máu. Tuy nhiên, type 3a lại có khuynh hướng gia tăng do việc chích xì ke đã trở
thành cách lây nhiễm HCV chủ yếu ở các nước này. Nếu tiếp xúc nhiều lần với nguy cơ lây
bệnh, ví dụ như BN truyền máu nhiều lần có thể sẽ bị nhiễm nhiều loại type khác nhau
(Bendinelli et al., 1999).
Một số tác giả cũng ghi nhận rằng sự khác biệt về type có liên quan đến các tổn thương
tiến triển ở gan, ví dụ như type 1b có nguy cơ tương đối bị ung thư gan gấp 3 lần so với các
type khác nhau (bảng 2.3) (Bùi Hữu Hoàng, 2000).
Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Pháp và Ý lại thấy các tổn thương mô học ở gan độc lập
với các kiểu gen, như tình trạng xơ gan thường gặp ở những BN lớn tuổi bị nhiễm HCV do
truyền máu từ hàng chục năm nên thường là type 1b; còn các type khác thường bị nhiễm ở
người trẻ cho nên ít gặp các tổn thương xơ hóa gan nặng ở gan (Bùi Hữu Hoàng, 2000).

Bảng 2.3. Type 1b và nguy cơ ung thư gan
Nơi nghiên cứu Số BN Khoảng tin cậy 95%
Silini et al (1996) Ý 166 2,0 (1,3-3,1)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

7
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hatzakis et al (1996) Hy Lạp 17 3,8 (1,1-14,0)
Donato et al. (1997) Ý 172 2,9 (0,9-10,0)
Theo Châu Hữu Hầu (2006), hành vi tình dục có nguy cơ, trình độ văn hóa thấp, tình
trạng hôn nhân có vấn đề, hút thuốc, uống rượu cũng là các yếu tố nguy cơ. Một nghiên cứu ở
Mỹ nhận thấy tiểu đường type 2 ở người nhiễm HCV cao hơn gần 4 lần người không nhiễm
HCV trên 40 tuổi.
Tuy vậy, khoảng 50% nguồn nhiễm HCV còn chưa được hiểu rõ. Lan truyền trong gia
đình có thể xảy ra nhưng hiếm gặp. Nhiễm virus có thể do dùng chung dao cạo râu, bàn chải
đánh răng, ống tiêm và kim tiêm không vô khuẩn với những người nhiễm virus, tiêm chích ma
túy, châm cứu, cắt lễ (Bùi Đại và cộng sự, 2008).
2.1.3. Cách thức xâm nhập và sinh sản của HCV
2.1.3.1. Cách thức xâm nhập
HCV xâm nhập thẳng vào cơ thể qua đường máu; rồi tấn công tế bào gan và sinh sôi
nẩy nở tại đây. HCV làm cho tế bào gan sưng lên và đồng thời phá vỡ các tế bào gan. Có đến
85% những người bị nhiễm HCV có khả năng trở thành bệnh mạn tính (có nghĩa là 6 tháng
sau khi bị nhiễm, bệnh vẫn không hết). Ða số những người bị viêm gan C mạn tính không thấy
có triệu chứng nào và vẫn có cuộc sống bình thường. Tuy nhiên, trong số 10 – 25% người có
HCV mạn tính, bệnh sẽ âm thầm tiến triển trong khoảng 10 – 40 năm, và có thể làm hư gan
trầm trọng, xơ gan, hoặc ung thư gan ( ).
2.1.3.2. Sự sinh sản của HCV
HCV có thể xâm nhập vào tế bào gan và các tế bào khác như: tế bào đơn nhân máu
ngoại vi và hạch bạch huyết. Tuy nhiên, sự sao chép của HCV chưa được biết nhiều (Châu
Hữu Hầu, 2006).
Theo PG, AKI, Zurich (2002) và Châu Hữu Hầu (2006), HCV xâm nhập vào các tế bào
theo cơ chế nhập bào. Tuy nhiên, sự nhập bào cũng như các thụ thể liên quan chưa được biết
nhiều. Khi HCV vào bên trong, glycoprotein E2 không đủ để dung hợp màng tế bào và một
vùng kỵ nước của glycoprotein E2 được cho là giúp dung hợp vỏ ngoài virus vào màng. Lúc
nhập bào, sự kết hợp của lõi virus với tiểu đơn vị 60S của ribosom vật chủ có thể góp phần

vào việc cởi bỏ vỏ ngoài của RNA và khởi đầu dịch mã HCV. Sự chế biến phân giải HCV
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
8
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
polyprotein có thể cùng một lúc với dịch mã hoặc sau dịch mã và qua trung gian bởi protease
của vật chủ cũng như của virus. Trước khi phóng thích ra khỏi tế bào chủ, HCV tạo vỏ ngoài
cho mình và các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương. HCV kết hợp chủ yếu
với lưới nội bào tương, không có protein virus định vị trong nhân. Cuối cùng virion HCV
được phóng thích ra ngoài lưới nội bào tương với khoảng 10
12
virion HCV mỗi ngày. Giả sử
10% tế bào gan bị nhiễm HCV, mỗi tế bào gan phóng thích 50 hạt HCV mỗi ngày. Các tế bào
gan duy trì nồng độ RNA nội tế bào thấp; khoảng 3x10
11
phân tử RNA được sản xuất mỗi
ngày. Cũng như HBV, các thành phần quan trọng của các hạt HCV được phóng thích có thể là
các virion sao chép khiếm khuyết, hoặc các cấu trúc lõi trần. Với thời gian bán tồn của một
virion chỉ 4 – 7 giờ, đa số BN có nồng độ HCVRNA trong huyết thanh thấp là có thể hiểu
được.
2.2. Tình hình dịch tễ học của bệnh viêm gan virus C
2.2.1. Trên thế giới
Hiện nay, 3% dân số thế giới nhiễm HCV. Chính vì vậy, nhiễm HCV đang là vấn đề
báo động (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114).
Theo số liệu của WHO cho thấy xấp xỉ 170 triệu người trên thế giới nhiễm HCV
(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
rid=hstat4.section.22114;www.dr.thuthuy.com / research/peg_rib_geno6.html;
www.youtube.com/watch?v=J4TCo-qVoKk). Hiện nay con số này đã lên đến 180 triệu người
(www.who.int/immunization/topics/hepatitis_c/en/).
Tình trạng nhiễm HCV ở các nước thay đổi từ 0,1 – 5 % dân số: Mỹ 4,1 triệu (1,6%)
(Amstrong GL, 2006); Pháp 500 – 650.000 ( 1 – 1,3%); Úc 190.000 (1%). Ở các nước Á –

Phi; tỉ lệ nhiễm ở Indonesia là 3,9%; Yemen 6%, Lebanon 0,11%; Ai Cập 21%. Ở các nước
phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp độ virus , 70% viêm gan ghép
gan (Trần Ngọc Bảo, 2000).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
9
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.4. Phân bố HCV trên thế giới
(http://international_abbotmolecular.com/HepatitisCDemographics_2562.aspx)
Theo WHO, tình hình nhiễm HCV trên thế giới cho thấy có sự khác nhau nổi bật giữa
các vùng, các nước.
Bảng 2.4. Tình hình nhiễm HCV trên thế giới
Các nước Dân số (triệu) Tỷ lệ nhiễm (%) Số người nhiễm (triệu)
Châu Phi 602 5,3 31,9
Mỹ 785 1,7 13,1
Trung Đông 466 4,6 21,3
Châu Âu 858 1,0 8,9
Đông Nam Á 1.500 2,2 32,3
West Pacific 1.600 3.9 62,2
Tổng 5.811 3,1 169,7
Viêm gan virus C lây nhiễm chủ yếu do tiếp xúc trực tiếp từ máu hoặc các sản phẩm từ
máu của người mang virus C với máu của người bị lây nhiễm. Các đường lây nhiễm khác
chiếm tỉ lệ không đáng kể (Trần Ngọc Bảo, 2000). HCV là tác nhân gây bệnh viêm gan C mạn
tính lây truyền qua đường máu phổ biến nhất ở Mỹ. Theo Trần Ngọc Bảo (2000), xấp xỉ 40%
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
10
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
những ca viêm gan mạn có liên quan đến nhiễm HCV, và ước tính 8.000 – 10.000 người chết
mỗi năm liên quan đến HCV (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114;
www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/Vietnamese_info.htm).
Theo Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh (Center for Disease Control and

Prevention, CDC), số người chết do HCV có thể nhiều hơn những người chết do HIV/AIDS
hàng năm vào năm 2010. Ở Mỹ cứ 1 giờ sẽ có 3 người chết do HCV.
(www.youtube.com/watch?v=J4TCo-qVoKk). Số ca mới/năm ở Mỹ là 30.000, Pháp 15.000,
Úc 11.000 ca (Trần Ngọc Bảo, 2000)
Tỷ lệ nhiễm HCV đã giảm vào thập niên 90. Từ 1980 - 1989, ước tính trung bình
230.000 ca mỗi năm nhưng đến 2001 đã giảm xuống còn 25.000 ca mỗi năm
(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114), trong đó 60% ở người
nghiện hút, đường tình dục chỉ xấp xỉ 10% của các trường hợp mới mắc mỗi năm. Điều cần
quan tâm là lây truyền HCV trong bệnh viện tương đối cao (10-30%) ở các BN thẩm tách máu
(www.thongnhathospital.org.vn/nckh/2005_58_HNKH.pdf, 2005)
Người ta nhận thấy type 1, 2, 3 là các type được phân bố rải rác khắp nơi trên thế giới
(Bùi Hữu Hoàng, 2000; P.Simmonds, 2002; Châu Hữu Hầu, 2006). Năm 2000, 73% BN
người Mỹ nhiễm HCV type 1; 14% nhiễm type 2; 8% nhiễm type 3; 4% đồng nhiễm nhiều
type và nhiễm mỗi type 4, 5 và 6 < 1% (Adrian, 2009).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
11
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.5. Những loại genotype ở các nước trên thế giới
Người ta ghi nhận có sự phân bố khác nhau về type và subtype theo các vùng địa dư.
Hiện tượng này hình thành nên dịch tễ học phân tử của nhiễm HCV (Bùi Hữu Hoàng, 2000).
Theo Lauer (2001), Simmonds (2005) và Châu Hữu Hầu (2006), các nghiên cứu trình
tự và xác định type chứng minh các subtype liên quan khá chặt chẽ và phân bố theo địa dư như
sau (
+ Subtype 1a thường gặp ở Bắc và Nam Mỹ, cũng như ở Úc
+ Subtype 1b thường gặp ở Châu Âu và Châu Á (Nhật)
+ Subtype 2a thường gặp ở Nhật và Trung Quốc
+ Subtype 2b thường gặp nhất ở Mỹ và Bắc Âu
+ Subtype 2c thường gặp nhất ở Tây và Nam Âu
+ Subtype 3a thường gặp ở Úc và Nam Á
+ Subtype 4a có vẻ trội ở Ai Cập và Zaire

+ Subtype 4c thường gặp ở Trung Phi Châu
+ Subtype 5a chỉ hay gặp ở Nam Phi, nhưng hiếm gặp ở nhiều nơi trên thế giới
+ Subtype 6a giới hạn ở Nam Á (Hồng Kong, Macau và Việt Nam)
+ Subtype 7a và 7b thường gặp ở Thái Lan
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
12
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
+ Subtype 8a, 8b và 9a được tìm thấy ở Việt Nam
+ Subtype 10a và 11a gặp ở Indonesia
Dựa vào phân tích trình tự protein E1 và vùng NS5B, các biến dị HCV mới được tìm
thấy ở Việt Nam, cũng như các nước Đông Nam Á khác được xếp vào các type 7, 8, 9, 10 và
11. Ngày nay, các type 7, 8, 9, 11 được nhập chung vào kiểu 6a và type 10 được xếp chung
với kiểu 3a.
Sự phân bố type theo các vùng địa dư tương đối ổn định. Tuy nhiên, hiện nay do vấn đề
di dân và du lịch xảy ra khá phổ biến cho nên có thể ảnh hưởng phần nào đến bản đồ phân bố
type của HCV trên thế giới.
Các type được nhận diện nhờ vào các phương pháp như: PCR gián biệt, định type huyết
thanh, phương pháp lai ghép đặc hiệu của các subtype, RFLP….
Type HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có
những type HCV vượt trội riêng (Dev et al., 2002; Doris B. Strader et al., 2004; Eugene R.
Schiff et al., 1999; Johannes Bircher et al., 1999; Mindie H. Nguyen et al., 2004; Hepatitis-
central.com/hcv/genotype).
2.2.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là nước nằm trong vùng dịch tễ của virus gây bệnh viêm gan C
(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm). Theo các số liệu đã được công bố, tỉ lệ nhiễm
HCV ở Việt Nam là từ 4 – 9% (Trần Ngọc Bảo, 2000; Châu Hữu Hầu, 2006). Theo ghi nhận
về tình hình nhiễm HCV thì tỷ lệ người bình thường ở Việt Nam nhiễm HCV là khoảng 5 –
10% (Alter MJ, 1995), xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HCV cao thứ nhì
trên thế giới.
Theo một nghiên cứu của Châu Hữu Hầu tại cộng đồng dân cư huyện Tân Châu, An

Giang thì tỷ lệ nhiễm HCV là 4,1%. Theo Nataka và cộng sự khảo sát trên người không có
bệnh gan ở 2 thành phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỷ lệ nhiễm anti-HCV lần lượt
là 9% (43/491) và 4% (18/511). Phân bố anti-HCV không phụ thuộc theo tuổi.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
13
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.6. Sự phân bố tỷ lệ nhiễm HCV ở Việt Nam
Tại bệnh viện Chợ rẫy tại TPHCM, tỉ lệ nhiễm HCV là 10,95% (Nguyễn Hữu Chí,
1998). Theo Hoàng Thuỷ Long và cs (1998) khi nghiên cứu trên 1.563 BN ở Thanh Hóa, được
xét nghiệm anti-HCV chỉ có 6 đối tượng (chiếm tỷ lệ 0,38%) có kết quả dương tính và không
có đối tượng nào là trẻ em. Như vậy, Thanh Hóa là vùng có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C ở
mức độ thấp (www.pasteur-hcm.org.vn/ng_cuu/viemgan/viemgan.htm).
Nghiên cứu tình hình nhiễm HCV ở Bệnh viện Thống nhất ở TPHCM trên 910 người
năm 2005 cho thấy tỷ lệ nhiễm HCV là 2,4%, tỷ lệ này phù hợp với nghiên cứu của Trương
Xuân Liên (2,53%) (www.thongnhathospital.org.vn/nckh/2005_58_HNKH.pdf, 2005), so với
cộng đồng người Việt Nam khỏe mạnh (0,4 – 1,35%) có cao hơn, nhân viên y tế 3,28%; nhóm
cao nhất là nhóm chích ma túy 96,2% (Châu Hữu Hầu 2006; Nguyễn Hữu Chí, 1998; Trương
Xuân Liên, 1994).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
14
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.7. Tình hình nhiễm HCV ở một số đối tượng tại TPHCM (Trương Xuân Liên)
Trong 6 type của HCV thì ở Việt Nam có 3 type chính là: 1b, 2 và 6 (P. Simmonds, P.
Marcellin 2002). Tuy nhiên, theo nghiên cứu về type HCV ở người Việt Nam của nhiều tác
giả khác nhau, type HCV ở người Việt Nam là 1b và 6a (bảng 6).
Bảng 2.5. Type HCV lây nhiễm ở người Việt Nam
Tác giả - Địa
điểm
Số
trường

hợp
Type
1 (%)
Type 1b
(%)
Type 6a
(%)
Không định type
được (%)
Ghi chú
T.K.Anh. TP
HCM
42 47,6 23,8 0 9,6 Primer-Specific
N.T.Hảo. Hà
Nội
123 69,8 48,8 14,6 2,4 Lipa
Tokita.HCM 83 54 5 Type 6-9: 36%
P.Trimoulet.
Mỹ.1999
11 50 40 50 9 Sequencing. 5’UTR
Mindie H.
Nguyen.USA
308 44,1 ? 14 0
Sequencing.Core.Type 7
(14,3%), 8/9 (3,2%)
Anouk. Dev.
SEA.
70 77 60 10 0 Sequencing.Core.Type 1b:
36% là type 7,8, type 9: 10%
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

15
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Uc (type7), 1,4% (type 9).
(www.drthuthuy.com/research/VNgenotype.html)
Type 6 thường chỉ gặp ở vùng Đông Nam Á (Dev et al., 2002; Johannes Bircher et al.,
1999) nên khả năng đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa có nhiều nghiên cứu. Type 6 không phổ
biến ở Mỹ, Châu Âu nhưng phổ biến ở một số nước châu Á: Trung Quốc, Thailand, Hong
Kong, Việt Nam (Hui CK et al., 2003).
Theo Mindie Nguyen (2004), type 6 chiếm tỷ lệ 14% người Mỹ gốc Việt; theo nghiên
cứu của Trung tâm Y khoa Medic tại TPHCM, type 6 chiếm 24%
(www.drthuthuy.com/research/peg_rib_geno6.html).
Nghiên cứu của Phạm Song và cs cho thấy trong 83 người nhiễm HCV, 1a chiếm 29%,
5% kiểu 2a, 2% hỗn hợp kiểu 1a và 1b và số còn lại không xếp vào các loại 1a, 1b, 2b và 3a.
Hồ Tấn Đạt và cs ( 2005) dùng kỹ thuật Lipa, tại Trung tâm Y Khoa Medic, khi phân
tích 327 trường hợp viêm gan C mạn ở Việt Nam cho thấy type 1 nhiều nhất 58,4%, type 6
(6a) 23,9%; 13,1% các type 2 và 4,3% không xác định được kiểu gen.
2.3. Diễn tiến nhiễm HCV và các triệu chứng của bệnh viêm gan virus C
2.3.1. Diễn tiến nhiễm HCV
Với những BN nhiễm HCV, ở tuần 1 – 3 một số BN có biểu hiện tăng nồng độ ALT.
Trong năm đầu tiên nhiễm HCV, nồng độ ALT và HCV RNA có chiều hướng giảm một cách
ổn định. Tuy nhiên, không có sự phù hợp tuyệt đối giữa ALT và HCVRNA. Chẳng hạn,
HCVRNA có trong máu một số BN nhiễm HCV với nồng độ ALT ở mức bình thường. Hơn
nữa, nồng độ ALT huyết thanh dao động ở cả những trường hợp đã nhiễm bệnh và đã hồi phục
từ khi bắt đầu nhiễm bệnh cho đến 12 tháng. Những kháng thể với HCV xuất hiện từ tuần thứ
8 hoặc 9 sau khi nhiễm. (Adrian, 2009). Theo số liệu đã được công bố, trong 100% người
nhiễm virus viêm gan C lần đầu tiên có 85% BN diễn tiến thành mạn tính, thời gian kéo dài
thường khoảng 10 năm và 15% người bị nhiễm tự khỏi trong vài tuần hay vài tháng. Trong
85% BN mạn tính có 20% người bệnh chuyển sang xơ gan và 80% BN duy trì ở giai đoạn mạn
tính. Trong số 20% BN diễn tiến xơ gan có 75% BN bị suy gan và biến chứng khác; ung thư
gan chiếm 25% (hình 2.8)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
16
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.8. Diễn tiến nhiễm HCV
( />2.3.2. Những triệu chứng của bệnh viêm gan virus C
2.3.2.1. Viêm gan C cấp tính
Những BN nhiễm HCV nhưng có hệ miễn dịch tốt thường bệnh sẽ chuyển sang dạng
nhiễm cấp. Hầu hết BN nhiễm cấp thường không có triệu chứng, tuy nhiên 25 – 35% những
BN nhiễm có những triệu chứng như: cúm, mệt mỏi, buồn nôn, ăn không ngon hoặc đau bụng.
Những BN cũng có thể có biểu hiện vàng da (Adrian, 2009).
2.3.2.2. Viêm gan mạn tính
Khoảng 85% BN duy trì tình trạng viêm gan C cấp sau 6 tháng và trở thành mạn tính.
Một nghiên cứu trên 90 người nhận máu đã nhiễm HCV cho thấy rằng 77% BN (+) cả với
anti-HCV và HCVRNA. 17% BN chỉ có anti-HCV và 7% không có dấu hiệu phân tử hoặc
huyết thanh học về nhiễm HCV sớm hơn. Điều này có nghĩa 23% BN đã khỏi bệnh hoàn toàn.
Tỷ lệ viêm gan mạn ở nữ thấp hơn nam và có sự tương quan tỷ lệ nghịch về tuổi (Adrian,
2009).
2.4. Xét nghiệm đặc hiệu chẩn đoán bệnh viêm gan virus C
2.4.1. Các xét nghiệm sinh hóa
2.4.1.1. Tăng aminotransferase trong nhiễm HCV
Aminotransferase được dùng thường nhất và là chỉ thị đặc hiệu của hoại tử tế bào gan.
Các enzyme này bao gồm:
+ Aspartate aminotransferase (AST, SGOT): có ở nhiều mô khác nhau: tim, cơ
vân, thận, não và gan. Trong gan, AST hiện diện ở ty thể và phần bào tương tế bào.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
17
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
+ Alanine aminotransferase (ALT, SGPT): chủ yếu ở trong gan và trong phần
bào tương tế bào.
Các enzyme này chuyển nhóm α–amino của aspartate và alanine thành nhóm α–keto

của ketoglutaric acid. Các tổn thương chức năng gan nhẹ, trung bình và nặng được xác định
như sau:
Bảng 2.6. Các đặc trưng về nồng độ enzyme gan gia tăng
Xét nghiệm Bình thường U/I
a
Nhẹ
b
Trung bình
b
Nặng
b
AST
ALT
GGT
11-32
3-30
2-65
≤ 2-3
≤ 2-3
≤ 2-3
2-3 đến 20
2-3 đến 20
2-3 đến 10
> 20
> 20
> 10
a
Giới hạn bình thường tùy theo xét nghiệm được dùng do nhà bào chế cung cấp
b
Số trong bảng được nhân cho giới hạn trên của số liệu bình thường

Aminotransferase giảm xuống nhanh có thể do số lượng tế bào gan còn sống giảm và
đây là một tiên lượng xấu trong viêm gan bạo phát. Aminotransferase tăng cao có thể là bằng
chứng đầu tiên của bệnh gan và việc sàng lọc là cần thiết nhằm phát hiện bệnh gan dưới lâm
sàng. Bởi vậy, BN có mức amintransferase bình thường vẫn có thể có tổn thương gan nặng.
Tỷ suất AST/ALT có thể hữu ích trong chẩn đoán:
+ AST/ALT > 2: bệnh gan do rượu. Lý do tăng AST do với ALT có thể do thiếu
hụt một đồng yếu tố, đó là pyridoxine-5-phosphate. Thực vậy, khi BN bệnh gan do rượu uống
đồng yếu tố này thì thấy ALT huyết thanh tăng.
+ AST/ALT ≤ 1: bệnh gan ứ mỡ không do rượu thường có ALT lớn hơn AST.
Trong viêm gan virus, tỷ suất AST/ALT thường ≤ 1 nhưng có thể tăng > 1 khi có xơ gan.
2.4.1.2. Bilirubin trong nhiễm HCV
Bilirubin là anion hữu cơ nội sinh có nguồn gốc chủ yếu từ sự thoái biến hemoglobin
của hồng cầu. Tăng bilirubin huyết được xếp vào hai loại: liên kết hay không liên kết.
+ Bilirubin liên kết: ở BN tăng bilirubin huyết do rối loạn chức năng tế bào gan hoặc ứ
mật, và vì tan trong nước, cho phép bài tiết dễ dàng qua thận.
+ Bilirubin không liên kết: tăng bilirubin huyết quá cao (> 25mg/dL) thường giải thích
cho bệnh gan nặng kết hợp với một nguyên nhân tăng bilirubin huyết không liên kết (như bệnh
tan máu).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
18
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
2.4.1.3. Albumin huyết thanh trong nhiễm viêm gan virus
Albumin là một protein lưu thông quan trọng nhất được tổng hợp bởi gan, chiếm ¾ áp
lực thẩm thấu dạng keo của huyết tương. Gan là nơi tổng hợp duy nhất với khoảng 12-15 gam
mỗi ngày ở người lớn khỏe mạnh. Nồng độ albumin huyết tương giảm xuống ở bệnh gan cấp
nặng và bệnh gan mạn và là một trong các tiểu chuẩn xếp loại của Child-Pugh được dùng để
phân độ xơ gan. Mặt khác, giảm albumin máu có thể do rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức năng
thận, biến đổi kích tố, tăng thoái biến và tăng γ globulin huyết, có thể ức chế tổng hợp
albumin.
2.4.1.4. Thời gian protromblin (PT) và các yếu tố đông máu trong nhiễm

HCV
Trừ yếu tố VIII, tất cả các yếu tố đông máu được tổng hợp ở gan. Các yếu tố đông máu
xác định PT có đời sống ngắn, làm xét nghiệm phù hợp để đánh giá tổn thương gan cấp. PT là
một trong các thành phần then chốt trong tiên lượng suy gan bạo phát và viêm gan cấp do
rượu. PT kéo dài từ 2 giây trở lên hơn lô chứng được xem là bất thường. PT không phải là chỉ
số độ nhạy của bệnh gan mạn tính, vì PT có thể bình thường ngay cả ở BN xơ gan. Hơn nữa,
độ đặc hiệu của xét nghiệm thấp nếu có chứng kém hấp thu, vì các yếu tố II, VII và X phụ
thuộc vào vitamin K. Hiện nay, người ta dùng tỷ suất bình thường hóa quốc tế (INR) thay thế
PT, vì tỷ suất này dựa trên các kiểu thromboplastin có nhiều thay đổi ở các nước khác nhau.
2.4.1.5. Vai trò của dấu ấn huyết thanh AFP trong nhiễm HCV
AFP là dấu ấn chẩn đoán đặc hiệu với ung thư tế bào gan (UTTBG) và là một phương
tiện theo dõi trong điều trị ở các BN UTTBG. Tuy nhiên, không phải tất cả BN UTTBG đều
có AFP tăng, và gần 40% BN UTTBG có nồng độ huyết thanh bình thường.
AFP là kháng nguyên ung thư thai nhi đầu tiên được phát hiện và hiện nay là một dấu
ấn về u thường dùng trong UTTBG nguyên phát và các ung thư tế bào mầm không sinh tinh
của dịch hoàn. AFP là một glycoprotein chuỗi đơn, trọng lượng phân tử 79 kD), được tổng
hợp bởi túi noãn hoàng thai nhi, các tế bào nhu mô gan và các mô đường tiêu hóa có nguồn
gốc lá thai trong khác. Nồng độ đỉnh của AFP huyết thanh (3mg/ml) xảy ra trong tuần mang
thai thứ 12, sau đó AFP giảm xuống còn khoảng 0,1 mg/ml vào lúc sanh và tiếp tục giảm cho
đến nồng độ bình thường ở người lớn (≤ 10 ng/ml) vào lúc 1 tuổi.
2.4.2. Các xét nghiệm sinh học phân tử (SHPT)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
19
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Các kỹ thuật SHPT gồm có: khuếch đại mục tiêu và khuếch đại tín hiệu.
2.4.2.1. Định tính virus C bằng kỹ thuật SHPT
 Nhóm kỹ thuật khuếch đại mục tiêu
Có rất nhiều kỹ thuật đang được sử dụng như: NASBA (nucleic acid sequence based
amplification), LCR (ligase chain reaction) và RT-PCR (Reverse transcription polymerase
chain reaction).

 Kỹ thuật NASBA (nucleic acid sequence based amplification)
Là kỹ thuật khuếch đại trực tiếp RNA của virus ở nhiệt độ thường. Thực tế khi sử dụng
với virus C không cho kết quả như mong muốn nên còn ít được sử dụng. NASBA đã được
dùng để phát hiện HIV với độ nhạy cao và độ tin cậy lớn.
 Kỹ thuật LCR (ligase chain reaction)
Là kỹ thuật chuyển RNA của virus sang cDNA và cũng dùng mồi và các chu kỳ nhiệt
tương tự như PCR nhưng enzyme để nhân DNA lên là DNA ligase. Kỹ thuật bị giới hạn về độ
nhạy và tính đặc hiệu nên chưa được ứng dụng nhiều.
 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)
Đây là kỹ thuật mà RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽ
dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự
này. Kỹ thuật RT-PCR dùng để phát hiện RNA của virus C với độ nhạy cao có thể cho kết quả
dương tính với 100 đến 1000 bản sao RNA trong 1ml (Phạm Hoàng Phiệt, 2000).
Ngày nay, một số nhà sản xuất đã thành công tạo các bộ kit chẩn đoán các bệnh dựa
vào kỹ thuật RT-PCR. Trong đó, có bệnh viêm gan virus C, B, bệnh sốt xuất huyết Dengue…
 Nhóm kỹ thuật khuếch đại tín hiệu: kỹ thuật DNA nhánh
Kỹ thuật bDNA (branched DNA) có hạn chế là độ nhạy thấp hơn, mức phát hiện là
khoảng 200.000 bản sao/ml. Bởi lý do này nên không dùng để chẩn đoán (sót các trường hợp
lượng virus thấp: âm tính giả) cũng như theo dõi đáp ứng sau điều trị (âm tính chưa đảm bảo
có đáp ứng về virus ). Tuy nhiên kỹ thuật bDNA áp dụng vào định lượng virus có độ lặp lại
và độ chính xác cao.
2.4.2.2. Định lượng virus C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các thử nghiệm phát hiện kháng thể (cả EIA và RIBA)
không cho phép ước định lượng virus, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hiện chưa được áp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
20
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
dụng trong thực tế nên kỹ thuật sinh học phân tử có vị trí độc tôn trên lãnh vực này. Cả hai
nhóm kỹ thuật: khuếch đại mục tiêu và khuếch đại tín hiệu đều có thể dùng để định lượng
virus .

Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV. Một cặp mồi
được thiết kế trong vùng 5’UTR của bộ gen HCV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích
thước 103 cặp base. Phản ứng Realtime PCR còn sử dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho
HCV được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tương
ứng với một tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu này sẽ được đầu dò của máy ghi nhận. Như vậy,
số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV tạo ra ở từng thời điểm sẽ được ghi nhận chính xác
trong suốt quá trình PCR. Dựa vào một đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản
sao HCV xác định, có thể tính được số lượng bản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu.
2.4.2.3. Định type HCV
 Kỹ thuật SHPT xác định đặc hiệu type của cấu trúc gen
Thực ra kỹ thuật phân tích trình tự chuỗi acid nhân là chuẩn mực vàng, song kỹ thuật
này không thể áp dụng trong thực tế do tốn kém tiền của và thời gian. Bởi lý do trên nên các
kỹ thuật khác như chỉ phân tích một đoạn gen của virus có các thay đổi đặc hiệu với type
thường được dùng phổ biến. Các vùng gen thuờng được khuếch đại rồi phân tích là vùng
5’NCR (ít thay đổi nhất); vùng C và vùng NS5B (tương đối ít thay đổi). Sau khi khuếch đại
với kỹ thuật PCR, sản phẩm có được cho lai với các đầu dò đặc hiệu type hoặc PCR tổ
(nested-PCR) với đặc hiệu type ở vùng C và NS5B hoặc phân tích RFLP của vùng 5’ NCR
hay NS5B. Các kỹ thuật này cho kết quả phù hợp với nhau cao (94%) nhưng vẫn có một tỉ lệ
từ 3-17% không định type được (Phạm Hoàng Phiệt, 2000)
 Kỹ thuật định type huyết thanh
Đáp ứng miễn dịch có những khác biệt giữa các type. Đặc biệt ở các kháng nguyên ở
vùng NS4, E1, NS5 và phần thay đổi của vùng C có các epitop đặc hiệu type. Bởi lý do này
nên có thể dùng epitop đặc hiệu type gắn vào giá cứng để chẩn đoán nhờ vào sự phát hiện
kháng thể đặc hiệu. Martinot so sánh kỹ thuật định type huyết thanh với kết quả INNOLIPA
trên 220 BN nhiễm HCV mạn tính: độ nhạy của định type huyết thanh là 78% và của định type
là 98%. Có 8% type huyết thanh cho kết quả không phù hợp. Định type huyết thanh là một kỹ
thuật đơn giản và ít tốn kém nên vẫn có giá trị trên lâm sàng (Phạm Hoàng Phiệt, 2000).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
21
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT

 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
 Phương pháp Realtime PCR
Taqman probe được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất dập
tắt (quencher) ở đầu 3’ sao cho tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởi
chất dập tắt. Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, Taqman probe đặc
hiệu cho một type HCV sẽ bắt cặp với mạch bổ sung của trình tự tương ứng. Hoạt tính 5’-3’
exonuclease của Taq polymerase trong phản ứng sẽ loại bỏ nucleotide ở đầu 5’ có gắn chất
phát huỳnh quang của Taqman probe. Chất này tách rời khỏi probe, không còn chịu tác động
của chất dập tắt và sẽ phát huỳnh quang.
Các Taqman probe đặc hiệu cho từng type HCV sẽ được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang khác nhau (Cy5, VIC, TAMRA, FAM, HEX…). Mỗi tín hiệu huỳnh quang đặc
hiệu sẽ đánh dấu sự có mặt của một type HCV trong mẫu thử.
 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
Kit HCV định type dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc
hiệu cho HCV. Một cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa của bộ gen HCV để
nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 103 cặp base. Phản ứng Realtime PCR còn sử
dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho các type HCV 1, 2 và 6 được đánh dấu huỳnh quang.
Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang. Tín
hiệu này sẽ được đầu dò của máy ghi nhận. Như vậy, số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV
tạo ra ở từng thời điểm sẽ được ghi nhận chính xác trong suốt quá trình PCR. Dựa vào một
đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được số
bản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu và xác định chính xác các type HCV.
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
22
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị
Máy ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút dùng cho tube 1,5 ml, tủ thao tác vô trùng, máy

Realtime PCR và hệ thống máy tính, máy vortex, máy ủ nhiệt khô, máy luân nhiệt các loại ống
tube, tủ lạnh -20
0
C, bộ micropipette …
3.1.2. Hóa chất
- Bộ kit Realtime RT-PCR định lượng HCV
- Bộ kit Realtime RT-PCR định type HCV
+ Bộ kit tách chiết RNA bằng phenol/chloroform
+ Bộ kit tổng hợp cDNA
+ Bộ kit xây dựng đường chuẩn cho kit định lượng
Các bộ kit trên do công ty cổ phần thương mại – sản xuất và dịch vụ Việt Á sản xuất và
cung cấp.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
3.2.1.1. Đối tượng chọn mẫu
- BN được chẩn đoán viêm gan C dựa vào những dấu hiệu lâm sàng tại Bệnh viện Đa
khoa Trung ương Cần Thơ.
3.2.1.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
- BN có anti-HCV (+) và có hoặc không kèm theo những dấu hiệu lâm sàng sau:
+ BN có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, có thể vàng da, vàng mắt, nước tiểu đậm màu.
+ BN có dấu hiệu lâm sàng của xơ gan và ung thư gan.
3.2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
- BN không đồng ý tham gia nghiên cứu.
- BN có anti-HCV dương tính nhưng có các bệnh lý mạn tính khác kèm theo như : bệnh
phổi mạn tính, bệnh lý tim mạch, bệnh về thận
3.2.2. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang
3.2.3. Cỡ mẫu
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
23

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Chọn mẫu toàn bộ những BN theo tiêu chuẩn chọn mẫu trong thời gian từ 1/2009 đến
8/2010.
3.2.4. Cách chọn mẫu
- Chọn mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên không xác suất.
3.2.5. Các biến số cần thu thập
+ Thông tin chung về bệnh nhân: tuổi, giới, địa dư.
+ Dấu hiệu lâm sàng của BN khi được chẩn đoán.
+ Xét nghiệm anti-HCV (+).
+ Các xét nghiệm cận lâm sàng (AST, ALT, GGT).
+ Tỷ lệ HCV-RNA (+) và (-).
+ Nồng độ của HCVRNA.
+ Type HCV trên BN
3.2.6. Cách thu thập số liệu
+ Phỏng vấn bệnh nhân trực tiếp
+ Ghi nhận kết quả anti-HCV (+)
+ Tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCV tại phòng thí
nghiệm SHPT, khoa Vi sinh, BVĐKTWCT.
3.2.7. Các bước tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR
- Rút máu
Rút 1ml máu cho vào ống nghiệm
- Ly trích huyết thanh
Mẫu máu được quay ly tâm 1.500 vòng/phút/15 phút. Sau đó, tách huyết thanh và tiến
hành làm các xét nghiệm cần thiết.
- Kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCV
Định lượng hay định type HCV đều cần tiến hành 2 giai đoạn chung là: tách chiết RNA
và thực hiện phản ứng RT. Sau khi thực hiện kỹ thuật RT, dùng sản phẩm cDNA này tiến hành
kỹ thuật Realtime PCR định lượng hoặc định type HCV.
3.2.7.1. Tách chiết RNA
+ Chuẩn bị tube eppendorf 1,5ml và đánh dấu bằng ký hiệu mẫu

+ Cho 200 µl huyết thanh BN vào 1 eppendorf có sẵn 900 µl dung dịch pER1.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
24
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
+ Vortex 30 giây, để yên 10 phút.
+ Thêm vào 200 µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube
phải chuyển thành màu trắng đục.
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Hút 600µl dịch nổi có chứa RNA vào tube biopure có sẵn 600µl dung dịch pEX3
+ Trộn đều – để yên trong 10 phút
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút/10 phút
+ Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi và thu cặn màu xanh.
+ Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào tube có cặn màu xanh
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút/5 phút. Hút bỏ dịch cẩn thận không chạm vào cặn lắng.
+ Làm khô cặn ở 60
0
C/15 phút.
+ Thêm 50 µl dung dịch ER5. Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần
cặn tan hoàn toàn.
+ RNA sau khi ly trích sẽ tiến hành kỹ thuật RT hoặc trữ ở -20
0
C.
+ Muốn lưu trữ lâu phải bảo quản ở -70
0
C với RNA inhibitor.
Chú ý: Trộn đều các dung dịch trước khi sử dụng
3.2.7.2. Phản ứng RT
+ Thực hiện bước này với các tube RT-tube được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
+ Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy
tube.

+ Đánh dấu các tube bằng ký hiệu mẫu.
+ Cho 8 µl RT-Mix vào 1 tube RT-Tube
+ Cho tiếp 15 µl chứng (+), chứng (–) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube.
+ Đậy nắp tube thật kỹ và đặt vào máy PCR.
+ Sinh tổng hợp cDNA được thực hiện trên máy PCR với quy trình 25
0
C/5 phút,
42
0
C/30 phút và 85
0
C/5 phút, giữ ở 4
0
C.
+ Sản phẩm cDNA sẽ được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen.
3.2.7.3. Phản ứng Realtime RT-PCR định lượng HCV
+ Định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng Taqman probe.
+ Cho 2,5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube
iVA
HCVqPCR mix.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
25