Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin trong e coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ QUỲNH HOA

Tên đề tài:
“THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA ENZYME
SINH TỔNG HỢP VANILLIN TRONG ESCHERICHIA COLI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chun ngành
: Cơng nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH & CNTP
Lớp
: 42 - CNSH
Khoá học
: 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn : TS. Dương Văn Cường
Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hồn thành được khóa luận tốt
nghiệp này cùng với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp

đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cơ, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hồn thành luận
văn:
Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Dương Văn Cường, kĩ sư
Ma Thị Trang, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài cũng như trong q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa CNSH – CNTP đã dạy
dỗ và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện Khoa
học Sự sống – ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi được học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong q trình học tập,
nghiên cứu và hồn thành khóa luận.
Xin chân trọng cảm ơn!

Thái Ngun, ngày

tháng

Sinh viên

Lê Thị Quỳnh Hoa

năm 2014


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................2

1.3. Yêu cầu đề tài .......................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài ...................................................................2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3
2.1. Giới thiệu về vanillin............................................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc .........................................................................................................3
2.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa...................................................................................4
2.1.3. Đặc tính sinh học ...............................................................................................4
2.1.4. Vai trị vanillin trong cơng nghiệp và đời sống................................................6
2.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin .................................................................9
2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật .............................................9
2.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật .................9
2.3. Các phương pháp sản xuất vanillin ....................................................................14
2.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật ..................................................14
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học ........................................................15
2.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học.....................................17
2..4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin .........20
2.4.1. Các gen mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic................20
2.4.2. Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin. ...........22


2.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng cơng nghệ DNA tái tổ
hợp trong nước và ngồi nước .................................................................................24
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................24
2.5.2. Các nghiên cứu trong nước .............................................................................28
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............29
3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................29
3.1.1 . Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................29
3.1.2. Vật liệu ............................................................................................................29

3.1.3. Hoá chất ..........................................................................................................34
3.1.4. Dụng cụ ...........................................................................................................35
3.1.5. Thiết bị ............................................................................................................36
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .....................................................................36
3.3. Nội dung .............................................................................................................37
3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................38
3.4.1. Quy trình thực hiện .........................................................................................38
3.4.2. PCR ................................................................................................................40
3.4.3. Điện di trên gel agarose...................................................................................41
3.4.4. Tách chiết DNA plasmid .................................................................................42
3.4.5. Lập bản đồ giới hạn (Restriction mapping) ...................................................43
3.4.6. Thu nhận DNA từ gel ......................................................................................44
3.4.7. Phản ứng nối DNA ..........................................................................................45
3.4.8. Chuẩn bị tế bào khả biến .................................................................................45
3.4.9. Biến nạp DNA vào tế bào khả biến.................................................................46
3.4.10. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ....................................................46


3.4.11. Phương pháp so sánh trình tự gen đã tách dịng với các trình tự đã cơng bố
trên ngân hàng gen NCBI ..........................................................................................47
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................48
4.1. Tách dịng và giải trình tự gen ech, fcs từ P. fluorescens VTCC-B-668 ...............48
4.1.1. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen ech......................................................48
4.1.2. Kết quả tách dịng gen fcs và giải trình tự.......................................................52
4.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gen gltA, ech, fcs dựa trên nền tảng vector
pET22b(+) .................................................................................................................55
4.2.1. Kết quả gắn gen gltA vào pET22b+ tạo tổ hợp pET22-G ...............................55
4.2.2. Kết quả gắn gen ech vào vector pET22-G tạo tổ hợp pET22-GE .................57
4.2.3. Kết quả gắn gen fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF ...............60
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................61

5.1. Kết luận ..............................................................................................................61
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
I. Tiếng Việt ..............................................................................................................62
II. Tiếng Anh .............................................................................................................62


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin (Ravendra, Sharma et al. 2012) ................ 4
Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm ......................... 7
Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm ......... 8
Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất ... 19
Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T ..................................................... 30
Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b (+) .................................................... 32
Bảng 3.3: Trình tự mồi khuếch đại gen ech, fcs ....................................................... 33
Bảng 3.4: Danh mục các thiết bị ............................................................................... 36
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR....................................................................... 40
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt enzyme ............................................................ 44
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối ........................................................................ 45


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới .............................................................3
Hình 2.2: Cơng thức cấu tạo .......................................................................................4
Hình 2.3: Vanillin dạng bột .........................................................................................4
Hình 2.4 : Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) ................10
Hình 2.5: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) ..........................11
Hình 2.6: Con đường Non-oxidation decarboxylataion ............................................12
Hình 2.7: Con đường CoA-Independent Deacetylation ............................................13

Hình 2.8: Con đường Side-Chain Reductive ..........................................................14
Hình 2.9: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol .................................16
Hình 2.10: Sơ đồ con đường phân hủy acid ferulic trong P. fluorescens BF13 ............21
Hình 2.11: Con đường sinh tổng hợp vanillin trong chủng E. coli tái tổ hợp ..........22
Hình 2.12. Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA .................................23
Hình 2.13: Cấu trúc plasmid pBB1 chứa gen từ Pseudomonas fluorescens BF13...25
Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T .......................................................29
Hình 3.2: Cấu trúc vector pTZ-gltA .......................................................................31
Hình 3.3. Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) .......................................................31
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tách dịng gen ech, fcs từ P. fluorescens VTCC-B-668 ..38
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gen ...........................39
Hình 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen ech ...........................40
Hình 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen fcs.............................41
Hình 4.1: Kết quả PCR khuếch đại gen ech ..............................................................48
Hình 4.2: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech ...................................49


Hình 4.3: A-Vector pTZ-ech theo lý thuyết , B- Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme
giới hạn SacI và EcoRI..............................................................................................50
Hình 4.4: Kết quả khuếch đại gen fcs ở các dải nhiệt độ gắn mồi ............................52
Hình 4.5: Kết quả sàng lọc dịng mang vector pTZ-fcs ...........................................53
Hình 4.6: Kết quả PCR khuếch đại gen fcs ...............................................................53
Hình 4.7: Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme EcoRI và SacI .......................................54
Hình 4.8: Kết quả điện di các dịng plasmid .............................................................55
Hình 4.9: Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI............................................56
Hình 4.10: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen gltA trong pET22-G .................56
Hình 4.11: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI ................................57
Hình 4.12: Kết quả điện di các dịng plasmid của tế bào biến nạp sản phẩm gắn nối
giữa gen ech và pET22-G..........................................................................................58
Hình 4.13: Kết quả cắt plasmid đồng thời bằng 2 enzyme SacI và EcoRI ..............58

Hình 4.14: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen ech trong pET22-GE ...............59
Hình 4.15: Kết quả cắt các dòng đồng thời bằng EcoRI và BamHI .........................60


DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

4-CL

: 4-hydroxycinnamate-CoA ligase

ATP

: Adenosine triphosphate

Bp

: Base pair

CCl4

: Carbon tetrachloride
: Coenzyme Acetoacetyl
: Đại học quốc gia Hà Nội

CoA
ĐHQGHN
DNA

dNTP

: Deoxyribonucleic acid
: DNA protein kinase
: DNA protein kinase
: Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli
EDTA

: Escherichia coli
: Etilenduamin tetraacetic acid

HCLC

: 4-hydroxycinnamate CoA-

IPTG

hydratase/lyase
: Isopropy Thyogalactoside

DNA-PK
DNA-PK

Kb
LB

NCBI
PCR

: Kilo base

: Lauria Broth
: Nation Center for Biotechnology
Information
: Polymerase Chain Reaction

SDS

: Sodium doecyl sulfat

TAE
TCA

: Tris acetate EDTA
: Tricarboxylic acid
: Vanillyl alcohol oxidase
5-bromo-4chloro-3indoly-β-Dgalactoside

VAO

X-gal


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng
được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước
hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Ranadive, 1994). Mức độ tiêu thụ hàng năm trên thế

giới vào khoảng hơn 12000 tấn (Lomascolo, Stentelaire, Asther, & LesageMeessen, 1999). Vanillin cịn thể hiện các đặc tính chống khuẩn và chống oxy hóa
vanillin (Sinha, Sharma, & Sharma, 2008), đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh
vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư (Sinha et al., 2008).
Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan
Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugenol, lignin…Trong đó, vanillin được
tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, cịn lại là tổng hợp hóa
học. Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000
đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 đôla trên một
kilogam (S.-H. Yoon et al., 2005). Tuy nhiên, vanilin nhân tạo không được đánh
giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định của Mỹ và Châu Âu do thiếu
hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh
hưởng xấu tới môi trường (Muheim & Lerch, 1999).
Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp đã
kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin
tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường sinh tổng hợp
thơng qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn cơ chất như acid
ferulic, eugenol, isogenol, lignin,…
Trong các nguồn cơ chất trên, acid ferulic được nghiên nhiều về các con
đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên. Acid ferulic có
nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ
phẩm nông nghiệp. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy acid ferulic để tạo ra
vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 (Achterholt, Priefert, & Steinbuchel,
2000), Delftia acidovorans (R. Plaggenborg, Steinbuchel, & Priefert, 2001),
Pseudomonas putida (R. Plaggenborg, Overhage, Steinbüchel, & Priefert, 2003),
Streptomyces setonii (Sutherland, Crawford, & Pometto, 1983), Pseudomonas


2

fluorescens (Narbad & Gasson, 1998),… Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi

sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng
độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó
khăn bởi dịch ni cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử.
Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học trên thế giới
đã thành công trong việc tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gen sinh
tổng hợp cũng như không có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật DNA tái tổ
hợp. Trong số đó, E. coli được xem là một ứng cử viên tiềm năng cho sản xuất
vanillin bằng các hệ thống vector biểu hiện chứa các gen liên quan tới con đường
chuyển hóa sinh học từ acid ferulic đến vanillin (fcs, ech) và gen tham gia vào sự
tăng cường tổng hợp vanillin (gltA).
Ở Việt Nam, sản xuất vanillin bằng ứng dụng cơng nghệ DNA tái tổ hợp cịn
là một vấn đề mới, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở tổng hợp hố học. Xuất phát từ
thực tiễn, tơi thực hiện đề tài: “ Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme
sinh tổng hợp vanillin trong E. coli”, sử dụng gen fcs và ech được tách dòng từ
Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam và gen gltA từ E. coli.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Tách dịng và giải trình tự 2 gen ech và fcs từ chủng Pseudomonas
fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam.
- Thiết kế vector biểu hiện 3 gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp vanilin.
1.3. Yêu cầu đề tài
- Tách dịng và giải trình tự được gen fcs, ech từ chủng Pseudomonas fluorescens
VTCC-B-668
- Gắn được 3 gen fcs, ech, gltA vào vector biểu hiện pET22b(+)
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Tách dòng và tạo ra vector biểu hiện các gen tạo tiền đề cho các nghiên cứu
về biểu hiện vanillin trong E. coli sau này.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm cuả nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới cho sản
xuất vanillin tự nhiên.

3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về vanillin
2.1.1. Nguồn gốc
Vanila là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết
từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia. Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học
khác nhau được tách chiết từ vỏ quả vanillin chiếm thành phần chủ yếu (Daphna
Havkin-Frenkel & Belanger, 2007).
Lịch sử về nguồn gốc vanilin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla
planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930. Người Aztecs (Mexico) được coi
là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ. Sau đó, người Tây
Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu song mọi cố gắng để có thể trồng
được cây Vanilla planifolia đều thất bại do khơng có sự thụ phấn tự nhiên. Cho đến
khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn cưỡng sinh
sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra sự thụ phấn
nhân tạo cho hoa cuả vanila (Sinha et al., 2008).
Ngày nay, vanila được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia,
Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…(Daphna Havkin-Frenkel & Belanger, 2007).

Hình 2.1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới


4

2.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa
Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu. Về mặt

hóa học vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), có
cơng thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol (Converti,
Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010).

Hình 2.2: Cơng thức cấu tạo
Hình 2.3: Vanillin dạng bột
(Converti, Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010)
Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin
(Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012)
Đặc tính

Dữ liệu

Trọng lượng phân tử

152.15

Nhiệt độ nóng chảy

80-810C

Nhiệt độ sơi

2850C

Độ hịa tan

1g/100ml

Tỉ trọng hơi (khơng khí=1)

5.2

Áp suất hơi

2.2 x 10-3 mmHg ở 250C

Hằng số phân li

pKa1= 7.40, pKa2= 11.4(250C)

2.1.3. Đặc tính sinh học


5

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống
oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,…(Sinha et
al., 2008).
2.1.3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao
gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm (Fitzgerald, Stratford,
Gasson, & Narbad, 2005). Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm
mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả (López-Malo, Alzamora, & Argaiz,
1995) và trong bảo quản xoài chế biến tươi (Ngarmsak et al., 2006) và chống lại
một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans,
Cryptococcus neoformans (Boonchird & Flegel, 1982).
Vanillin đóng vai trị như một tác nhân kháng khuẩn chống lại Escherichia
coli, Lactobacillus p lantarum, Listeria innocua. Schiff bases (thuốc nhuộm

fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất kháng khuẩn chống lại
một số chủng Gram dương và gram âm như Pseudomonas pseudoalcaligens,
Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aero-gens, Staphylococcus
subfava, Bacillus megaterium (Vaghasiya, Nair, Soni, Baluja, & Shanda, 2004).
Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở đó vanillin
hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên.
2.1.3.2. Hoạt tính kháng oxy hóa
Vanillin đã được cơng nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính
phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới
sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl4) tác nhân gây oxy hóa ở chuột (Makni,
Chtourou, Barkallah, & Fetoui, 2012), bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi q trình
oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột (Kamat,
Ghosh, & Devasagayam, 2000). Sự có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực
phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo.


6

2.1.3.3. Hoạt tính chống ung thư và đột biến
Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến. Vanillin ức chế
đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogen peroxide,
N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin C (Gustafson et al., 2000). Vanillin ức
chế con đường Non-homologous DNA end- joining (NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên
mạch kép DNA bởi ức chế hoạt tính của DNA-PK (DNA protein kinase) (Durant &
Karran, 2003), làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mơ
hình chuột (Akagi et al., 1995).
2.1.3.4. Hoạt tính hạ lipid trong máu
Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu
mỡ trong máu. Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân hạ lipid trong máu
khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2), rối

loạn tim mạch, béo phì. Trước đó đã có nghiên cứu vanillin làm giảm lượng
triglycerin trong huyết tương, triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong
gan trên đối tượng chuột (Srinivasan & Chandrasekhara, 1992).
2.1.3.5. Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm
Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng chống tạo
hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào
hồng cầu (Abraham et al., 1991). Tuy nhiên vanillin được hấp thụ theo đường uống
khơng có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu
hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp. Lợi
ích sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần
so với vanillin tự nhiên (C. Zhang et al., 2004).
2.1.3.6. Các hoạt tính khác
Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với 5%
vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi (Tawatsin, Wratten, Scott,
Thavara, & Techadamrongsin, 2001).
2.1.4. Vai trị vanillin trong cơng nghiệp và đời sống
Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước
hoa, mỹ phẩm và dược phẩm (Sinha et al., 2008).


7

Trong công nghiệp thực phẩm, vanilla là một phụ gia rất thông dụng, đặc
biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngồi sử dụng trong sản xuất kem,
vanillin cịn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh,
kẹo, cho các loại đồ uống.
Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm
như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,….
Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm
Nguồn: CAS N°: 121-33-5

Mức độ sử dụng (ppm)
Sản phẩm
Bình thường

Tối đa

Đồ nướng

74.5

106.0

Ngũ cốc

353.0

353.0

Chất béo, tinh dầu

96.0

100.0

Nước sốt ngọt

358.0

363.0

Bánh pudding

47.7

117.0

Đồ ăn nhẹ

200.0

200.0

Đồ uống loại I

39.4

97.4

Các sản phẩm sữa

221.0

314.0

Đồ uống loại II

26.7

55.2

Bơ sữa đông lạnh

1.5

2.7

Các sản phẩm sữa

247.0

408.0

Kẹo mềm

30.1

47.1


8

Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm
Nguồn: CAS N°: 121-33-5
Sản phẩm

Hàm lượng

Đồ uống không cồn

0.0063%

Kem

0.095%

Kẹo

0.02%

Đồ nướng

0.022%

Nước ngọt

0.033-2.0%

Chocolate

0.097%

Kẹo Bonbons

Lên tới 0.05%

Chocolate sữa

Lên tới 0.03%

Đường cơ

Trạng thái vật lí

Lên tới 0.015%

TLTK

(Furia &
Bellanca, 1975)

Hồ tan hoặc rắc lên
bề mặt

ACF
ChemieFarma

Mứt kẹo

Lên tới 0.055%

Đường vanillin

2%

NV
Bột

Bình thường: 0.2%
Nước hoa
Tối đa: 0.8%

Bìnhthường:0.005%
Kem, sữa dưỡng ẩm

Hịa tan
Tối đa: 0.03%
Bình thường:0.01%

Xà bông
Tối đa: 0.1%

Opdyke, 1977


9

Vanillin còn được sử dụng trong tổng hợp thuốc một số loại thuốc như:
Aldomet (thuốc chống tăng huyết áp), L-dopa (điều trị di chứng của bệnh
Parkinson) và Trimethoprim (điều trị chứng viêm đường hô hấp cấp và một số biến
dạng của bệnh hoa liễu) (Converti et al., 2010).
Vanilin còn là một chấl khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của
nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông
thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanilin có thể cảm nhận được ngay ở
độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m3 khơng khí (Đinh Thị Ngọ và cộng
sự, 1991). Ngồi ra, vanillin cịn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn
nhiều loại dầu, làm sáng trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt
lanh, hấp dẫn cơn trùng, ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hịa tan vitamin
B1 và xúc tác phản ứng trùng hợp methyl methacrylate (Kirk & Othmer, 1983).
2.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin
2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật
Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau qua trình thụ phấn

và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla (Walton, Mayer, & Narbad,
2003).
Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong q trình lên men, được gọi là
“curing”. Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan bị thủy phân bởi
enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự do và các chất liên quan
(Odoux, Escoute, Verdeil, & Brillouet, 2003).
Mặc dù vanillin là một trong số những chất hóa học được nghiên cứu nhiều
song những con đường sinh tổng hợp chúng trong thực vật vẫn còn gây nhiều tranh
luận, bởi vì chưa có nghiên cứu chính xác nào xác định và nêu ra đặc trưng của tất
cả các bước trong con đường được đề xuất. Có một giả thiết nói rằng vanillin là sản
phẩm của con đường acid shikimic. Ở con đường này, phenylalanine hoặc tyrosine
trải qua khử amin hóa tới C6 – C3 phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trị như một cơ
chất cho vanillin (Daphna Havkin-Frenkel, Podstolski, & Knorr, 1996).
2.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật
Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để
xác định các gen mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các cơ


10

chất khác nhau như lignin, eugenol, isoeugenol, acid ferulic, glucose,…Trong đó
đáng chú ý nhiều là các chuyển hóa sinh học từ acid ferulic.
Acid ferulic (acid 4-hydroxy-3-methoxycinnamic) là một thành phần phổ
biến trong thực vật được tạo ra từ sự trao đổi chất phenylpropanoid, kết hợp với
acid dihydroferulic tạo nên tính vững chắc của thành tế bào bằng liên kết chéo giữa
lignin và polysacchatide (Ou & Kwok, 2004).
Acid ferulic là thành phần phenolic chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào
của thực vật hai lá mầm, nên nó có thể được thu từ các nguồn phế phẩm nông
nghiệp như vỏ ngô, cám ngô, củ cải đường, thành tế bào nội nhũ gạo, lúa mì, lúa
mạch. Acid ferulic cịn là cơ chất ít độc tính nhất với vi sinh vật trong số các cơ chất

được nghiên cứu. Vì vậy có thể coi đây là cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin
sinh học (Mathew & Abraham, 2006).
Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa acid ferulic thành
vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), βoxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation, CoAIndependent Deacetylation, Side-Chain Reductive .
2.2.2.1. Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
Các gen mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation
đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng (Gasson et al., 1998).

Hình 2.4 : Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)


11

Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase, mã hóa bởi gen
fcs và 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA
hydratase/aldolas được mã hóa bởi gen ech. Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển acid
ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành
một chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-hydroxypropionylScoA và tách chuỗi bên theo kiểu retro-aldol thành vanillin và acetyl-ScoA (Gasson
et al., 1998). Một gen khác liên kết với gen fcs và gen ech mã hóa enzyme vanillinxidoreductase gây oxi hóa vanillin thành sản phẩm khác (Gasson et al., 1998).
Các gen và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác định
ở các chủng Pseudomonas fluorescens AN103 (Gasson et al., 1998), Pseudomonas
sp. HR199 (Overhage, Priefert, & Steinbuchel, 1999) Streptomyces setonii
(Muheim & Lerch, 1999), Amycolatopsis sp. HR167 (Achterholt, Priefert, &
Steinbuchel, 2000), Delftia acidovorans (R. Plaggenborg et al., 2001), and
Pseudomonas putida KT2440 (R. Plaggenborg et al., 2003). Sự nhận biết về đặc
trưng của các gen mã hóa cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao
đổi chất và cấu trúc các chủng tái tổ hợp.
2.2.2.2. Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
Con đường β-oxidation deacetylation được đề xuất cho P. putida (Zenk,

Ulbrich, Busse, & Stockigt, 1980) và Rhodotorula rubra (Huang, Dostal, &
Rosazza, 1993a)

Hình 2.5: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)


12

Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ acid ferulic được xúc tác bởi
enzyme 4-CL. Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước để tạo
thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua quá trình lưu
phân (thyolytic) thành vanillyl-SCoA và acetyl-ScoA. Tiếp theo, vanillyl-ScoA
cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanilin, bước này được xúc tác bởi
enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat).
2.2.2.3. Con đường non-oxidative decarboxylation
Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng đồng
phân hóa acid ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại gốc cacboxyl
tạo thành 4-vinylguaiacol (Huang, Dostal, & Rosazza, 1993b).

Hình 2.6: Con đường Non-oxidation decarboxylataion
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Các chất trung gian của các phản ứng xi dịng tiếp theo giữa 4vinylguanicol và vanillin chưa được xác định. Đặc trưng của mỗi loại enzyme
decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật (Barthelmebs, Divies, & Cavin,
2000). Trong số đó ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất ở
mức độ thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất (Edlin, Narbad, Gasson,
Dickinson, & Lloyd, 1998).
Rhodotorul aglutinis và Rhodotorula rubra đã được báo cáo về cơ chế trao
đổi chất acid ferulic qua q trình loại nhóm cacboxyl (Huang et al., 1993a).
2.2.2.4. Con đường CoA-Independent Deacetylation

13

Trong suốt con đường này, liên kết đôi dạng trans của acid ferulic cộng nước tạo
thành một chất trung gian tạm thời là acid 4-hydroxy-3-methoxy-b-hydroxypropionic.

Hình 2.7: Con đường CoA-Independent Deacetylation
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Tiếp theo bước này enzyme aldolase phân tách acetate giải phóng trực tiếp
vanillin. Ngồi ra, chất trung gian tạm thời cịn có thể mất đi một hydro thành acid
3(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)3-ketopropionic và sau đó loại nhóm acetyl
(deacetylation) thành vanillin. Một enzyme có khả năng loại nhóm acetyl (fca) đã
được xác nhận ở chủng Pseudomonas putida WCS358 (Venturi, Zennaro, Degrassi,
Okeke, & Bruschi, 1998).
Sự tồn tại của chất trung gian tạm thời và cơ chế chính xác của con đường
này chưa được xác nhận nhận đầy đủ. Con đường CoA-Independent Deacetylation
được đề xuất cho các loài Delftia acidovorans, Pseudomonas sp., Pseudomonas.
mira, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, E. coli, Streptomyces setonii,
Aspergillus niger, Fomes fomentarius, Fusarium solani, Polysporus versicolor, và
Rhodotorula rubra (D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010).
2.2.2.5. Con đường Side-Chain Reductive


14

Đồng thời với phản ứng loại nhóm cacboxyl, acid ferulic bị đồng phân hóa
thành một chất quinoid trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid
dihydroferulic (4-hydroxy-3-methoxyphenylpropionic acid) (Rosazza, Huang, Dostal,
Volm, & Rousseau, 1995).

Hình 2.8: Con đường Side-Chain Reductive
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện cuả S. cerevisiae dưới điều
kiện yếm khí (Huang et al., 1993b) hoặc Lactobacillus plantarum (Barthelmebs et
al., 2000). Tuy nhiên, sự khử chuỗi bên này còn được báo cáo dưới điều kiện hiếu
khí ở Phanerochaete chrysosporium (Gupta, Hamp, Buswell, & Eriksson, 1981).
Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được trao đổi chất tiếp theo thành
homovanillic hoặc acid vanillic. Sau đó, acid vanillic có thể được hoàn nguyên
thành vanillin.
Acid ferulic ngoài là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin mà cịn biểu
hiện nhiều chức năng sinh lí bao gồm các hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn,
chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư. Acid ferulic chống lại các chứng
động mạch vành, cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của tinh trùng và cịn
được đánh giá là chất có khả năng chống lại các gốc tự do làm giảm thiểu các tác
động gây hại của q trình oxi hóa (Kanski, Aksenova, Stoyanova, & Butterfield, 2002).
2.3. Các phương pháp sản xuất vanillin
2.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật


15

Vanillin tự nhiên được thu chủ yếu từ nguồn hạt và vỏ quả của loài lan nhiệt
đới Vanilla planifolia (Anandarai et al. 2005). Thời gian thu hoạch thông thường từ
sáu đến tám tháng sau khi thụ phấn. Quá trình chế biến vanilla để sản xuất vanillin
bắt đầu bằng việc ủ vỏ quả đã thu hoạch cịn tươi, mục đích là để làm ngừng lại các
quá trình dinh dưỡng tự nhiên bên trong vỏ quả và thúc đẩy nhanh chóng sự hình
thành chất thơm. Mỗi vùng miền có phương pháp ủ (curing) khác nhau, điều này có
thể là tác động chính đến sự khác biệt về chất lượng vanillin trong vỏ quả.
Có một vài phương pháp chế biến vanilla song chủ yếu là chế biến theo kiểu

Mexico (Sun method) và Madagascar (Bourbon method) đều bao gồm bốn giai
đoạn chính (Ramachandra Rao & Ravishankar, 2000):
- Làm héo: Làm ngừng các quá trình tự nhiên trong vỏ quả sau thu hoạch,
đồng thời thúc đẩy các phản ứng enzyme xúc tác sự hình thành hợp chất thơm. Điều
này được nhận biết bởi các đốm nâu trên vỏ quả.
- Xông hơi: Ở bước này, nhiệt độ tăng lên nhằm thú đẩy các phản ứng
enzyme và làm khơ nhanh chóng ban đầu tránh q trình len men gây hại xảy ra.
- Làm khô: Bước này thực hiện ở nhiệt độ thường cho đến khi khối lượng vỏ
quả đạt một phần ba so với ban đầu.
- Đóng gói: Vỏ quả được lưu trữ trong các hộp đóng khoảng ba tháng, vào
thời điểm này vanillin sẽ được tạo ra.
Để thu được vanillin, vỏ quả sẽ được ngâm trong hỗn hợp ethanol và nước
bằng các phương pháp tách chiết khác nhau như ngâm chiết, xử lí nhiệt, …..sản
phẩm có thể ở dạng lỏng hay bột tùy mục đích sử dụng.
Sản xuất vanillin tự nhiên từ nguồn thực vật không chỉ mất nhiều cơng lao
động mà cịn bị giới hạn bởi sự dao động thất thường về năng suất cùng với điều
kiện nông nghiệp và các vấn đề về kinh tế và chính trị. Để tạo ra 1 kg vanillin tách
chiết phải cần tới 500 kg vỏ quả tương đương với gần 40000 hoa được thụ phấn
(Ramachandra Rao & Ravishankar, 2000). Do vậy, số lượng vanillin tách chiết tự
nhiên chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường (Zamzuri & Abd-Aziz, 2013).
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học


16

Q trình hóa học đầu tiên để thu vanillin được thực hiện bởi Tiemann vào
năm 1876. Nguyên liệu là eugenol có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử
dụng thương mại cho đến những năm 1920. Sau đó vanillin được tổng hợp bằng
dịch kiềm sunphit giàu lignin là sản phẩm phụ của ngành cơng nghiệp giấy. Q
trình tổng hợp vanillin bao gồm xử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các chất oxi

hóa, pH kiềm, nhiệt độ và áp suất cao. Các chất oxi hóa có thể là khơng khí, oxi,
nitrobenzene hoặc khơng có sự hỗ trợ của các chất xúc tác. Lignin bị phân hủy và
oxi hóa, vanillin được tạo thành kèm theo các sản phẩm phụ khác (Bjørsvik &
Liguori, 2002).
Sự có mặt cuả các chất tạp nhiễm địi hỏi phải sử dụng các q trình tinh
sạch cao. Ngày nay sản xuất vanillin từ lignin không phổ biến nữa bởi vì tác động
xấu tới mơi trường. Hơn nữa, dù là cơ chất có nguồn gốc từ tự nhiên song tổng hợp
vanillin từ lignin vẫn bị ghi nhãn là vanillin nhân tạo bởi vì có sự biến đổi hóa học
để thu được sản phẩm cuối cùng (Hopp & Rabenhorst, 2000).
Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu
guaiacol và acid glyoxylic (Kumar, Sharma, & Mishra, 2012). Đây là một quá trình
gồm hai bước bắt đầu với phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guanicol
và acid glyoxylic tạo thành acid vanillylmandelic và tiếp đó được chuyển thành
vanillin bởi q trình loại nhóm CO2 oxi hóa. Thứ tự của các phản ứng được chỉ ra
ở hình 2.9

Hình 2.9: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol
(Kirk & Othmer, 1983)
Vanillin thu được từ guaiacol bằng kĩ thuật này gần như khơng có các sản
phẩm phụ, do vậy vai trị của qui trình tinh sạch sản phẩm sẽ được đơn giản hóa.
Mặc dù q trình này làm giảm tác động mạnh tới mơi trường khi so sánh với sản
xuất từ lignin, song guaiacol là một sản phẩm hóa dầu cũng như vanillin khi tổng