Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải một số bệnh viện tại hà nội bằng kỹ thuật LC MS 2013

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2013
.

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Ths. Nguyễn Thanh Phương
2. Ths. Nguyễn Trung Hiếu
Nơi thực hiện:
1. Phòng phân tích II-
TT kiểm nghiệm
Dược phẩm- Mỹ phẩm Hà Nội
2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013
.

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến Ths Nguyễn Thanh
Phương, Ths Nguyễn Trung Hiếu, Dược sỹ Dương Thị Vân đã trực tiếp
giúp đỡ cung cấp cho em những tài liệu, hướng dẫn em những kỹ năng cần
thiết để em hoàn thành khóa luận này.
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành
của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ em trong
suốt thời gian qua.
Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại
học Dược Hà Nội, các cán bộ phòng phân tích II- Trung tâm kiểm nghiệm
Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề
tài.
Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, phòng

đào tạo đã tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành quá trình học tập tại
trường.
Cuối cùng, em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người đã luôn
động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như
ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2013.
Sinh viên
Phạm Thị Nga.




.

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.
3
1.1. TỔNG QUAN VỀ SULFAMETHOXAZOL.
3
1.1.1. Công thức cấu tạo.
3

1.1.2. Tính chất.
3
1.1.3. Cơ chế tác dụng.
4
1.1.4. Dược động học, độ ổn định.
5
1.1.5. Tác dụng dược lý.
6
1.1.6. Chỉ định.
6
1.1.7. Tác dụng không mong muốn.
6
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL.
7
1.2.1. Phương pháp đo nitrit.
7
1.2.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.
7
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ.
8
1.3.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ.
9
1.3.2 Một số kỹ thuật LC-MS.
16

.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGIÊN CỨU.

18
2.1.1. Hóa chất, thuốc thử.
18
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ.
18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu.
19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
19
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích.
19
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích.
20
2.2.4. Ứng dụng phương pháp.
20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
20
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích.
20
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích.
20
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu.
22
2.3.4. Ứng dụng phương pháp.
23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
24
3.1. KHẢO SÁT VÀ TÌM ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ.
24
3.1.1. Xây dựng chương trình sắc ký.

24
3.1.2. Xây dựng chương trình sắc ký khối phổ.
28
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH
SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN.
31
3.3. CHUẨN BỊ MẪU.
33
3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.
34
3.4.1. Tính chọn lọc.
34
3.4.2. Xác định khoảng tuyến tính.
35
3.4.3. Tính thích hợp.
37
3.4.4. Độ đúng.
37
3.4.5. Độ chính xác.
39
.

3.4.6. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ.
39
3.4.7. Khảo sát độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi.
40
3.5. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL TRONG
MỘT SỐ MẪU NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN.
42
3.6. BÀN LUẬN.

44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.
46
KẾT LUẬN.
46
ĐỀ XUẤT.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.

PHỤ LỤC.

















.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Nội dung
Trang
01

Kết quả lựa chọn dung môi pha động

25

02

Kết quả lựa chọn tốc độ dòng

26

03
So sánh khả năng chiết
32
04

Cách pha dãy dung dịch chuẩn

33

05

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của sulfamethoxazol

36

06

Kết quả khảo sát tính thích hợp

37

07

Kết quả khảo sát độ đúng

38

08
Kết quả khảo sát độ chính xác
39
09
Độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi
41
10

Kết quả hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong
một số mẫu nước thải bệnh viện
43
11
Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm
Phụ lục

.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình
Nội dung
Trang
01

Các bộ phận của detector khối phổ

11

02

Mô hình nguyên lý kỹ thuật APCI

12

03
Mô hình nguyên lý kỹ thuật ESI

13
04

Sơ đồ bộ phân tích ion bẫy tứ cực

14

05

Một số bộ phân tích khối khác

15

06

Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030

19

07

Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN-H
2
O : 1-1)

25

08
Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H
2

O: 8-2)
25
09

Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H
2
O: 2-8)

26

10

Sắc ký đồ mẫu chứa SMZ với điều kiện sắc ký đã khảo sát
lại.
27

11
Phổ khối của SMZ 0,05 ppm pha trong ACN: H
2
O (1:1).
29
12
Phổ khối của SMZ thu được ở các mức năng lượng va
chạm CE= 25V
30
13

Sắc ký đồ mẫu trắng

34

14

Sắc ký đồ mẫu sulfamethoxazol chuẩn nồng độ 0,05 µg/ml

34

15
Sắc ký đồ mẫu thử
35
16

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ
sulfamethoxazol
36

17

Sắc ký đồ khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng
40

18
Sắc ký đồ mẫu thử DHY (TXL)
Phụ lục
19

Sắc ký đồ mẫu thử DHY (SXL)

Phụ lục

20

Sắc ký đồ mẫu thử TN (TXL)

Phụ lục

.

21

Sắc ký đồ mẫu thử TN (SXL)

Phụ lục

22

Sắc ký đồ mẫu thử BM (TXL)

Phụ lục

23
Sắc ký đồ mẫu thử BM (SXL)
Phụ lục

.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN:
Acetonitril.
Full scan:
Kỹ thuật phân tích toàn thang.
HPLC:
High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao).
LC-MS:
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass

Spectrometry).
LC-MS/MS:
Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (Liquid Chromatography
Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry).
LOQ:
Giới hạn định lượng dưới (Limit of Quantitation).
Lt:
Lý thuyết.
m/z:
Khối lượng / Điện tích.
RSD% :
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation).
SPE:
Solid phase extraction (Chiết pha rắn).
STT:
Số thứ tự.
SMZ:
Sulfamethoxazol.
SD:
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation).
SIM:
Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion.
IT.s :
Cường độ tín hiệu.giây (intensity.second).
SXL:
Sau xử lý.
TB:
Trung bình.
Tt:
Thực tế.

TXL:
Trước xử lý.
.
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát hiện ra kháng sinh và các đặc tính của chúng đã tạo ra một
cuộc cách mạng lớn trong y học, cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do
vi khuẩn gây ra. Hiện nay, kháng sinh là dạng thuốc được dùng phổ biến ở
nước ta, một quốc gia có mô hình bệnh tật chiếm tỷ lệ khá cao là nhiễm
khuẩn. Chính việc lạm dụng kháng sinh quá mức dẫn đến tình trạng kháng
thuốc nghiêm trọng. Hầu hết, các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra
môi trường dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư trong các
dụng cụ y tế, bông, băng, điều này đã góp phần vào sự tồn dư kháng sinh
trong nước thải, đặc biệt là trong nước thải bệnh viện. Không những thế,
lượng kháng sinh bằng các con đường khác nhau thải ra môi trường càng làm
gia tăng tình trạng đáng lo ngại này. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến
môi trường thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật của đất [28], [29], [30], [31].
Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình
chuyển hoá vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù
bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái
hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường.
- Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi
trường [28], [29], [30], [31].
Kháng sinh được thải ra môi trường bằng nhiều con đường khác nhau,
trong môi trường chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi
khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là
vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường.

- Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm [28], [29], [30], [31].
.
2

Sử dụng nguồn nước thải chưa được xử lý của một số công ty sản xuất
dược phẩm hay một số bệnh viện, sử dụng kháng sinh trong trồng trọt, chăn
nuôi T
ất cả những nguyên nhân trên làm cho thực phẩm tồn dư kháng sinh,
có ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe của người tiêu dùng. Các chuyên gia còn
cảnh báo, đã xuất hiện mối đe dọa, sau hơn chục năm hoặc vài chục năm nữa
chúng ta sẽ bất lực với nhiều chứng bệnh, thậm chí không còn kháng sinh dự
phòng khi nhiễm khuẩn nhẹ.
Sulfamethoxazol là một kháng sinh thuộc nhóm sulfamid, là nhóm có
hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong bệnh viện để điều trị nhiễm khuẩn
đặc biệt là nhiễm khuẩn tiết niệu [7]. Do đó, khả năng có mặt của
sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện là rất lớn. Mặc dù, có xuất hiện
trong nước thải bệnh viện nhưng hàm lượng của chúng lại rất nhỏ, những
phương pháp phân tích thông thường đôi khi lại không phát hiện được. Xuất
phát từ thực tế trên đây, chúng tôi thực hiện đề tài:
“ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng
kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải một số bệnh viện tại Hà Nội
bằng kỹ thuật LC-MS”
Với các mục tiêu sau:
 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng sinh
sulfamethoxazol bằng kỹ thuật LC-MS.
 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng.
 Khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải tại
một số bệnh viện tại Hà Nội.

.
3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.

1.1. TỔNG QUAN VỀ SULFAMETHOXAZOL [3], [4], [5], [6], [7], [9].
1.1.1. Công thức cấu tạo [4], [7], [24], [25].


Công thức phân tử: C
10
H
11
O
3
N
3
S.
Phân tử lượng: 253.28.
Tên khoa học: N
1
-(5- methyl-3-isoxasolyl) sulfanilamid.
1.1.2. Tính chất [4], [9], [10], [13], [14], [20], [24], [25].
 Tính chất lý học:
Bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà, không mùi, vị đắng nhẹ. Thực tế
không tan trong nước, tan 1 phần 50 trong ethanol 96%, tan 1 phần 3 trong
axeton, ít tan trong ether và cloroform, tan trong dung dịch kiềm loãng. Dạng
muối natri sulfamethoxazol dễ tan trong nước.
Nhiệt độ nóng chảy: 169
o

C đến 172
o
C.
pH: Hỗn dịch SMZ 10% trong nước không có CO
2
có pH từ 4 đến 6.
pKa: 5,6.
Dahlan và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến độ tan và tốc độ
hòa tan của sulfamethoxazol và trimethoprim. Độ tan của SMZ giảm khi pH
giảm và nhỏ nhất ở pH = 3,22 và 25
o
C trong hệ đệm glycin, ở pH thấp hơn độ
tan của SMZ tăng nhanh thể hiện tính chất lưỡng tính của SMZ. Tốc độ hòa
tan của SMZ trong hệ đệm ở 25
o
C giảm khi pH tăng trong khoảng pH = 1,23-
7,60. Ở pH = 7,60 tốc độ hòa tan của SMZ tăng.
.
4

 Tính chất hóa học:
SMZ có tính lưỡng tính, tính kiềm do nhóm amin thơm và có tính acid
do nguyên tử H ở chức amid linh động, dễ tạo muối Na tan tốt trong nước.
Nhưng nếu pha trong dung dịch pH thiên về acid sẽ trả lại dạng acid không
tan trong nước làm dung dịch bị vẩn đục.
Do có nguyên tử H linh động SMZ tạo muối phức kết tủa với Ag
+
, phức
màu kết tủa với Cu
++

, Co
++

Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hóa, rồi ngưng tụ với α(β)-
naphton cho phẩm azoic màu đỏ cam. Người ta thường dựa vào nhóm này để
định lượng bằng phép đo nittrit với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột có iod
hoặc tropeolin 00 hoặc dùng điện kế. Nhóm amin thơm làm phân tử dược chất
rất dễ bị oxy hóa nên phải có các biện pháp chống oxy hóa thích hợp để ổn
định dược chất khi pha thành dung dịch.
1.1.3. Cơ chế tác dụng [5], [6], [9], [10], [11], [14].
Với nồng độ thấp, SMZ là một sulfamid kìm khuẩn, với nồng độ cao nó
có tác dụng diệt khuẩn. Một số vi khuẩn trong quá trình tổng hợp và chuyển
hóa acid folic thành nucleoprotein cần thiết cho cơ thể. Do SMZ có cấu trúc
tương tự acid para aminobenzoic PABA nên nó có khả năng tranh chấp cao
với chất này. Từ đó ức chế được dihydrofolat synthetase. SMZ ngăn cản tổng
hợp acid folic đồng thời ức chế dihydrofolat synthetase nên kìm hãm quá
trình chuyển acid folic thành acid dihydrofolic. Do đó, quá trình tổng hợp
acid folic (là 1 acid cần thiết cho quá trình tăng trưởng của các chủng vi
khuẩn nhậy cảm) bị ức chế ngay từ giai đoạn I.




.
5

Sulfamethoxazol

(-)

Dihydrofolat synthetase



Pteridin + PABA Acid folic
Đối với vi khuẩn không tổng hợp acid folic hay không sử dụng acid folic
thì hiển nhiên, nó sẽ không chịu tác động của sulfamid kháng khuẩn này.
1.1.4. Dược động học, độ ổn định [5], [6], [7].
 Dược động học:
Hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng cao, đạt nồng độ trong
huyết tương xấp xỉ đường tiêm tĩnh mạch. Thuốc phân bố rộng rãi vào các mô
và dịch cơ thể, kể cả dịch não tủy. SMZ chuyển hóa ở gan và thải trừ chủ yếu
qua nước tiểu ở dạng nguyên vẹn và dạng đã chuyển hóa.
Thời gian bán thải 9 – 11 giờ ở người bình thường và kéo dài ở bệnh
nhân suy thận.
 Độ ổn định:
Trong môi trường acid HCl 0,4M, SMZ có thể bị thủy phân thành acid
sulphanilic và 5- methyl-3-amino isoxazol và tiếp tục bị phân hủy khi đun
nóng. Trong môi trường kiềm SMZ tương đối bền vững.
SMZ không bền dưới tác động của nhiệt và rất nhạy cảm với ánh sáng
mặt trời. Các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ làm tăng quá trình oxy hóa tạo các
sản phẩm khác nhau. Dung dịch sẽ bị biến màu từ không màu thành màu vàng
rồi sang màu nâu.
.
6

1.1.5. Tác dụng dược lý [5], [7].
SMZ là 1 sulfamid kháng khuẩn , tác dụng lên nhiều vi khuẩn Gram âm
như lậu cầu, mô não cầu và Gram dương như liên cầu, tụ cầu, phế cầu
Hiện nay, đã có 1 số loại vi khuẩn kháng thuốc (vi khuẩn kị khí, Enter –

ococcus) nhưng SMZ còn rất đặc hiệu trong việc điều trị nhiễm khuẩn đường
tiết niệu (do Escherichia coli). Đặc biệt, với chứng lẹo mắt (sưng mí mắt cấp
tính) gây ra bởi vi khuẩn như Staphylococus (hiện nay thuốc nhỏ mắt có chứa
SMZ thường dùng với mục đích này).
1.1.6. Chỉ định [5], [7].
Dạng bào chế viên nén, thuốc tiêm thường kết hợp với trimethoprim
(sulfamethoxazol : trimethoprim theo tỷ lệ 5:1) dùng để điều trị các nhiễm
khuẩn do khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm: Nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục,
nhiễm khuẩn hô hấp (như viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa ) nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa vì dạng này có khả năng kháng khuẩn cao.
Thuốc nhỏ mắt có chứa natri sulfamethoxazol kết hợp với 1 số thành
phần khác (biệt dược Rhoto antibacteria) được dùng để điều trị trong các
trường hợp lẹo mắt, viêm kết mạc, viêm mí mắt. Ngoài ra, dùng để chống bội
nhiễm trong các trường hợp như loại bỏ các dị vật ra khỏi mắt.
1.1.7. Tác dụng không mong muốn [5], [7].

- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, tiêu chảy, viêm miệng, viêm lưỡi.
- Thận: Viêm kẽ thận, suy thận, sỏi thận.
- Da: Ban da, mày đay, mụn phỏng, hội chứng Steven- Johnson và Lyell.
- Máu: Thiếu máu hồng cầu to do thiếu acid folic, thiếu máu tan máu,
giảm huyết cầu tố.
- Ngoài ra, vàng da ứ mật, tăng K
+
huyết, ù tai, ảo giác. Tiêm tĩnh mạch
có thể gây viêm tĩnh mạch, tổn thương mô.
.
7

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL
[3], [4], [11], [12], [13], [24], [25].

- Định lượng nguyên liệu: Dùng phương pháp đo nitrit, hoặc dùng phương
pháp đo quang dựa trên sự tạo phức của SMZ, tạo sản phẩm có màu đỏ. Cũng
có thể dùng kỹ thuật HPLC.
- Định lượng đa thành phần hay thành phẩm: Dùng HPLC với detector
UV.
1.2.1. Phương pháp đo nitrit [3], [24], [25].
Hòa tan khoảng 0,200 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 50 ml dung dịch
acid hydroclorid 10% (TT) và 50 ml nước. Thêm 3g kali bromid (TT), làm
lạnh dung dịch trong nước đá và chuẩn độ chậm bằng dung dịch natri nitrit
0,1M (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng chuẩn độ đo ampe.
1ml dung dịch natri nitrit 0,1M (CĐ) tương đương với 25,33
mg
C
10
H
11
N
3
O
3
S.
1.2.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [11], [12], [13], [14].
Điều kiện phân tích bằng HPLC đã áp dụng:
- Cột Sulpenco RP-C18: 25 cm x 4,6 mm, 5 µm.
- Pha động: Dung dịch đệm phosphat pH 5,8 : Acetonitril (83:17).
- Tốc độ dòng: 1,7 mL/ phút.
- Detector UV: 245 nm.
- Thể tích tiêm : 20 µl.
Các phương pháp trên có giới hạn phát hiện thấp, thường dùng để định
lượng kháng sinh SMZ trong chế phẩm. Do hàm lượng kháng sinh trong

nước thải bệnh viện tương đối thấp nên các phương pháp trên không đáp ứng
được yêu cầu. Chính vì thế, cần sử dụng LC-MS với độ nhạy cao hơn để định
lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện.

.
8

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [1], [8], [15].
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết
nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS). Sau
quá trình thử nghiệm lâu dài, đến đầu những năm 1970 người ta mới kết nối
thành công hệ thống LC với MS. Nguyên nhân của sự chậm trễ này chủ yếu là
do khó khăn về kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân
không cao của máy khối phổ (MS). Kể từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ
LC-MS không ngừng phát triển và chứng minh được tầm quan trọng của
mình trong phân tích.
Phương pháp LC-MS thường được sử dụng trong phân tích dược phẩm
để phân tích:
- Các hợp chất tương đối phân cực hoặc phân cực nhiều, khó bay hơi (GC-
MS rất khó thực hiện hay không thực hiện được).
- Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC thường không giải quyết
được.
- Phân tích thuốc trong dịch sinh học.
- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc.
- Trường hợp không tìm được các detector thích hợp.
Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Giới hạn
phát hiện có thể đến 10
-14
gam. Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị,

xác định công thức cấu tạo, định tính, định lượng các chất trong dịch sinh học
và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Đặc biệt, dùng để phân tích
hàm lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp.


.
9

1.3.1. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ.
1.3.1.1. Pha động
Trong sắc ký lỏng, thành phần của dung môi rửa giải (pha động) là một
trong những yếu tố ảnh hưởng tới sự tách. Pha động thường là hỗn hợp các
dung môi hòa tan vào nhau để có thể tách chất với độ phân giải phù hợp.
Trước khi sử dụng cần phải lọc (màng lọc 0,45 hoặc 0,2 µm), đuổi khí hòa tan
trong pha động, vì khí hòa tan có thể làm biến dạng, giảm hiệu lực cột, nhiễu
đường nền. Có thể loại khí hòa tan bằng cách: Chạy siêu âm, sục khí trơ như
heli
Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc
ký.
- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường sử dụng từ 2
đến 4 loại dung môi khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình
sắc ký theo chương trình dung môi đã định. Chế độ rửa giải gradient nồng độ
thích hợp với những mẫu phân tích gồm nhiều thành phần có độ phân cực
khác nhau nhiều, khi đó chế độ này rút ngắn thời gian phân tích và tăng độ
phân giải.
1.3.1.2. Hệ thống bơm:
- Chức năng: Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ
bình dung môi qua hệ thống sắc ký.
- Yêu cầu:

+ Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng liên tục qua cột tách. Dòng
không liên tục sẽ gây nhiễu đường nền.
+ Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).


.
10

1.3.1.3. Hệ tiêm mẫu:
Hiện nay, các máy HPLC hiện đại đều sử dụng hệ thống tiêm mẫu tự
động. Đây là một ưu điểm lớn của HPLC vì có thể tích chính xác và độ lặp lại
rất cao.
1.3.1.4. Cột sắc ký.
Cột tách thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất
dẻo có chiều dài từ 10 - 30 cm, đường kính trong 4 - 10 mm. Kích thước của
hạt nhồi trong cột thường là 5 - 10 µm. Các chất nhồi cột thường được sử
dụng là silicagel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C8,
C18,
Cột tách yêu cầu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có
thể chịu được áp suất cao.
1.3.1.5. Detector khối phổ.
Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột,
các tín hiệu này được ghi trên sắc đồ.
 Việc sử dụng khối phổ làm detector có những ưu điểm sau:
- Độ nhạy cao, phân tích được các chất có giới hạn phát hiện thường ở mức
phần tỷ (ppb).
- Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về khối lượng và cấu tạo hóa học
của chất phân tích.
- Làm tăng tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích.
 Nguyên tắc hoạt động:

Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ nguyên tử hay phân tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra
trong hệ thiết bị chân không, áp suất trong hệ giao động từ 10
-3
Pa đến 10
-6
Pa.
.
11

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc một phổ khối. Nó
cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác
định cấu trúc và định lượng các chất.
 Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến thành tín hiệu
điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

Hệ chân không (áp suất 10
-3
: 10
-6
Pa)

Hình 01 : Các bộ phận của detector khối phổ
 Bộ nạp mẫu: Là đầu ra của máy sắc ký lỏng kết nối với khối phổ.
 Bộ nguồn ion hóa:
• Nhiệm vụ:
- Ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu.
- Ion hóa chất cần phân tích.
- Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi.
- Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối.
- Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân
không sâu.
- Rút ra ngoài các phân tử trung hòa và ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới
phép đo.

Nạp mẫu
Nguồn
ion
Phân tích
khối
Detector
Bơm chân
không

Xử lý dữ
liệu

.
12

• Các kỹ thuật ion hóa:
Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật: Kỹ thuật phun điện tử (ESI) và

kỹ thuật ion hóa bằng hóa học ở áp suất thường (APCI).
 Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường APCI (Atmospheric pressure
chemical ionization).
- Nguyên tắc: Phân tử hòa tan trong dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi,
các phân tử hơi được phun ra nhờ khí N
2
và bị ion hóa trong vùng phóng điện.
- Hiện tượng ion hóa xảy ra:
+ Cơ chế tạo ion dương:
N
2
+ e
-
→ N
2
+
+ 2e
-
H
2
O + e
-
→ H
2
O
+
+ 2e
-
H
2

O + H
2
O
+
→ H
3
O
+
+
∙
OH (Phản ứng ion- phân tử)

M + H
3
O
+
→ MH
+
+ HO (Phản ứng ion- phân tử)
+ Cơ chế tạo ion âm:
Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện có sự ion hóa
của phân tử bằng cách mất đi một H
+
, phần còn lại là một anion:

∙
OH + M-H

→ M
-

+ H
2
O

Hình 02: Mô hình nguyên lý kỹ thuật APCI.
.
13


 Kỹ thuật phun ion ESI (Electrospray ionization).
Kỹ thuật ESI là kỹ thuật được sử dụng trong khóa luận này và cũng
là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong LC- MS.

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một
ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-5 kV (điện thế dương ở đầu kim loại
tạo ion dương, và ngược lại) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra
xung quanh ống mao quản. Dưới tác động của điện thế cao và luồng khí phun
nitơ, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao
quản. Sau khi qua ống mao quản, dưới tác động của khí nóng và luồng khí
phun nitơ, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần
và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bẻ dần tạo thành những hạt
nhỏ mang điện tích. Sau đó các ion âm hay ion dương tạo thành được đưa vào
bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra
ngoài.

Hình 03: Mô hình nguyên lý kỹ thuật ESI.

.
14

 Bộ phân tích khối:
Bộ phận này được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách
các ion của máy có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Các ion
được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến
detector.
Bộ phân tích khối trong luận văn này là bộ phân tích bẫy ion tứ cực
(Quadrupole ion trap).
Thế xoay chiều tần số radio áp vào cực trung tâm sẽ đưa các ion vào
chuyển động tròn trong hốc với quĩ đạo ổn định. Bằng cách thay đổi thế xoay
chiều làm cho các ion có m/z xác định chuyển động theo quĩ đạo không ổn
định rơi vào cực phía dưới bẫy. Bộ phận nhận electron của detector sẽ thu
nhận và phát hiện ion.



Hình 04: Sơ đồ bộ phân tích ion bẫy tứ cực.




.
15

Bộ phân tích tứ cực đơn.
Bộ phân tích từ.

Bộ phân tích thời gian bay.
Bộ phân tích cộng hưởng ion
cyclotron.



Hình 05: Một số bộ phân tích khối khác.
 Bộ phận phát hiện ion.
Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện
tử của máy khối phổ.
 Bộ phận xử lý dữ liệu
Toàn bộ hệ thống LC-MS được kết nối với máy tính đã cài đặt phần
mềm thích hợp, người phân tích giao tiếp với hệ thống qua máy tính trên phần
.