KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRÊN ĐĨA THẠCH, ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
www.hsph.edu.vn
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH SALMONELLA
TRÊN ĐĨA THẠCH
www.hsph.edu.vn
MỤC TIÊU
•
Trình bày được phạm vi áp dụng qui trình xác định
Salmonella trên đĩa thạch.
•
Nêu và thực hiện được các bước của qui trình xác định
Salmonella trên đĩa thạch.
•
Nhận định được kết quả của qui trình xác định
Salmonella trên đĩa thạch.
www.hsph.edu.vn
Phạm vi áp dụng
•
Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi
•
Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và xử lý thực
phẩm
www.hsph.edu.vn
Nguyên lý
•
Phát hiện Salmonella trong mẫu thử bằng cách phân lập
và xác định các khuẩn lạc điển hình hoặc ít điển hình
trên môi trường chọn lọc kết hợp với các phản ứng sinh
hoá đặc trưng trong phép thử khẳng định.
(-)
(+) (+) (-)

Môi trường TSI
MT Hektoen enteric
www.hsph.edu.vn
Salmonella
•
Trực khuẩn
•
Gram âm
•
Không sinh nha bào
•
Có khả năng di động
•
Đặc điểm sinh hóa:

Lên men glucose và manitol

Không lên men saccharose và lactose

Không sinh indole

Không phân giải ure

Không có khả năng tách nhóm amine
từ tryptophan

Hầu hết các chủng đều sinh hydro
sulfur (H
2
S).

www.hsph.edu.vn
TIẾN HÀNH
www.hsph.edu.vn
Chuẩn bị dụng cụ
•
Bình tam giác
•
Que cấy
•
Đèn cồn
•
Găng tay
•
Cân mẫu
•
Dụng cụ đồng nhất mẫu
www.hsph.edu.vn
Chuẩn bị môi trường
•
Pepton
•
RV (Rappaport Vassiliadis)
•
Tetrathiolate
•
Đỏ phenol lục sáng
•
HE (Hektoen enteric)
www.hsph.edu.vn
Chuẩn bị môi trường (tiếp)

•
Thạch TSI
•
Thạch ure
•
Canh thang Trypton
•
Canh thang MR-VP
www.hsph.edu.vn
Chủng chuẩn
•
Chứng dương: Salmonella typhimurium ATCC 14028
•
Chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922
Các chủng phải ở trạng thái hoạt hoá
www.hsph.edu.vn
Thuốc thử
•
Thuốc thử cho các phản ứng thử sinh hóa:
- Thuốc thử Kovacs: Phản ứng sinh idol
- Thuốc thử Barritt: Phản ứng VP
Dung dịch A: 5% α-napthol trong cồn tuyệt đối (để tủ
lạnh trước khi dùng)
Dung dịch B: 40% NaOH/KOH
www.hsph.edu.vn
Bước 1: Tiền tăng sinh trong
môi trường lỏng không chọn
lọc
•
Cân 25g mẫu thử đã đồng nhất cấy vào 225 ml nước

đệm peptone
•
Ủ và nuôi cấy các ống nghiệm ở 37±1
o
C / 18 ± 2h
www.hsph.edu.vn
Bước 2: Tăng sinh trong môi
trường lỏng chọn lọc
•
Chuyển 0,1ml dịch nuôi
trong đệm pepton vào ống
nghiệm có sẵn 10ml môi
trường (RV), ủ ở 36±1
o
C

C /
24±3 h
Âm tính Dương tính
www.hsph.edu.vn
Bước 2: Tăng sinh trong môi
trường lỏng chọn lọc (tiếp)
•
Cấy chuyển 1ml dịch nuôi cấy
đệm pepton vào bình có sẵn
10ml môi trường canh thang
Tetrathionate, ủ ở 41,5±1
o
C
trong 24±3 h

www.hsph.edu.vn
Bước 3: Cấy chuyển lên môi
trường thạch chọn lọc
•
Lấy một vòng que cấy dịch nuôi cấy từ môi
trường RV cấy chuyển lên hai đĩa môi trường:
thạch đỏ phenol lục sáng và Hektoen enteric.
•
Lấy một vòng que cấy dịch nuôi cấy từ môi
trường canh thang Tetrathionate, cấy chuyển lên
hai đĩa môi trường: thạch đỏ phenol lục sáng và
Hektoen Enteric.
•
Ủ ở 37
o
C / 21-27h.
www.hsph.edu.vn
Bước 4: Nhận dạng khuẩn lạc
Salmonella
•
Trên thạch đỏ phenol lục sáng: khuẩn lạc đục,
làm thay đổi màu môi trường từ hồng sang đỏ.
•
Trên thạch Hektoen Enteric: khuẩn lạc
Salmonella điển hình thường màu xanh, có tâm
đen hoặc không.
•
Lưu ý: Nếu Salmonella mọc yếu hoặc không có khuẩn
lạc điển hình thì phải ủ tiếp ở 35 – 37
o

C trong 24 giờ
nữa và kiểm tra lại.
•
Chọn tối thiểu 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển vào môi
trường BHI hoặc TSA để thử phản ứng sinh hoá
www.hsph.edu.vn
Đỏ phenol lục sáng HE
www.hsph.edu.vn
Bước 5: Kiểm tra tính chất sinh
vật hóa học của Salmonella
•
Lên men đường glucose (+), saccarose (-), lactose (-)
•
Khả năng sinh H
2
S (+/-)
•
Khả năng phân giải Ure (-)
•
Khả năng sinh Indol (-)
•
Lysin decarboxyl (+)
•
Phản ứng VP (-)
www.hsph.edu.vn
Thử nghiệm lên men đường
•
Mục đích
Phát hiện VSV có khả năng lên men đường glucose
Chủng VSV MT TSI

37
o
C / 24h
(-) (+)
Âm tính
Dương tính
www.hsph.edu.vn
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
S
•
Mục đích
Phát hiện VSV có khả năng sử dụng thiosulfate
Chủng VSV MT TSI
37
o
C / 24h
Âm tính Dương tính
www.hsph.edu.vn
Hình ảnh trên môi trường TSI
www.hsph.edu.vn
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
•
Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV
có hệ emzym tryptophanase
Chủng VSV MT canh trypton
Thuốc thử Kovac’s
Pứ dương tính Pứ âm tính

44
o
C / 24h
www.hsph.edu.vn
Kết quả phản ứng sinh Idol
Salmonella không sinh Indol
(+) (-)
www.hsph.edu.vn
Thử nghiệm Urease
•
Mục đích
Phát hiện VSV có mang urease
Chủng VSV MT Urea
37
o
C / 24h
Pứ âm tính Pứ dương tính
www.hsph.edu.vn
Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP)
•
Mục đích
Phát hiện VSV tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong
quá trình lên men glucose
Chủng VSV MT MR-VP
Thuốc thử Barritt
37
o
C / 24h
Pứ âm tính Pứ dương tính