Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn e coli bằng protein dung hợp super folder green fluorescent protein (sfGFP)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


Vũ Thị Hiền

NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN
CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli
BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER
GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP)


LUẬN VĂN THẠC SĨ




Hà Nội – 2013



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


Vũ Thị Hiền

NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN
CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli
BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER
GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP)
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số : 06 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN


Hà Nội – 2013



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN!
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Đồng Văn Quyền, Trưởng
phòng Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa
học công nghệ Việt Namđã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơnPGS.TS. Đinh Duy Khángvà các cán bộ
Phòng Vi sinh vật học phân tử đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và
tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, nơi tôi làm
việc, đã tạo điều kiện tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện
luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Học viên


Vũ Thị Hiền








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT
Stt
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1

Ala
Alanin
2
bp
Base pair
3
APS
Amonium persulfat
4
Arg
Arginin
5
Asn
Asparagin
6
Asp
Aspartic acid
7
bp
Base pair
8
CBB
Coomassie brilliant blue
9
Cys
Cystein
10
Đc
Đƣờng chạy
11

DNA
Deoxyribonucleic Acid
12
DTT
Dithiothreitol
13
E.coli
Escherichia coli
14
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
15
EtBr
Ethidium bromid
16
Gln
Glutamin
17
Glu
Acid glutamic
18
Gly
Glycin
19
GST
Glutathione transferase
20
His
Histidin
21

TEV
Tobacco Etch Virus
22
TEVp
Tobacco Etch Virus protease
23
GFP
Green Fluorecent Protein
24
sfGFP
Super folder Green Fluorecent Protein
25
sfGFP-TEVp
Super folder Green Fluorecent Protein-
Tobacco Etch Virus protease


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

26
IPTG
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
27
kDa
Kilo Dalton
28
LB
Luria Bertani
29
NaOAC

Sodium acetate
30
OD
Optical Density
31
PCR
Polymerase chain reaction
32
PMSF
Phenylmethanesunfonylfluoride
33
SDS
Sodium dodecyl sulfate
34
TAE
Tris- acid acetic – EDTA
35
TEMED
N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine
36
v/ v
Volume/ volume: thể tích/ thể tích
37
X-gal
5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Chức năng dự đoán của các protein trong TEV.

Bảng 2.1
Thành phần phản ứng cắt gen sfGFP-TEVp bằng enzyme
giới hạn.

Bảng 2.2
Thành phần phản ứng cắt vector pET21(a+) bằng enzyme
giới hạn.

Bảng 2.3
Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện.

Bảng 2.4
Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE.

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng cắt GP120 tái tổ hợp bằng sfGFP-
TEVp.




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV

Hình 1.2
Cấu trúc không gian của TEV protease

Hình 1.3
Cấu trúc không gian của GFP

Hình 1.4

Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh
quang phát ra (nét đứt) của GFP tự nhiên từ A. victoria

Hình 2.1
Sơ đồ minh họa các bƣớc trong nghiên cứu biểu hiện và
tinh sạch sfGFP-TEVp.

Hình 2.2
Sơ đồ minh họa quá trình loại bỏ đuôi TRX khỏi protein
dung hợp GP120- TRX nhờ sfGFP-TEV protease.

Hình 2.3
Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa
gene mã hóa sfGFP-TEVp.

Hình 3.1
Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa
gene mã hóa sfGFP-TEVp.

Hình 3.2
Điện di sản phẩm PCR khuếch đại genesfGFP-TEV
protease

Hình 3.3
Điện di plasmid và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bởi
Nde I và Xho I.

Hình 3.4
sfGFP-TEVp

Hình 3.5
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVprotease

Hình 3.6
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEV protease ở các nhiệt độ
khác nhau

Hình 3.7
Kết quả xác định trạng thái tồn tại của protein sfGFP-
TEVp khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau.

Hình 3.8
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các thời gian cảm ứng
khác nhau

Hình 3.9
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các nồng độ IPTG



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 3.10
Kết quả tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp

Hình 3.11
Điện di đồ kết quả kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cƣơng về Protease 3
1.1.1. Khái niệm protease 3
1.1.2. Phân loại protease 3
1.2. TEV protease 6
1.2.1. Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus 6
1.2.2. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của
virus. 7
1.2.4. Cấu trúc của TEV protease 8
1.2.5. Cơ chất đặc hiệu và điều kiện hoạt động 9
1.2.6. Ưu điểm và hạn chế của TEV protease 11
1.2.7. Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước 11
1.3. Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP) 13
1.3.1. Đặc điểm cơ bản của GFP 13
1.3.2. Super folder GFP và các biến thể khác của GFP 15
1.4. ện TEVp 17
1.4.1. Hệ thống biểu hiện E.coli 17
1.4.2. Vector biểu hiện pET 17
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2. Hoá chất và sinh phẩm 19
2.1.3. Trang thiết bị và máy móc 20

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa sfGFP-TEVp 21
2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 21
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 22


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 23
2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli 24
2.2.6. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli 25
2.2.7. Phương pháp xác định trạng thái tồn tại của TEVp 25
2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26
2.2.9. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin 27
2.4.11. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 28
2.2.11. Phương pháp thử hoạt tính của sfGFP-TEV protease 29
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Thiết kế vector biểu hiện psfGFP-TEVp 31
3.2. Kiểm tra khung đọc của gene sfGFP-TEVp trong vector pET21(a+) 34
3.3. Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp trong E. coli BL21 (DE3) Star™ 35
3.4. Tối ƣu hoá các điều kiện biểu hiện 36
3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ nuôi cấy 37
3.3.2. Ảnh hưởng củ 39
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 39
3.5. Kết quả tinh chế sfGFP-TEVp 41
3.6. -TEVp 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU
.
protein không thể biểu hiện hoặc biểu hiện ở dạng không có hoạt
tính/chức năng sinh học mong muốn, thậm chí còn gây độc cho vật chủ biểu hiện. Do
, biểu hiện protein dung hợp hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm
nâng cao hiệu suất biểu hiện, ngăn ngừa sự phân hủy, tăng tính tan và tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình tinh chế . Các thƣờng
đƣợc sử dụng là Glutathione G-trans (GST), Thioredoxin (Trx), NusA, Maltose
binding protein (MBP), Histidin (His) Tuy nhiên, các đuôi dung hợp này có thể
gây trở ngại cho việc nghiên cứu về cấu trúc chức năng của protein đích. Do đó,
trong nhiều trƣờng hợp việc loại bỏ đuôi dung hợp là cần thiết. Các protease nhƣ
enterokinase, thrombin, yếu tố Xa [9] cũng nhƣ rhinovirus 3C của ngƣời và
TEVprotease đƣợc sử dụng để cắt đuôi dung hợp ra khỏi protein đích.Trong số các
protease TEV protease (TEVp) là nổi bật nhất nhờ tính đặc hiệu cao,
hoạt động ở nhiệt độ thấp (dƣới 4
o
C) nên protein đích không bị thuỷ phân. Với
những , TEVp đƣợc sử dụng rộng rãi hơn các protease khác.
Trên thị trƣờng hiện loại TEVp, đƣợc cung cấp bởi rất
nhiều hãng khác nhau nhƣng với giá thành cao và đều phải nhập ng .
Việc chủ động tạo ra nguồn TEVp có hoạt tính cao, giá thành rẻ phục vụ cho các
nghiên cứu là vấn đề rất cần thiết.
E.coli. Tuy nhiên,trở ngại khi
biểu hiện TEVp trong E.colilà hiệu suất biểu hiện và độ tan kém. Vì vậy,để
giải quyết vấn đề nàycác nhà nghiên cứu đã đột biến của TEVp, biểu hiện ở
nhiệt độ thấp hoặc dung hợp với các protein dung hợp khác. Protein huỳnh quang
xanh(Green fluorescent protein, GFP)đang đƣợc ứng dụng rộng rãi bởi một số
nổi bật nhƣ dễ dàng phát hiện khi biểu hiện, tinh sạch và các ứng dụng khác
nhờ sự hiện diện của huỳnh quang.Super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP),

một loại GFP ả ấp cuộn mạnh
tăng độ hòa tan, độ bền vàgấp cuộn của protein .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, “Nâng cao
hiệu suất biểu hiện TEVprotease trong vi khuẩn E.coli bằng protein dung
hợp super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP)” nhằm
TEV protease .
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cƣơng về protease
1.1.1. Khái niệm protease
Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho
phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide. Quá trình
này cần thiết cho sự tổng hợp, kiểm soát kích thƣớc, thành phần, hình dạng của các
phân tử protein và cuối cùng là phân hủy chúng. Protease chiếm khoảng 2% trong
genome của ngƣời và 1-5% trong genome của côn trùng. Protease điều hòa hầu hết
các quá trình sinh lý thông qua việc kích hoạt tổng hợp, luân chuyển của protein,
tham gia vào việc điều hòa trong thụ thai, sinh sản, tiêu hóa, tăng trƣởng, trƣởng
thành, lão hóa, và thậm chí cả cái chết của các sinh vật. Protease cũng thiết yếu
trong virus, vi khuẩn và ký sinh trùng để nhân sao chép và lây lan các bệnh truyền
nhiễm, trong tất cả các côn trùng, sinh vật và động vật để truyền bệnh hiệu quả. Do
vai trò quan trọng quy định trong vòng đời của các sinh vật, protease đã trở thành
mục tiêu quan trọng cho nghiên cứu y tế và phát triển thuốc [18] và có nhiều ứng
dụng trong công nghệ thực phẩm. Do đó, nhu cầu về protease/enzyme ngày càng
tăng do hiệu quả của chúng đem lại. Năm 1995, ƣớc tính ngành công nghiệp
enzyme thế giới thu đƣợc 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 tỷ USD. Châu Âu sản
xuất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất.
1.1.2. Phân loại protease
Protease đƣợc phân chia thành hai loại dựa theo vị trí hoạt động [16, 32]:
Exopeptidase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide từ đầu amino hay
cacboxyl của protein và tiếp tục hoạt động này đến khi phân cắt hết mạch peptide
[14, 16]. Dựa vào vị trí tác động trên mạ
[16]:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một aminoacid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Endopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đặc hiệu nằm giữa 2 amino
acid bên trong của protein hay peptide [14, 16]. Vị trí không gian của các amino
acid tạo thành vị trí xúc tác đƣợc bảo tồn trong tự nhiên của các protease và cung
cấp cách phân loại chúng thành 4 nhóm [16, 34]:
- Serin proteinase hay alkaline protease: là nhữ –OH của
gốc serine đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động. Những enzyme này chứa
bộ ba xúc tác là His, Ser, Asp chịu trách nhiệm phân cắt, bộ ba này cố định chính
xác trong không gian 3 chiều bằng các khung alpha- carbon của protease. Yếu tố
Ser thƣờng không phản ứng và hoạt động nhƣ 1 nucleophile suốt quá trình xúc tác
bằng cách nhƣờng 1 điện tử cho nhóm cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân
hủy. Một acyl Ser đƣợc hình thành và một proton đƣợc nhƣờng để giải phóng một
nhóm amino nhờ yếu tố His ở trung tâm hoạt động. Acyl enzyme sau đó đƣợc phân
giải, sản phẩm acid cacboxylic sau đó đƣợc giải phóng và trung tâm hoạt động sau
đó đƣợc tái tạo [16]. Nhóm này bao gồm hai lớp nhỏ là chymotrypsin và subtilisin.
Trypsin là họ lớn nhất, bao gồm cả enzyme của động vật có vú và vi khuẩn. Một số
ví dụ phổ biến là enzyme tiêu hóa ở tuyến tụy nhƣ trypsin, chymotrypsin, elastase,
cũng nhƣ các enzyme đông máu thrombin, plasmin, và nhiều enzyme bổ sung.
Ngƣợc lại, họ subtilisin chỉ đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN [31]. Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm, tối
ƣu ở pH 7 và 11và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
- Cystein –SH trong trung tâm hoạt động
trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác. Cystein protease có một bộ đôi xúc tác bao
gồm His và Cys tƣơng tác với nhau. Trong suốt quá trình phân giải protein, nhóm
sulhydryt của yếu tố Cys hoạt động nhƣ 1 nucleophile bắt đầu tấn công nhóm
cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân giải. Trong quá trình này, vòng

Imidazole của His ở trung tâm hoạt động rút bớt 1 proton ở nhóm sulfhydryl do đó
làm cho nó càng mang tính nucleophile. Một acyl enzyme đƣợc hình thành nhờ
cacboxyl cacbon của cơ chất và nhóm sulfhydryl của Cys ở trung tâm hoạt động.
Việc giải phóng nhóm amino là nhờ vào His ở trung tâm hoạt động. Nhóm cacboxyl

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

cacbon sau đó đƣợc phân giải từ nhóm thiol của protease và các yếu tố, trung tâm
hoạt động đƣợc phục hồi [16].
Cystein proteasebao gồm các protease thực vật nhƣ papain, bromelin, ficin,
enzyme của một số động vật có vú nhƣ lysosomal cathepsins, calpains cytosolic
(kích hoạt canxi) cũng nhƣ các protease một số ký sinh. Các cystein proteinase
thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng [34].
- Aspartic proteinase: cũng đƣợc gọi là protease - axit, có 2 Asp ở trung tâm hoạt
động. Nhóm ᵞ-cacboxyl của Aspactat trong trung tâm hoạt động tham gia vào phản
ứng xúc tác. Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao
gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các enzyme này
hoạt động chủ yếu trong phạm vi pH acid 2-4. Rennin là một ngoại lệ hoạt động
trong phạm vi pH từ 5,5 đến 7,5.
- Metallo protease: trong trung tâm hoạt động thƣờng có các cation hóa trị 2 trực
tiếp tham gia phản ứng xúc tác. Yếu tố His và Glu đƣợc cho là những amino acid
cần thiết. Trình tự nhận biết của protease này là -His-X-X-Glu-His- (X là amino
acid bất kỳ) hoặc His-Glu-X-X-His. Glu có thể nhƣờng 1 điện tử cho nhóm
cacbonyl cacbon của liên kết peptide trong suố
ợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi
sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính
và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA [16].
Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi
khuẩn.

Protease trung tính có pH 7-8 nhƣ papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,
ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật. Những protease này
là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất. Vi khuẩn
Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp sản
xuất ra enzyme streptopain, đều là cystein protease.
Protease kiềm có pH 9-11.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.2. TEV protease
1.2.1. Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus
Tobacco Etch Virus (TEV) là virus gây bệnh ở thực vật thuộc chi Potyvirus,
họ Potyviridae, phân nhóm IV picornavirus [21, 35]. TEV là virus RNA sợi đơn
dƣơng, không có vỏ bao bọc [5], hình dạng khúc khuỷu với chiều dài 730 nm, đƣờng
kính 12- 13 nm [39]. Virus trƣởng thành bao gồm xấp xỉ 2000 bản sao của protein
capsid (CP) trong có chứa sợi RNA đơn dƣơng không phân đoạn [5, 34]. Hệ gene của
TEV là phân tử RNA chứa 9596 nucleotide [15] liên kết cộng hóa trị với protein
đƣợc mã hóa trong virus (VPg) ở đầu 5’ và 1 đuôi poly A ở đầu 3’[13], tỷ lệ phần
trăm nucleotide là (20,1% C; 30,075% A; 22,8% G, và 27,1% U, hàm lƣợng phospho
(0,46% ± 0,02 %) [11, 22]. Tƣơng tự nhƣ các virus sợi RNA đơn dƣơng khác, hệ
gene virus chứa 1 khung đọc mở mã hóa cho 1 polyprotein với trọng lƣợng phân tử
346 kDa [10, 22], polyprotein này đƣợc phân cắt bởi 3 protease của chính nó và
protease của tế bào chủ [5, 20, 37] tạo ra các protein khác của virus. Ba protease của
virus xúc tác cho quá trình biến đổi sau dịch mã là P1, HC-Pro và NIa [21, 22].
Protein chiếm 95% trọng lƣợng hạt virus TEV [11]. Các phân tích đột biến và hóa
sinh cho thấy hầu hết các protein đều có chức năng trực tiếp hoặc gián tiếp trong quá
trình sao chép hệ gene của virus [22, 39].
Bảng 1.1: Chức năng dự đoán của các protein trong TEV
PROTEIN
CHỨC NĂNG

P1
- Protease
- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)
HC-Pro
- Protease
- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)
- Lây nhiễm vào rệp trung gian truyền dẫn
M Protein
Không rõ, có thể vai trò trong việc nhân lên của virus
Helicase/NTP
ase
- Sao chép hệ gene (RNA helicase)
- Kích thích hoạt động của ATPase
- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)
CP
- RNA encapsidation

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

- Tham gia vào truyền vector
- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)
NIa-VPg
Nhân bản hệ gene (Primer khởi tổng hợp RNA)
NIa-Pro
Protease chính
NIB
Sao chép bộ gene (RNA phụ thuộc RNA polymerase [RdRp])
6K
Chƣa rõ, nhƣng có thể vai trò sao chép RNA
Chữ viết tắt: P1: protein 1; HC-Pro:helper component-proteinase; CP: capsid

protein; NIa-VPg: Nucleotide inclusion a- viral protein virus genome.
1.2.2. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus.
Hệ gene của TEV chứa một khung đọc mở (ORF), đƣợc dịch mã thành 1
polyprotein, sau đó trải qua quá trình sửa chữa sau dịch mã và phân cắt bởi 3
protease của virus là P1, HC- pro và NIa để tạo ra các protein khác nhau của virus
(hình 1.1). P1 và HC- pro chỉ xúc tác cho 1 phản ứng tự phân giải protein ở đầu
cacboxyl tƣơng ứng của nó trong khi NIa xúc tác cho 7 hoặc 8 sự phân cắt còn lại
trong suốt quá trình tự phân giải [21], TEV NIa protease (hoặc còn gọi là TEV
protease) là vùng xúc tác 27kDa của NIa protease [37].
TEV protease đƣợc phân loại theo EC (Enzyme Commission) số: 3.4.22.44.
Phân tích phân loại này nhƣ sau:
Enzymes.
3. Hydrolases.
3.4 Hoạt động ở liên kết peptide (peptidases).
3.4.22 Cysteine endopeptidases.
3.4.22.44 Endopeptidase thể vùi trong nhân (NIa) TEV protease.
TEV protease đóng vai trò chính trong việc phân giải protein trong quá trình
xử lý protein sau dịch mã, xử lý polyprotein gốc thành các protein chức năng, đồng
thời cũng đóng vai trò trong việc nhân bản hệ gene của virus [16, 19].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hình 1.1: Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV
1.2.4. Cấu trúc của TEV protease
TEV NIa protease (TEV protease) là vùng xúc tác 27kDa 1.2) của NIa
protease trƣởng thành [39]. NIa protease trƣởng thành có khối lƣợng 49 kDa và xảy
ra quá trình tự phân cắt để tạo ra một protein liên kết với RNA của virus (VPg 21
kDa) và TEV NIa protease. TEV protease gồm 234 amino acid ứng với amino acid

189 - 424 của protease trƣởng thành [19].

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của TEV protease
TEV protease là protease cystein có cấu trúc tƣơng tự nhƣ các serin protease
nhƣ trypsin hay chymotrypsin nhƣng có chứa 1 cystein thiol thay vì serin hydroxyl

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trong trung tâm hoạt động [13, 19]. Enzyme này thuộc họ peptidase C4, có khối
lƣợng phân tử khoảng 25-27 kDa [6, 39], có chức năng và cấu trúc tƣơng đồng với
proteases 3C picornavirus.
Cấu trúc tinh thể của TEV protease cho thấy enzyme này chỉ gồm các tấm β,
chứa 2 vùng song song nhƣng đối nhau gấp khúc β, tiêu biểu cho các serine
protease nhƣ trypsin với bộ ba xúc tác His46, Asp81 và Cys151 nằm ở giao điểm
giữa 2 vùng [10, 12, 16, 19], bộ ba xúc tác này ứng với vị tríacid amin thứ 234, 269
và 339 trong protease trƣởng thành [19]. Các thí nghiệm cho thấy, nếu đột biến ở
His46 và Cys151 thì TEV protease sẽ không còn hoạt tính, trong khi Asp81 có thể
đƣợc thay thế bằng Glu nhƣng không phải bằng Val, nhƣng có 1 ngoại lệ: nếu thay
Cys151 bằng Ser TEV protease sẽ giữ lại 1- 2 % hoạt tính của NIa kiểu dại [16].
Hình dạng khung cacbon của 2 vùng cấu tạo TEV protease là tƣơng tự nhau với độ
lệch góc trung bình là 0,24 Å [19]. TEV protease thƣờng có xu hƣớng tự phân cắt
in vitro, tạo ra một protein có kích thƣớc nhỏ hơn với hoạt tính giảm so với kiểu dại.
Sự phân cắt xảy ra ở gần đầu C của TEV sau trình tự 218 tại 1 vị trí nhận biết không
đặc trƣng [10].
1.2.5. Cơ chất đặc hiệu và điều kiện hoạt động
TEV NIa protease nhận biết và cắt trình tự liên kết gồm 7 amino acid là E-
X-X-Y-X-Q G/ S (trong đó X là amino acid bất kỳ), trình tự đƣợc tìm thấy phổ
biến nhất là ENLYFQ G/S (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln Gly/Ser) [10, 13, 24, 30].
Trình tự này đƣợc đánh số từ P6- P1 P’1; các amino acid ở P6, P3, Pl, và P’l là
trình tự bảo thủ và quan trọng quyết định tính đặc hiệu, amino acid ở các vị trí khác

có vai trò điều khiển sự phân cắt [13, 30]. Kapust và các cộng sự [24] cho thấy, ở vị
trí P’l của cơ chất có thể là Gly hoặc Ser và đây cũng là điểm cắt của TEV protease.
Ông và các cộng sự đã thiết kế 20 loại protein dung hợp khác nhau chứa các trình tự
nhận biết của TEV protease chỉ khác nhau ở vị trí P’1, sau đó thực hiện phản ứng
cắt với TEV protease từ đó đánh giá tác động của vị trí P’1 đến hiệu quả xúc tác của
protease TEV và nhận thấy ảnh hƣởng của các amino acid tại vị trí P’1 đến khả
năng cắt của TEV protease nhƣ sau: \G> S> A> M> C> N> H> Y> K> D> Q> F>
T> W> R> L> E> I> V> P. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, việc thay thế các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

amino acid làm giảm đáng kể hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của TEV protease, khi
thay đổi amino acid vị trí P5 và P2 có thể tăng hoặc giảm tỷ lệ phân cắt [16].Vai trò
và sự ảnh hƣởng của từng amino acid trong trình tự nhận biết trên đến tốc độ
(Vmax) và hiệu suất phản ứng của TEVp đã đƣợc Tsuchida và cộng sự khảo sát
trong một nghiên cứu gần đây. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu thay thế
các vị trí amino acid trong trình tự nhận biết kinh điển của TEVp là Glu – Asn –
Leu – Tyr – Phe – Gln – Gly/Ser và nhận thấy: khi thay Phe bằng Leu, Val, Ser và
Cys giá trị Vmax của enzyme lần lƣợt là 73%, 43%, 42%, 25% [37]. Trong một
nghiên cứu trƣớc đó, Dougherty và cộng sự chỉ ra rằng khi thay Phe bằng Leu, Val,
Ser thì tỷ lệ phân cắt cơ chất của TEV protease là 20%, còn khi thay bằng Cys thì tỷ
lệ phân cắt cơ chất không thay đổi. Kapust và cộng sự quan sát thấy khi thay Gly
bằng Ala, Ser, Ile, Arg thì giá trị Vmax của TEV lần lƣợt là 96%, 92%, 17%, 11%,
còn tỷ lệ phân cắt cơ chất khi thay Gly bằng Ser và Ala là nhƣ nhau. Trong khi đó
khi thay thế Gly bằng Ile và Arg thì tỷ lệ phân cắt cơ chất tƣơng ứng là 60%, 70%
[24]. Kết quả nghiên cứu của các nhóm trên có sự sai khác nhất định, điều này có
thể là do họ sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu khác nhau. Các tác giả đứng đầu là
Suchudia dùng phƣơng pháp huỳnh quang HAFCOM (Homogeneous Assay for
Fluorescence Concentrated On Membrane) [31], trong khi đó nhóm của Dougherty
và cộng sự sử dụng phƣơng pháp quét hình ảnh (Scanning of the band in dried

polyacrylamid gel), còn Kapust và cộng sự sử dụng phƣơng pháp đánh giá ngay
trong hệ thống nội bào (intracellular processing system) để phân tích khả năng phân
cắt cơ chất của TEV protease [25].
TEV protease đƣợc cho là hoạt động tối ƣu ở dung dịch có thành phần: 50
mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA và 1mm DTT.Tuy nhiên, enzyme này có thể
hoạt động ở dải pH khá rộng từ 4- 9 trong nhiều loại đệm khác nhau (phosphat,
MES và acetate) và hoạt động không hiệu quả nếu thêm glycerol hoặc sorbitol với
tỷ lệ dƣới 40% (v/v). TEV proteinase thể hiện nhiều đặc tính của picornaviral và
comoviral proteinases nhƣ bị ức chế hoạt động bởi Zn
2+
, iodoacetamide, và N-
ethylmaleimide, trong khi hầu hết các chất ức chế protease khác không có hiệu lực
ở nồng độ tác dụng thông thƣờng [15], ví dụ nhƣ PMSF và AEBSF (1mM), TLCK
(1mM), Bestatin (1mg/ml), pepstatin A (1mM), EDTA (1mM), và E-64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

(3mg/ml). Kẽm ức chế hoạt động của enzyme ở nồng độ 5mM hoặc cao hơn [18,
23, 29].
1.2.6. Ưu điểm và hạn chế của TEV protease
TEV protease có tính đặc hiệu cơ chất cao và hoạt động đƣợc trong môi
trƣờng pH rộng (4-9) và lực liên kết ion mạnh nên có tính linh hoạt cao hơn các
protease khác. Enzyme này hoạt động trên một phạm vi nhiệt độ rộng từ 4
0
C- 37
0
C
[14, 27]. Nhiệt độ hoạt động tối thích là 34
0
C [27], tuy nhiên ở 4

0
C TEV protease
vẫn hoạt động tốt với đầy đủ hoạt tính. Điều này làm giảm sự phân giải protein của
protein đích [39], đặc biệt với các protein phụ thuộc nghiêm ngặt vào nhiệt độ, dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao [9]. Các TEV protease tái tổ hợp duy trì hoạt động cao
trong nhiều hệ dung dịch đệm trong sắc ký và chịu đƣợc nồng độ cao của chất bổ
sung thƣờng đƣợc sử dụng trong tinh chế protein, chẳng hạn nhƣ ethylene glycol,
EGTA, Triton X-100, Tween-20, NP-40, chaps, urê, SDS, guanidine hydrochloride
và β-mercaptoethanol [24, 29].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, TEV protease nhận biết và cắt chính bản thân
nó, hay nói cách khác là tự phân cắt để tạo thành một protease ngắn hơn với hoạt
tính giảm đi rất nhiều [24, 30]. Đặc tính này gây khó khăn cho quá trình tinh sạch
để tách các sản phẩm bị cắt ngắn ra khỏi các protease hoàn chỉnh cũng nhƣ ra khỏi
sản phẩm phân cắt của protein đích. Hơn nữa, sự mất hoặc giảm hoạt tính trong việc
bảo quản các enzyme là một lo ngại đáng kể. Việc biểu hiện TEV protease trong
E.coli gặp phải trở ngại nhƣ năng suất thấp và dạng hòa tan ít [9, 26]. Trong thực tế,
TEV protease tái tổ hợp thƣờng hòa tan ở nồng độ dƣới 1mg/ml và duy trì đặc tính
ở 50% (v/v) glycerol [9]. Để cắt cơ chất hiệu quả, vị trí nhận biết của TEV protease
trên phân tử protein đích cần Gly hoặc Ser ở vị trí P’1. Do đó, nếu protein dung hợp
hay đuôi ái lực gắn với protein đích ở đầu N thì sau khi bị loại bỏ bởi TEV protease,
các protein đích thƣờng sẽ giữ lại Ser hoặc Gly ngoại lai (ở vị trí P’1) tại đầu N của
nó, và trong một số trƣờng hợp điều này có thể ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học
của protein đích [25].
1.2.7. Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước
Do tính đặc hiệu cơ chất cao và tầm quan trọng của enzyme này trong nghiên
cứu y học, sinh học nên TEV protease đƣợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

quan tâm nghiên cứu. Một trong các hƣớng tiếp cận chủ yếu là sử dụng công nghệ

DNA tái tổ hợp cho phép tạo TEVp tái tổ hợp (rTEVp) để có thể sản xuất lƣợng
lớn.
- Năm 1995, Parks và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện toàn bộ gene mã hóa
TEVp với kích thƣớc 27 kDa trong E.coli chủng (BL21) sử dụng vector biểu hiện
pLysS. Tuy nhiên, rTEVp sau khi tinh sạch bị cắt mất 24 amino acid đầu C và có
hoạt tính thấp [30].
- Năm 2002, nhóm nghiên cứu đứng đầu là Kapustđã thay thế amino acid Ser ở vị
trí 219 thành Val trong phân tử TEVp và nhận thấy dạng đột biến có cấu trúc bền
vững hơn và hoạt tính cao hơn so với enzyme dạng dại [25].
- Năm 2002, Stols và cộng sự sử dụng vector biểu hiện pMCSG7 để biểu hiện
TEVp.Trong hệ thống này, TEVp đƣợc chèn vào sau trình tự dẫn đƣờng và một
đoạn gene mã hóa cho 6 Histidin tại đầu N. Kết quả là rTEVp đƣợc biểu hiện mạnh,
vẫn có hoạt tính sinh học và bƣớc đầu nhóm nghiên cứu đã tinh chế đƣợc rTEVp
bằng cột sắc ký ái lực Ni – Resin [36].
- Năm 2007, Fang và cộng sự sử dụng phƣơng pháp đồng biểu hiện(co-expression)
TEVp và chaperon trong E.coli và biểu hiện ở nhiệt độ thấp. Kết quả thu đƣợc rất
khả quan, rTEVp đƣợc biểu hiện nhiều ở dạng hòa tan và có hoạt tính sinh học cao
[27].
- Năm 2007, các tác giả khác đã nghiên cứu kết hợp nhiều phƣơng pháp nhƣ cắt bỏ
amino acid từ vị trí 238-242 tại đầu C, dung hợp TEVp với MBP (Maltose binding
protein), GST (Gluthadione S Transferase), thay đổi vector biểu hiện, thay đổi vật
chủ biểu hiện nhằm cải thiện khả năng biểu hiện và độ hòa tan của rTEVp.Nghiên
cứu này cho thấy, việc loại bỏ 4 amino acid đầu C kết hợp với môi trƣờng tự cảm
ứng biểu hiện (auto-induction medium), không bổ sung chất cảm ứng IPTG, làm
tăng tính hòa tan và hoạt tính của rTEVp. Việc dung hợp với GST cũng làm tăng
đáng kể mức độ biểu hiện của rTEVp [32].
- Cũng vào năm 2007, một nhóm nghiên cứu khác đứng đầu là Cabrita đã sử dụng
phần mềm PoPMuSiC để phân tích trình tự và cấu trúc của TEVp và tìm ra một số
amino acid đóng vai trò quan trọng quyết định mức độ biểu hiện, độ hòa tan và hoạt
tính của rTEVp khi biểu hiện ở E.coli. Chứng minh bằng thực nghiệm, nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nghiên cứu cho thấy, khi thay thế một số amino acid nhƣ Lys ở vị trí 45 thành Phe
(Lys45Phe), và Ser ở vị trí 135 thành Gly (Ser135Gly) làm tăng độ hòa tan của
rTEVp lên 6 lần, đặc biệt khi thay thế cùng lúc 2 amino acid là
Lys56Val/Ser135Gly độ hòa tan của rTEVp tăng lên trên 40 lần so với dạng dại [7,
9].
- Năm 2009, ba nhà nhà khoa học gồm Tropea, Cherry và Waugh đã làm tăng khả
năng hòa tan của rTEVp biểu hiện ở E.coli bằng cách dung hợp với MBP và thay
thế Ser ở vị trí 219 thành Val [23].
- Năm 2011, Miladi và cộng sự đã nghiên cứu dung hợp TEVp với Streptag II
(Streptag II-TEVp) và biểu hiện protein dung hợp trong E.coli ở điều kiện nhiệt độ
thấp [6]. Hệ thống Streptag đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất, tinh sạch
các protein tái tổ hợp. Kết quả cho thấy việc dung hợp với Streptag II làm tăng đáng
kể về độ hòa tan của TEVp, protein tái tổ đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực Strep-
tactin với hiệu quả lên đến 99%. Hiệu quả của việc tinh sạch bằng phƣơng pháp
Streptag đã đƣợc Lichty và cộng sự khẳng định vào năm 2005.Nghiên cứu của
Miladi và cộng sự cũng cho thấy Streptag II-TEVp vẫn giữ đƣợc hoạt tính enyme
tƣơng tự 6xHis-TEVp [6].
Cho đến nay chúng tôi chƣa tìm thấy công bố nào về nghiên cứu biểu hiện và
tinh sạch TEVp tái tổ hợp tại Việt Nam.
1.3. Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP)
1.3.1. Đặc điểm cơ bản của GFP
GFPlà một protein, đƣợc đặt tên bởi MorinvàHastings[40], chứa 238 amino
acid có khối lƣợng phân tử 26,9 kDa và có khả năng phát ra huỳnh quang màu xanh
lá khi đƣợc chiếu tia sáng màu xanh da trời[40]. GFP đƣợc phân lập chủ yếu từ sứa
Aequorea Victoria hoặc Renilla reniformis.Trong A. victoria có hai loại protein
phát quang là Aequorin và GFP. Aequorin khi tƣơng tác với ion Ca
2+

sẽ phát ra ánh
sáng xanh da trời, còn GFP đƣợc kích thích bởi ánh sáng da trời sẽ phát ra huỳnh
quang màu xanh lá.
GFP có cấu trúc dạng ống beta điển hình, bao gồm 11 mạch β đƣợc liên kết
với nhau bởi xoắn α và chứa nhóm mang màu (fluorofore) ở trung tâm của ống[38,
40, 41].Ống trụ có đƣờng kính khoảng 30 A
0
và chiều dài 40 A
0
. Khi phân cắt GFP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

thành những đoạn hexapeptide (đoạn có 6 gốc amino acid), bộ ba amino acid65-
67(Ser-Tyr-Gly) trongtrình tựGFP tự nhiêntạo thànhnhóm mang màuhuỳnh quangp-
hydroxybenzylideneimidazolinone. Đây là cấu trúc thƣờng gặp trong tự nhiên, tuy
nhiên chỉ khi bộ ba amino acid nằm ở trung tâm của cấu trúc ống beta (nhƣ trong
cấu trúc của GFP), bộ ba này mới dẫn đến khả năng phát huỳnh quang.Cấu trúc
dạng ống beta này khó bị biến tính bởi nhiệt độ, pH hay các chất gây biến tính.GFP
bền ở nhiệt độ 78
0
C, pH 5- 12 hay trong đệm có nồng độ ure đậm đặc 6M[27].







Hình 1.3 :Cấu trúc không gian của GFP

Quá trình thành thục của GFP diễn ra nhƣ sau: trong môi trƣờng thuỷ phân,
xảy ra phản ứng giữa gốc carboxyl của Ser65 và gốc amino của Gly67, dẫn đến sự
hình thành hệ thống vòng imidazol-5-one heterocyclic nitrogen. Quá trình oxi hoá
tiếp sau đó tạo liên kết giữa vòng Imidazol với Tyr66 và do đó tạo thành protein có
hoạt tính.
GFP t nhiên từ A. victoria tồn tại ở hai trạng thái : dạng proton hoá (dạng
trội) và dạng không proton hoá (hiếm gặp hơn), tƣơng ứng có hai đỉnh kích
thích:đỉnh chính ở bƣớc sóng 395nm và đỉnh phụ có bƣớc sóng 475nm. Dƣới ánh
sáng kích thích, GFP phát ra ánh sáng có bƣớc sóng 509nm, tƣơng ứng với ánh sáng
màu xanh lá trong phổ ánh sáng nhìn thấy, ngay cả khi kích thích dƣới ánh sáng
UV, GFP vẫn có khả năng phát huỳnh quang.






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




Hình 1.4.Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh quang phát ra
(nét đứt) của GFP tự nhiên từ A. victoria.
1.3.2. Super folder GFP và các biến thể khác của GFP
GFP tự nhiên có một vài nhƣợc điểm nhƣ phổ kích thích lƣỡng cực, kém bền
với ánh sáng và cuộn gấp kém ở 37
0
C. Tuy nhiên, với tiềm năng ứng dụng to lớn,
nhiều biến GFP đã đƣợc tạo ra nhằm mục đích cải thiện tính hòa tan, độ bền

và gấp cuộn của protein bằng cách dung hợp với các protein khác.
Biến thể của GFP đƣợc nghiên cứu đầu tiên vào năm 1996 bởi Willem
Stemmer bằng kỹ thuật DNA shuffting [42] với mục tiêu cải thiện toàn bộ tế bào
huỳnh quang trong E.colikhi biểu hiện GFP. Sau 3 chu kỳ DNA shuffting và lựa
chọn dựa trên cƣờng độ huỳnh quang với sự kích thích của tia cực tímcho thấy
huỳnh quang tăng gấp 45 lần so với clontech pGFP thƣơng mại. Tuy nhiên, đặc tính
quang phổ cũng nhƣ tỷ lệ thành thục không thay đổi(T1/2 = 95 phút ở 37
o
C trong
toàn bộ tế bào). Đột biến GFP cycle 3 so với GFP ban đầu là 3 amino acid kỵ nƣớc
đƣợc thay thế bằng3 amino acid ƣa nƣớc. Vì vậy, cƣờng độ huỳnh quang đƣợc cải
thiện có thể do giảm tập hợp protein có bề mặt kỵ nƣớc và làm tăng độ hòa tan của
GFP.
Mƣời năm sau đó (2006), các superfolder GFP(sfGFP) đƣợc thiết kế bởi
phòng thí nghiệm của Geoffrey Waldo với mục đích tạo ra một protein có ít xu
hƣớng gấp cuộn sai khi dung hợp với một protein gấp cuộn kém trong E.coli. Sử
dụng một GFP folding reporter (frGFP) chứa đột biến cycle 3 và EGFP dung hợp
với một protein gấp cuộn kém-H subunit ferritin, protein này không hòa tan khi biểu
hiện trong E.coli. Sau nhiều lần đột biến và sàng lọc huỳnh quang thu đƣợc sfGFP
với cƣờng độ huỳnh quang mạnh chứa 6 đột biến mới. Ferritin-sfGFP đƣợc tìm thấy
có cƣờng độ huỳnh quang gấp 50 lần so với protein dung hợp ban đầu. Khi biểu
hiện riêng rẽ, tế bào biểu hiện sfGFP có cƣờng độ sáng gấp hai lần so với frGFP,
đặc biệt là phổ kích thích và phát xạ, QY và EC tƣơng tự nhau ở cả hai protein.