Nghiên cứu tác dụng chống viêm saponin cây kim ngân (lonicera japonica thunb caprifoliaceae) đối với anpha amylase

B ộ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ DUNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CHỐNG VIÊM SAPONIN KIM NGÂN
{LONICERA JAPONICA THUNB. CAPRIFOLIACEAE)
ĐỐI VỚI a - AMYLASE
(Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học khoá 2001 - 2006)
Người hướng dẫn : Th.s Lê Thị Diễm Hồng
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh
• • •
Thời gian thực hiện ; 3/2006 - 5/2006
' ' 'x.
\
HÀ NỘI, 5/2006
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng, chủ
nhiệm bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội. Người thầy đã giúp đỡ
và động viên tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Th.s, Lê Thị Diễm Hồng,
giảng viên bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng
dẫn tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo đã trực tiếp truyền đạt cho
tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường, các thầy cô giáo
và các cô kỹ thuật viên bộ môn Hoá sinh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
Tôi xin cảm ơn cha mẹ, những người thân và bạn bè đã luôn động viên,
cổ vũ, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và trong học tập.
Hà Nội tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Trần Thị Dung
MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN Đ È 1
Chương I : TỔNG QUAN 3
1.1. Cơ SỞ LÝ THUYÉT VÈ VIÊM
3
1.1.1. Nguyên nhân gây viêm 3
1.1.2. Phân loại viêm 5
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm 5
1.1.4. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm

6
1.2. CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM
8
1.2.1. Thuốc chống viêm steroid 8
1.2.2. Thuốc chống viêm phi steroid 8
1.2.3. a-Am ylase 8
1.3. CÂY KIM NGÂN 11
Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

14
2.1. NGUYÊN LIỆU
14
2.1.1. Kim ngân cuộng 14
2.1.2. Saponin kim ngân cuộng toàn phần 14
2.1.3. a- Amylase 16
2.1.4. Dung dịch cơ chất tinh bột 1%, pH = 6,8 16
2.1.5. Dung dịch albumin 5 mg/ml 16
2.1.6. Súc vật thí nghiệm 16
2.1.7. Thiết bị, dụng cụ 16
2.1.8. Hoá chất thí nghiệm 17

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17
2.2.1. Phương pháp định lượng protein nước bọt bằng phản ứng biure

17
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym

18
2.2.3. Phương pháp gây viêm
19
2.2.4. Phương pháp thử tác dụng chổng viêm 20
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 21
Chưong III: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 22
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIÉT SAPONIN KIM NGÂN CUỘNG TOÀN
PHẦN ĐÓI VỚI HOẠT TÍNH CỦA a- AMYLASE
22
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần
đối với hoạt tính của a- amylase 23
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp
với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 24
3.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp với
dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 26
3.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp các nồng độ a- amylase nước bọt với dịch
chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần đến hoạt tính của a- amylase

27
3.2. KÉT QUẢ THỬ TÁC DỤNG TRÊN IN VIVO

28
3.2.1. Theo dõi sụ thay đổi thể tích chân chuột 28
3.2.2. Tác dụng ức chế phù của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần

theo thời gian uống thuốc 30
3.2.3. Tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn
phần, a-amylase và dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần kết hợp với
a-amylase 31
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA lON CI ĐỔI VỚI HOẠT TÍNH CỦA a-AMYLASE 33
3.4. MỘT SÓ PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH SAPONIN KIM NGÂN CUỘNGTOÀN
PHẦN 34
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
36
KÉT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIÉT TẮT
BC; Bạch cầu
ESR Erythrocyte sedimentation (Tốc độ lắng hồng cầu)
SKN Saponin kim ngân
ư Đơn vị hoạt độ enzym
ĐẬT VẤN ĐÈ
Viêm là một bệnh lý rất phổ biến, gặp ở nhiều bệnh, do nhiều nguyên
nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ
thể chống lại các tác nhân gây viêm.Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ
dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận cơ thể, gây ra
nhiều ảnh hưởng xấu có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh. Vì
vậy, việc ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng.
Từ nhiều năm nay, các loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược
đã ra đời và được ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid và phi
steroid. Các thuốc này có ưu điểm là tác dụng tốt và đạt hiệu quả cao trong
việc hạn chế và ngăn chặn quá trình viêm. Tuy nhiên, chúng có nhiều yếu tố
bất lợi đối với cơ thể như; suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo cơ, loét dạ
dày tá tràng, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu
Vì vậy, việc sử dụmg các enzym nội sinh có tác dụng chống viêm cũng

được coi trọng như a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a-
amylase .Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng
xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống
viêm trên, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân không sử dụng được
thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược.
Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chổng viêm thì các
nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý. ở nước
ta, nhiều dược liệu có tác diing chống viêm tốt. Cây kim ngân là một trong
những cây thuốc phổ biến ở Việt Nam có tác dụng chống viêm được sử dụng
để điều trị viêm đã được ghi nhận trong nhiều tài liệu.
Nhược điếm của dược liệu chống viêm thường chậm và yếu hơn hoá
dược chống viêm do vậy để tăng cường khá năng chống viêm chúng tôi đã
kết hợp enzym chống viêm với dược liệu, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác
dụng chống viêm saponin kim ngân {Lonicera japónica Thunb.
Caprifoliaceae) đối với a- amyiase trong quá trình viêm”.
Đe tài được thực hiện nhằm một số mục tiêu:
• • • • •
1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng dịch chiết saponin toàn phần của
cây kim ngân đối với hoạt động của a-amylase trên in vitro.
2. Nghiên cứu tác dụng chổng viêm cấp của dịch chiết saponỉn
toàn phần của cây kim ngân khi kết hợp vói a-amylase trên
in vivo.
Chuong I
TỎNG QUAN
1.1 CO SỞ LÝ THUYÉT VÈ VIÊM.
Cách đây hơn 2000 năm Celcius đã đặt nền móng quan trọng khi ông
đưa ra một khái niệm tổng kết về viêm, với 4 tính chất: sưng, nóng, đỏ, đau.
Từ đó, ta thấy viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một biểu hiện bệnh
lý nói chung, gặp ở nhiều bệnh khác nhau. Tuy nhiên, Celcius mới nêu các
biểu hiện bên ngoài, mang tính chất hình thái của viêm. Galen bổ sung thêm

một tính chất mới là viêm gây rối loạn chức năng.
Có thể nói viêm là phản ứng của cơ thể tại mô liên kết biểu hiện bằng
sự thực bào tại chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn
thương; đồng thời kèm theo các biểu hiện bệnh lý.
Như vậy, viêm vừa là phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh,
vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối
loạn chức năng cơ quan .có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [2, 202].
1.1.1 Nguyên nhân gây viêm
♦t* Nguyên nhân bên ngoài.
- Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, vims, ký sinh trùng.
-Tác nhân lý hoá học: Chấn thương, nhiệt ( bỏng nóng hoặc bỏng lạnh), bức
xạ ion, tác dimg của các hoá chất.
Nguyên nhân bên trong.
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng.
- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất gian bào [2, 203’.
QUÁ TRÌNH VIÊM
(Xâm nhập các tác nhân gây viêm)
PHẢN ỨNG TẠI CHỎ
Giãn , chậm tuần hoàn mao mạch
Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô
Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu
Giải phóng các chất trung gian hoá học
Hình thành cục máu đông
Tích tụ fibrin và lắng cặn
Tích tụ BC trung tính, lympho
Tăng thực bào, phá huỷ mô
Tăng enzym huyết thanh
Giải phóng enzym lysosom bào tương
Tăng sinh và phì đại nội mô
PHẢN ỨNG HỆ THỐNG

Tăng thân nhiệt
Đau
Tăng BC hạt, lympho bào
Tăng ESR, fibrinogen
Tăng protein c hoạt hoá
Giảm albumin
Tăng a, Ị3, Y globulin
Giảm sắt, tăng đồng
Tăng glycoprotein
Tăng mucoprotein
GIAI ĐOẠN TOÀN THẺ
THOÁT DỊCH MÀNG TÉ BÀO
(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương)
Hình 1.1. Các phản ứng tại chỗ và hệ thống của quá trình viêm [15, 28]
1.1.2. Phân loai viêm.
■ Theo nguyên nhâii: V lêm nhiễm trùng và viêm vô trùng.
■ Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong.
■ Theo thành phần dịch ri viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm
mủ.
■ Theo tính chất:
- Viêm đặc hiệu: thường là viêm mạn tính do phản ứng kháng nguyên
kháng thể.
- Viêm không đặc hiệu: thường là viêm cấp [2, 203-204].
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.
Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt
các phản ứng theo nhiều giai đoạn khác nhau. Các phản ứng này được tóm
tắt như ở hình 1.1.
Phản ứng tuần hoàn.
Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ
khác nhau phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo trình tự

sau: Co mạch chófp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay khi có tác nhân
kích thích. Sau đó là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh
mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chồ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt
động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu đến ổ viêm làm
nhiệm VỊI bảo vệ. Phản ứng tuần hoàn quá mạnh dẫn tới các rối loạn nghiêm
trọng như giãn mạch cục bộ, tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ
viêm, ứ máu, ứ trệ tuần hoàn, thiếu oxy, rối loạn chuyển hoá, tổn thương tổ
chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm sàng là phù và đau) [2, 204-
206].
Phản ứng tế bào.
Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể
chống viêm và bạcii cầu đóng một vai trò quan trọng. Hoạt động của bạch
cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xảy ra kế tiếp nhau;
+ Bạch cầu thoát mạch: Khi dòng máu chảy chậm, bạch cầu tách ra khỏi
dòng trục lăn chậm theo vách mao mạch và tiểu tĩnh mạch rồi dừng lại ở một
điểm gọi là vách tụ bạch cầu. Dưới tác dụing của các chất trung gian hoá học,
bạch cầu tăng khả năng bám dính vào các tế bào nội mô. Sau khi dính vào tế
bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn những
chân giả vào các kẽ hở các tế bào nội mô. Chúng xen vào giữa tế bào nội mô
và màng đáy, từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch. Hiện tưọng
bạch cầu di chuyển tới ổ viêm gọi là hiện tượng hoá ứng động [2, 209-210],
+ Thirc bào và mất hạt: Thực bào là hiện tưọng bạch cầu nuốt và tiêu
huỷ đối tượng thực bào. Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá làm tăng
khả năng thực bào của chúng. Trước tiên, các tiểu phân bị thụrc bào dính vào
bề mặt bạch cầu. Sau khi dính với đối tượng thực bào, bào tương của đại
thvrc bào tạo thành một màn bao vây đối tượng, giới hạn hố thực bào với
màng các hạt lysosom. Các thành phần của hạt đổ vào hố thụrc bào, đại thực
bào mất hạt dần. Có các khả năng sau xảy ra: Đối tượng thực bào bị tiêu hiiỷ;
đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ mà tồn tại trong tế bào hoặc theo đại
thực bào đi đến nơi khác gây ra những ổ viêm mới; đối tượng thực bào bị

nhả ra; đối tượng thực bào đủ độc để làm chết thực bào [2, 211-212].
1.1.4. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm.
Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hoá học được giải
phóng ra, duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm. Những chất này có nguồn
gốc huyết tương, tế bào và tổn thương mô. Các chất trung gian hoá học gồm
có:
+ Các amin hoạt mạch: Histamin được giải phóng ra do sự mất hạt của
các dưỡng bào, gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạclì
của các tiểu tĩnh mạch; Serotonin giải phóng từ tiểu cầu, có tác động tương
tự như histamin [7, 82-83^.
+ Các protease của huyết tương: Hệ thống bổ thể đặc biệt là các thành
phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch. Hệ
thống đông máu và tiêu fibrin có sụ hình thành của fibrinopeptid gây tăng
tính thấm thành mạch và có hoạt tính hoá ứng động đối với bạch cầu.
Bradikinin được giải phóng từ a 2 -globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá
dưới tác dụng của yếu tố Hageman, cũng gây giãn mạch và tăng tính thấm
thành mạch [7, 84-85],
+ Các chất chuyển hoá của acid arachidonic: Acid này được giải phóng
từ phospholipid màng tế bào, chuyển hoá theo hai con đường. Theo đường
cycloxygenase tạo prostaglandin, prostacyclin, thromboxan. Theo đường
lipocygenase tạo leucotrien. Prostacyclin và thromboxan rất quan trọng trong
quá trình điều hoà đông máu. Leucotrien có tác dụng hoá ứng động bạch cầu
[7, 87-88].
+ Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF): PAF là một dẫn xuất của
phospholipid màng được sinh ra sau khi hoạt hoá phospholipase A2 và
thường được giải phóng đồng thời với các chất chuyển hoá của acid
arachidonic. PAF hoạt hoá bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính và
xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng cá enzym của thể tiêu, sinh oxyphản
ứng và các eicosanoid [7, 89-91].
+ Các gốc dẫn xuất oxy tự do: Gốc tự do oxy hình thành trong ty thể

đại thực bào đã hoạt hoá. Chúng tiêu huỷ đối tượng thực bào. Trong viêm,
khi đại thực bào bị ly giải gây tràn gốc tự do ra ngoài tạo điều kiện cho quá
trình peroxy hoá lipid màng tế bào, gây tăng tính thấm thành mạch, tạo điều
7
kiện thuận lợi cho sự giải phóng arachidonic từ phospholipid màng tế bào để
tổng hợp các chất trung gian hoá học [7, 93-94].
+ Các cytokin: các cytokin là các polypeptid do đại thực bào và limpho
bào tiết ra. Trong viêm, nồng độ các cytokin ở ổ viêm tăng cao, có tác động
quan trọng trên tế bào nội mô, bạch cầu và gây phản ứng hệ thống [7, 96-
102],
1.2. CÁC THƯÓC CHỐNG VIÊM
1.2.1. Thuốc chống viêm steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon steroid của vỏ thượng
thận như: hydrocortison, prednisolon, desamethason, betamethason. Nhóm
này ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng họfp lipocortin. Do đó
làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin, nên có tác dụng chống viêm
do moi nguyên nhân cơ học, hoá học, miễn dịch và nhiễm khuẩn. Chúng có
nhiều tác dụng phụ đối với cơ thể như loét dạ dày tá tràng, loãng xương, xốp
xương, teo cơ, suy thượng thận cấp khi dừng đột ngột [10, 632].
1.2.2. Thuốc chống viêm phi steroid
Là nhóm thuốc chống viêm không có cấu trúc steroid như:
indomethacin, aspirin, diclofenac, piroxicam, Cơ chế chống viêm của
nhóm thuốc này là ức chế enzym cyclooxygenase (COX) nên làm giảm
sự tổng hợp prostaglandin. Chúng có nhiều yếu tố bất lợi với cơ thể như
gây loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [ 10, 631 ].
1.2.3. a-Amylase.
• Sơ lược về enzym chống viêm.
Các enzym có tác dụng chống viêm như: serratiopeptidase, a-
chymotĩypsin, chymopapain, a-amylase được sử dụng ngày càng rông rãi.
Các enzym này có ưu điểm là những chất gần gũi với cơ thể con người đã

phần nào giảm được tác dụng không mong muốn của các thuốc chống viêm
8
steroid và phi steroid. Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo, cơ chất khác nhau
nhưng chúng đều có khả năng chống viêm trên cả động vật thực nghiệm và
người. Cơ chế tác động của các enzym này còn chưa thực sự làm sáng tỏ.
Tuy nhiên, chúng đã đạt hiệu quả cao trong các chỉ định chống viêm, giảm
phù nề, sử dụng hỗ trợ trong các bệnh lý viêm nhiễm đường hô hấp, giảm tiết
dịch nhầy, ức chế dịch rỉ viêm.
• Nguồn gốc, tính chất và tác dụng [12], [14], [17]
a-Amylase (1,4-a-D-glucan-glucanohydrolase) có trong nước bọt,
tuyến tụy, nấm mốc, vi khuẩn. a-Amylase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân
tinh bột, glycogen, các polysaccharid tương tự. Nó phân giải liên kết 1,4-
glycozid ở giữa chuỗi polysaccharid tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác
diing của enzym này dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo
màu với iod và bị giảm độ nhớt mạnh.
a-Amylase nước bọt là thành phần chính của nước bọt có nhiều chức
năng trong khoang miệng. Trong hệ thống tiêu hoá, enzym này có vai trò chủ
yếu ở giai đoạn đầu của quá trình sinh ra các oligosaccarid:
a-Amylase a-Amylase
Tinh bột ^ Oligosaccarid ^ Maltose + Glucose
a-Amylase bền với nhiệt nhưng kém bền với acid, có pH tối ưu khoảng
7,0. Nếu pH quá thấp thì nó chuyển thành dạng proton và mất hiệu kĩc. a-
Amylase bị ức chế bởi sự có mặt của ure và các amid khác, được kích hoạt
bởi sir có mặt của anion Cl'.
• Cấu trúc của a-amylase [12], [14], [17]
a-Amylase là một glycoprotein gồm một chuỗi polypeptid đơn với
khoảng 496 acid amin, có 2 nhóm SH, 4 liên kết disulfid và một ion Ca^^, Nó
chứa một lưọng lớn các gốc acid amin thơm (tryptophan 5,3%, tyrosin
5,5%), chứa rất nhiều acid amin có nhóm OH (threonin +serin 9,5%) và các
gốc acid dưới dạng tự do hoặc dưới dạng amid (aspartic +gìutamic 24%).

a-Amylase giống như hầu hết các protein và các enzym khác đều có
chứa những chuỗi xoắn a và chuỗi thẳng p. cấu trúc bậc hai được giữ khá
chặt bởi các liên kết hydrogen.
Chuồi chứa một lượng lớn các gốc aspartic và glutamic cho thấy cấu
trúc bậc ba nén chặt hơn bởi những gốc này có khả năng tạo thành liên kết
hydro khá mạnh.
Cấu trúc bậc bốn chứa một vùng chức năng bao gồm các xoắn a và
phiến p nối với nhau bởi rất nhiều cuộn, vòng xoắn của các gốc acid amin
chủ yếu là valin, prolin, glycin tạo ra sự thay đổi đột ngột về hướng của
chuồi polypeptid. Glycin thường có mặt bởi góc liên kết có thể chấp nhận
một phạm vi dao động rộng mà không gây ra sự va đập giữa các nguyên tử
trong mạch polypeptid.
• ứng dụng của a-amylase [3], [17
ứng dụng của a-amylase trên thực tế là rất to lớn, được sử dụng cả
trong công nghiệp, nông nghiệp và y học.
Trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất rượu, bia, nước hoa quả,
bánh mỳ a-amylase giữ một vai trò quan trọng vì nó tạo cơ chất cho quá
trình lên men.
Trong nông nghiệp, enzym này được dùng để sơ chế thức ăn bổ sung
vào thành phần thức ăn gia súc, xử lý hạt trước khi gieo, chữa một số bệnh
cho gia súc
Trong y-dược, a-amylase được đưa thêm vào cơ thể người bệnh khi
không sản xuất đủ enzym này. a-Amylase từ các nguồn khác nhau được sử
dụng là một thành phần của các chế phẩm enzym tiêu hoá và giảm viêm
10
đường hô hấp, sưng phù tại chỗ. Một số chế phẩm chống viêm, giảm phù nề
như Megamylase (Leurquin Mediolanum), Termamyi iiOL và Fungamyl
(Novo)
1.3. CÂY KIM NGÂN.
• Tên khoa học: Lonicera japónica Thunb. thuộc họ kim ngân

Caprifoliaceae.
• Tên gọi khác: Dây nhẫn đông.
• Bộ phận dùng:
+ Hoa kim ngân {Flos Lonicera) là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân.
+ Cành và lá kim ngân {Caiiỉis cum folium Lonicerae) là cành và lá phơi
hay sấy khô của cây kim ngân.
• Thành phần hoá học.
+ Cây chứa tannin và một saponin
+ Hoa chứa một flavonoid là scolymosid ( lonicerin )
+ Lá chứa loganin [11, 633].
Năm 2003, Wie Jong Kwar và cộng sự công bố tác dụng chống viêm
của saponin cây kim ngân. Cũng năm ấy, Jin Tae và cộng sir cho biết hiệu lực
chống viêm của cây kim ngân trong bệnh phù chân do chất dẫn truyền
receptor 2 kích hoạt proteinase. Đồng thời từ cây kim ngân đã phân lập được
các hoạt chất có tác dimg chống viêm là Lonicerosid A, B, c và xác định
được cấu trúc của chúng [16], [18].
• Một số đặc điểm của nhóm hoạt chất saponin.
Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thưòng gặp trong thực vật.
Người ta biết khoảng 500 loài thuộc hơn 80 họ thực vật có saponin. Saponin
có một số tính chất đặc trưng như sau:
- Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
11
- Saponin có thể làm chết cá ở những nồng độ rất thấp.
- Tạo phức với cholesterol hoặc với một só chất 3 ß- hydroxy Steroid
khác [6, 7].
Một số tác dụng của saponin có thể kể đến là:
+ Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho.
+ Một số saponin có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức
chế virus.

+ Một số có tác dụng chống ung thư trên thiĩc nghiệm, làm thuốc bổ.
+ Sapogenin làm nguyên liệu bán tổng hợp các thuốc steroid.
+ Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len
dạ, tơ lụa [6, 170-184].
• Tác dụng dưọ’c lý của cây kim ngân.
+ Tác dụng kháng khuẩn: Kim ngân có phổ kháng khuẩn rộng. Nước
sắc hoa có tác dụng ức chế rất mạnh liên cầu, tụ cầu, vi khuẩn thương hàn,
trực khuẩn lỵ Shigella, trực khuẩn lỵ E.coli, phế cầu. Nước sắc lá nồng độ
1,2-20% ức chế tạrc khuẩn lỵ Shigella, 5-20% ức chế vi khuẩn phó thương
hàn A, 100% ức chế tụ cầu [4, 76].
+ Tác dụng trên đường huyết: Sau khi cho thỏ uống nước sắc hoa kim
ngân thì đường huyết tăng kéo dài 5-6 giờ mới trở lại bình thường [4, 77].
+ Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ: Năm 1966, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn
Năng An, Bùi Chí Hiếu ( Hội nghị thuổc nam lần thứ 4, Hà N ội) đã báo cáo
nước sắc kim ngân có khả năng ngăn chặn choáng phản vệ trên chuột lang
[4, 77].
+ Độ độc: Cũng theo các tác giả trên, cho chuột nhắt trắng uống nước
sắc kim ngân trong 7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho người (tính
theo gam thể trọng ), không dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong phủ tạng và
12
100% chuột sống sót. Điều này chứng tỏ rằng nước sắc kim ngân thực tế
không độc [4, 77],
• Công dụng và liều dùng:
+ Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày day, lở ngứa,
nhiệt độc, tả lỵ, ho do phế nhiệt, dị ứng, thấp khớp.
+ Liều dùng: Ngày dùng 4-15g hoa hay 10-16g cành lá dưới dạng thuốc
sắc, hãm, cao, rượu thuốc hoặc hoàn tán. Có thể dùng riêng kim ngân hay
phối hợp với nhiều vị thuốc khác [11, 633], [4, 77].
13
Chương II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHU ONG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Kim ngân cuộng.
Là thân, cành, lá phơi và sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japónica
Thunb. thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.
Thân, cành, lá cây kim ngân ( Lonicera japónica Thunh.Caprifoliaceae)
được thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng
Yên và được bộ môn thirc vật trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa
học. Nguyên liệu sau khi thu hái được phơi trong râm mát và sấy ở nhiệt độ
50-60”C đến khô.
2.1.2. Saponin kim ngân cuộng toàn phần.
Đe có được saponin kim ngân cuộng toàn phần trong nghiên cứu,chúng
tôi đã tiến hành chiết tách theo quy trình tóm tắt như sau; Dược liệu được sấy
ở 60-65°C trong tủ sấy một giờ, tán thành bột thô. Sau đó, cân 600g bột
dược liệu chiết theo phương pháp ngâm lạnh với cồn l(f. Dịch chiết thu
được đem cất quay thu hồi cồn đến khi còn khoảng 200ml, loại tạp bằng
chloroform đến khi lóp chloroform không màu. Dịch đã loại tạp chiết tiếp
bằng butanol, đến khi lớp butanol không màu thu được dịch chiết butanol.
Cất quay thu hồi dung môi đến hết ta được cắn chứa saponin toàn phần của
cây kim ngân.
Quy trình chiết được mô tả như sơ đồ:
14
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách saponỉn kìm ngân cuộng toàn phần.
15
2.1.3. a-Amylase.
a-Amylase CÓ trong nươc bọt người được pha loãng ở các nồng độ khác
nhau để tiến hành thử trên in vitro.
Viên nén Megamylase của hãng Leurquin Mediolanum có chứa a-
amylase hàm lượng 3000Ư dùng để tiến hành thử trên in vivo.
2.1.4. Dung dịch cơ chất tinh bột 1%, pH=6,8.

Dung dịch đệm phosphat pH= 6,8:
Dinatri hydrophosphat 28,8g
Kali dihydrophosphat 11,45g
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Dung dịch tinh bột 1%: Hoà Ig tinh bột trong 5-10 ml nước lạnh rồi đổ
dần lOml dung dịch đệm phosphat pH= 6,8 đang sôi vào, tráng cốc bằng
một ít nước lạnh. Tiếp tục đun sôi trong 1 phút rồi để nguội ở nhiệt độ
phòng. Thêm nước cất vừa đủ 100 ml. Bảo quản lạnh. Chuẩn bị dung dịch
tinh bột dùng trong ngày.
2.1.5. Dung dịch albumin 5mg/ml.
Hoà tan 75mg albumin bovine kết tinh vào 15ml NaCl 0,9% thành dung
dịch albumin 5mg/ml.
2.1.6. Súc vật thí nghiệm.
Chuột cống trắng đirc và cái nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng từ 100-
130g, do trại chăn nuôi súc vật học viện 103 cung cấp.
2.1.7. Thiết bi dung cu.
- Máy đo quang Trung Quốc
r
f o
/V
- Tủ sây
- Tủ lạnh
- Máy diều nhiệt
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột
16
- Cân phân tích, cân kỹ thuật
2.1.8. Hoá chất thí ỉigiìiệm.
- Thuốc thử Gornall.
-Dungdịch HCL 0,1 N.
- Dung dịch iod phân tích.

+ Dung dịch iod gốc:
lod 0,5g
Kali iodua 5,0g
Nước cất vừa đủ 200ml
+ Dung dịch iod phân tích:
Dung dịch iod gốc 2ml
Dung dịch HCL 0, IN vừa đủ 1 OOml.
2.2. PHƯOTVG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.2.1. Phương pháp định lượng protein nưóc bọt bằng phản ứng
biure[ll].
a) Nguyên tắc:
Protein của nước bọt sẽ phản ứng với thuốc thử Gonall tạo thành màu
tím hồng. So với biểu đồ mẫu để tính ra lưọTig protein trong nước bọt.
b) Tiến hành
- Vẽ biểu đồ mẫu:
Bảng 2.1. Thể tích các thuốc thử dùng để vẽ biểu đồ mẫu.
Ong 1
2 3 4
5 6
Dung dịch albumin 5mg/ml(ml) 0
0,3
0,5
0,6 0,8
1,0
Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 1,0 0,7 0,5 0,4 0,2
0
Thuôc thử Gonall (ml) 4,0
4.0
4,0
4,0 4,0 4,0

17
V ' .
.
Lắc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo quang ở bước sóng
550nm, cuvet iciii, mẫu trắng là ống 1. Vẽ biểu đồ: Trục hoành ghi lượng
albumin (mg), trục tung ghi mật độ quang học (D).
- Định lượng protein của nước bọt. Tiến hành như sau;
Bảng 2.2. Thể tích các thuốc thử để định lirợngprotein của nước bọt.
Ong
Ống thử
Ong trăng
Dung dịch nước bọt (ml)
1,0
0
Dung dịch NaCl 0,9% (ml)
0 1,0
Thuôc thử Gonall (ml)
4,0
4,0
Lắc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo quang ở bước sóng
550nm, cuvet Icm. So với biểu đồ mẫu và tính ra lượng protein trong 1 ml
dung dịch nước bọt.
c) Tính kết quả.
Tính lượng protein (P) trong 1 ml nước bọt:
p (mg/ml) = c X B
Trong đó: C: Nồng độ protein (mg/ml) tính theo biểu đồ.
B: Độ pha loãng dung dịch protein trong nước bọt.
2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym [8]
a) Nguyên tắc
a- Amylase thuỷ phân tinh bột tạo thành các dextrin có phân tử lượng

khác nhau. Khi cho tác dụng với iod chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu sẽ
tính được hoạt độ của a- amylase.
b) Tiến hành
Nước bọt được pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng dung dịch
NaCl 0,9%.
Tiến hành định lượng enzym như sau:
18
Bảng 2.3. Thể tích các thuốc thủ’ để xác định hoạt độ enzym.
Dung dịch
Ồng thử Ong cơ chât
Dung dịch tinh bột 1 % (ml)
2,0 2,0
ủ 37"c trong 5 phút
Nước bọt đã pha loãng thích hợp (ml)
1,0
0
Lắc đều, ủ 31^c trong 5 phút. Sau đó lấy ở mỗi ống 0,1 ml cho vào 2
ống nghiệm khác đã có 10,0 ml dung dịch iod phân tích, lắc đều rồi đem đo
quang ở bước sóng 656nm, cuvet 1 cm.
Xác định khả năng thuỷ phân tinh bột của a- amylase khi kết hợp với
dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần; khi kết hợp với ion Cl': cắn
saponin toàn phần của kim ngân cuộng được pha loãng thành các nồng độ
thích hợp tạo thành dịch chiết saponin kim ngân cuông toàn phần; nồng độ
của ion c r là nồng độ của ion này có trong dung dịch NaCl ở các nồng độ
tương ứng.
Ống thử: Thêm Iml dịch chiết saponin toàn phần hoặc thêm Iml dung
dịch NaCl.
Ống cơ chất: Thêm 2ml nước cất.
c) Tính kết quả
% Tinh bột bị thuỷ phân:

D -D,
T = * xlOO%
_ D,
Trong đó: T : % tinh bột bị thuỷ phân.
Dị: Mật độ quang của ống chứng.
D2 : Mật độ quang của ống thử.
2.2.3. Phương pháp gây viêm
19
Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [13]: Tiêm 0,1 ml
dung ũịch carragenin 1% vào mặt dưới gan bàn chân sau của chuột.
2.2.4. Phương pháp thủ’ tác dụng chống viêm
Sử dụng phương pháp đo độ phù chân chuột theo mô hình của
Winter[13].
Đo thể tích bàn chân sau từ gan bàn chân tới khuỷu vào thời điểm trước khi
tiêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc.
■ Lô chứng: Chuột được uống dung dịch NaCl 0,9%.
■ Lô chuột thử dược liệu: Chuột được uống dịch chiết dược liệu bằng
một kim cong đầu tù vào thời điểm 1 giờ trước khi gây viêm.
■ Lô chuột thử a- amylase; Cho chuột uống a-amylase vào thời điểm 1
giờ trước khi gây viêm.
■ Lô chuột thử tác diing kết hợp: Cho chuột uống dịch chiết dược liệu và
a- amylase vào thời điểm 1 giờ trước khi gây viêm.
■ Lô so sánh: Chuột được uống indomethacin vào thời điểm 1 giờ trước
khi gây viêm.
Tính kết quả
Tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột so với thời điểm trước khi gâv
viêm được tính theo công thức;
AV %-
^xlOO%
Trong đó:

AV% : Phần trăm tăng thể tích chân chuột.
V1 : Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
V2 : Thể tích chân chuột sau khi gây viêm.
Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột
trong cùng một lô và sai số chuẩn của nó : AV% ± S.E.
20