Nghiên cứu thành phần hóa học anthocyan và một số tác dụng sinh học của đơn lá đỏ

n ộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI.
SV: Dương THỊ Lệ Hồng
NGHIÊN c ú u THÀNH PHÂN HOÁ HỌC
ANTHOCYAN VÀ MỘT s ổ TÁC DỤNG SINH IIỌC
CỦA ĐƠN LÁ ĐỎ
(Excoecaria cochinchinensỉs Lour. Euphorbiaceae)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1996-2001)
Giáo viên hưứiig dẫn: ThS. Nguyễn Thái An
ThS. Đào Thị Vui
Nơi thực hiện : Bộ môn Dược học cổ truyền
Thời gian thực hiện : 3/2001 - 5/2001
u
HÀ NỘI 2001
^ V ' r \
'ìvế&^k
ý>>— - f ^ y
hCHnt* .
J l ( f ì c ă m đ í t
Mài đ a n tiên của Ui HI á ỉtiậii n à ụ, em xìti hàụ tà /ởỉ biêt. tín. .1 àII »ne tới
e/tc th ầ y cỗ qìá&i
. xJltfS. Q ĩg u ụ ễ n Í7 h á i. <7 / « .
£ĩfif$. (J)ào 0 7 // <7ỉu ỉ.
Mà uhữntỊ nqttfli ĩtã tận fifth ítiiẻịiq dẫn , eltỉ bàtì ỉrtìn q iỉỉốt
q u á ỉ r ìn h thựe. h i ệ n u t i o á l u ậ n H ilự .
(5m -r ù t e í ìtì n t h à n h C(ÌI11 o n iff' g i ú p i t ở e ìia íTrV. < y )h ạ m O f)Ịfâ n
S ì n h , Q S . rĐ fì Q lq ọ e . Q ’f i a i t / t , 0 S.C 7 S . £7'rầ n M ạ n h ( B ì n h ỉừ i 0X10 th ầ ụ cỗ ỊỊÌá ữ
ÌVOHÍỊ hộ Mồn (Dỉỉtíe. ítơe eẽ truụền, hộ m ồn (DtíỢe. lụ .t bộ m ôn 'Jfiott sìn h ,
p l i è i t q Q ĩ q h i ê n c ứ u k h t ì a h ọ e., r/)li(U U f (Ị ỉ á o t ồ i .
( Đ ã q ì ủ p đ ồ ' e m h o à n f it ờ n i l tf ft k h o á í i t ậ n t ố t t t g ỉ t i ê p ttỜ Ị Ị. /H ô! /iì n
ntĩa em -riiteìiân ỉ rọ ít (Ị etỉitt đtt.

7/5« nội, Q ĩqàiỊ 2 2 tliáiHỊ 5 n ă m 2 0 0 1 .
Sitth. Dtêtt.
Ơ J u ’ờ n g 'r ĩliỊ M ê y ô ề n ợ
M ỤC LỤC
PHẨN I - ĐẶT VÂN ĐỂ
PIIẤN II - TỔN(Ĩ QUAN
2.1 Đặc điểm thực vật
2.2. Đặc điểm vi học
2.3. Phân bố
2.4. Trồng trọt,thu hái,chế biến
2.5. Thành phần hoá học
2.6. Tác dụng sinh học
2.7. Công dụng
PHẨN III - THỰC NGHIỆM VẢ KẾT QUẢ
3.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Kết quá thực nghiệin và nhận xét
3.2.ỉ . Iỉoá học
3.2.LI. Chiết tách anthocyan
3.2.1.2. Định tính anthocyan
3.2.!.?. Phân lập anthocyan
3.2.I.4. Tinh chếanthocyan
3.2.2.Tác dụng dược lý
3.2.2.1 Tác dụng chống viêm
3.2.2.2. Tác dụng chống dị ứng
PHẨN IV - KẾT LUẬN VẢ ĐỂ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỂ
Cùng với thời gian, sự phái triổn mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật đã làm cho
công nghộ dược phẩm thế giới có bước chuyển biến vượt bậc, hàng loạt tân dược
ra đời, đáp ứng ngày càng cao yêu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của cộng

đồng. Tuy nhiôn, do thuốc tân dược gây ra nhiều lác dụng không mong muốn và
độc lính, vì vậy ngày nay xu hướng sử dụng thuốc cổ truyền không những trên
thế giới mà ngay cả ở Việl nam ngày càng gia tăng đặc biệt là để chữa các bệnh
thông thường trong nhân dan.
Nước ta có nguồn dược liệu phong phú, đa dạng với nền y học cổ truyền phát
triển từ lâu đời. Bên cạnh đó, do điều kiện địa hình, khí hậu nhiệt đới phức tạp.
các bệnh mụn nhọt, mẩn ngứa, ỉa chảy thường gặp trong nhân dân. Từ lâu, Đơn
lá đỏ đã được nhân dân sử dụng đổ chữa mẩn ngứa, mụn nhọt, ỉa chảy theo kinh
nghiêm dân gian. Do đó, việc xác định thành phần hoá học, tác dụng dược lý của
lá cây Đơn lá đỏ là điều cán thiếl và liên tới cải thiện dạng dùng cho tiện lợi.
Thế giới cây cỏ thật đa dạng về màu sắc. Một trong những chất màu đáng chú
ý và thu hút trong tự nhiên được tạo bởi anlhocyanin. Anthocyan đã được biếl
đến với tác dụng kháng khuẩn, chống oxyhóa, chống viôm.
Do vậy, câu hỏi đặt ra là liệu rằng trong lá cây Đơn lá đỏ, hợp chất nào có tác
dụng, hiệu lực ra sao, để trả lời câu hỏi đó đã có 1 số nghiến cứu về lá cây Đơn lá
đỏ, tuy nhiên chưa được hoàn thiện. Để liến tới tách và xác định được thành phán
chính trong cây có tác dụng sinh học, và xa hơn nữa là xác định cấu trúc hoá học
của thành phần chính đó, chúng lôi tiếp tục nghiên cứu về lá cây Đơn lá đỏ với
các mục tiêu sau:
1. Chiếl tách, định lính thành phần hoá học cmthocyan.
2. Thăm dò một số tác dụng sinh học: Thử tác dụng chống viêm, thử tác
dụng chống dị ứng của dịch sắc lá Đơn lá đỏ, thành phần ^lavonoid và (hành
phần onlhocyan.
1
2.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
2.1.1. Tên khoa học
Excoecaria bicơlor Hassk. [3, 6, 8, 11, 17].
Excoecaria cocìùiicìùnensis Lour. |4, 11 ]
Họ Thầu dẩu (Eĩipìtorbiaceae).
Đơn lá đỏ còn gọi là Đơn iướng quân, Đơn tía, Đơn mặt quỉ, Hồng bối quế

hoa [11], Đơn mặt trời, Liễu đỏ |4|, Bách thiên liễu [8].
2.1.2. Bộ phận dùng
Cành non, lá, rỗ.
2.1.3. Mô tả thực vật
Cây nhỏ, cao 0,4-lm; cành nhỏ, t2,ổy, đài [4, 11 Ị. Lá mọc đối, hình trái xoan
thuôn dài, phía cuống nhọn, phía đầu có mũi nhọn, ngắn, dài 6-12cm, rộng 1.2-
4cm; mặt trên lá màu xanh lục xãm, mặt dưới màu đỏ tía, mép lá có răng cưa,
cuống ngắn 5-10mm [11] (Xcm hình 1).
Cây có nhựa mủ Irắng [3, 11, 19|.
Hoa mọc Ihành bông ở kẽ lá hay đẩu cành, không có tràng hoa [3, 4, 111, hoa
có ba lá bắc gần giống với cánh đài [14]. Hoa đực dài 2 cm, hoa cái ngắn hơn
I '
nhưng lo hơn [11]. Hoa đơn lính cùng gốc hay khác gốc[3, 14]. Hoa có ba lá đài
màu xanh, hoa đực với 3 liền nhụy, hoa cái có ba vòi nhụy nguyên [14|. Cây ra
hoa vào các tháng 4, 5, 6 [3, 4, 11 Ị.
Công thức hoa [14]: * ổ K,CoA,G0
* 9 K jG > A 0Qs,
Quả nang 3 mảnh, đường kính 1 cm, hạl hình cầu, màu nâu nhạt, đường kính
4 mm [4, 11 ]. Nội nhũ dầu 114].
PHẦN II - TỔNG QUAN
2
Hình I-Ả n h cây Đơn lá đỏ
1.2. ĐẶC ĐIỂM VI HỌC
Theo tài liệu [14] đã xác định cấu trúc vi học của cây Đơn lá đỏ bao gồm:
ihẫu lá, vi phẫu Ihân, soi hột lá.
-Sơ đồ vi phẫu lá:
___
1. Biểu bì
2. Mô dày
3 . Mỏ mềm vỏ

4. Mô dậu
5. Bổ libc-gỗ
I *
Hình 2 -Sư đồ tổng quát vi phẫu lá
1. Biểu bì
2. Mô đày
3. Mô mềm vỏ
4. Sợi
5. Mô mềm ruột
6. Ống nhựa mủ
Hình 3 -Sơ đồ tổng quát vi phẫu thăn 7. Bó libe-gỗ
- Soi bội lá:
1.Tếbàolỏ khí
2. Sựi
3. Mạch xoắn
4. Mảnh rncvmềm
I •
5.Mảnh mô mềm chứa mảnh chất màu
6. Tinh bột v p ^ k c ỉ i
7. Tinh thể canci oxalat
Hình 4- Đặc điểm bột lá
2.3. PHÂN I5Ố
Chi Excoecaria gồm 40 loài phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới Châu Á,
Châu Phi, và Tây Bắc nước ức [19]. Bảy loài được tìm thấy ỏ Thái Lan, phổ hiến
là E. agaìỉocha Linn. ; E.opposi ti folia Griff.; Lĩ.bicolor Zoll. ex. Hassk.
Ở Vi‘ệt'nam, Đơn lá đỏ mọc hoang hay được trồng ở nhiều nơi ở các tỉnh
phía Nam như: Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp, Hậu Giang, An Giang[25|; ở
phía Bắc, cây được trồng nhiều ở làng hoa Ngọc Hà - Hà Nội, Thái Bình, Nam
Định Ngoài ra cây còn được trồng ở Quảng Tây, Vân Nam (Trung Quốc) [15].
-Sơ đồ vi phẫu thân:

A
ò
4
Cây được Irồng làm cảnh, lấy lá và cành non làm thuốc [3, 4, 11]. Những cây
mọc hoang thường to cao hơn, lá ft cỏ màu đỏ tía hơn, có khi mặt dưới có màu
xanh, phiến lá hình mác thuôn dài Ị11 ].
2.4. TRỐNG TRỌT, THƯ HÁI VÀ CHỂ HIẾN
2.4.1. Trồng trọt
Thường gieo hạt vào vụ đông xuân f31, hay dâm cành vào mùa xuân và đầu
hè, có nơi trồng bằng rễ cây [9].
2.4.2. Thu hái, chế biến
Thường thu hái quanh năm, hái lá, cành non vào buổi sáng sớm, mang về
phơi âm can cho héo, sau đó cắl khúc 3 - 6 em, liếp tục phơi dưới nắng cho khổ,
có khi sấy ở nhiệt độ 50° c Irong 2 -3 giờ.
Rễ lấy vổ sao vàng hay phơi khô [11].
2.5. THÀNH PHẨN HOÁ HỌC
Theo các lài liộu [ 19] đã nghiên cứu, từ chi Excoecaria đã chiết tách được các
thành phần hoá học như: Daphnane diterpcn esler, Excoecariatoxin trong vỏ thân
và chồi non của
E.agallocha mọc ở Okinawa. Diterpen ester này và một số hợp
chấl khác cũng có Irong nhựa của cây E.agaììocha mọc ở Thái Lan. Mộl số thành
phần khác của cây E.agalbcha như: triterpcncs, hydrocarbon, acid béo dưới dạng
sulfat Irong gỗ, alcaloiđ cinnamoyl piperidine trong vỏ hạt. Trong lá và hạt của
E.agưììoctĩci lấy à Tây Bắc úc, người la đã phân lập được một phorbol ester mới.
Từ nhựa của E.oppositifoiia, người la đã lách được diterpene orthoester, lừ
nhựa của E. kavvaẹii 10 lanin đã được chiếl tách và đo phổ để xác định cấu Irúc
[19]. Từ nhựa của E. coclìiỉicìiinensis var. viridis. Merr đã phân lập được
Daphnane và Tigliane có cấu trúc di terpen cslcr [19].
Từ thân và rễ của E. cochinchiiiensis var. viridis. MeiT đã tách ra 1-
cycỉohexene -1 - carboxylic acid- 5 - hydroxy -3,4 -isopropylidene - dioxy;

shikimic acid; oxy - bis (5 - melhylene - 2 - furaldehyde); p - sitosterol;
tetracosanoic acid; palmitic acid; steric acid; hentriacontane [23].
Nguyễn Thị Anh Thư đã xác định trong lá Đơn lá đỏ có: coumarin,
anlhraglycosid, flavonoid, lanin, saponin f 14]:
-Với sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy llavonoid đều xuất hiện 4 vết có Rf kliác
nhau.
- Sắc ký lớp mỏng saponin xuất hiôn 4 vết.
- Sắc ký lớp mỏng coumarin xuất hiện 3 vếl.
Sắc ký chế hoá tách được một chất có phổ u v X maxEtOH = 270 và 215 nm; phổ
IR hấp thụ ở: 3278 c m 1, 1654 cm '1, 1611.6 cm 1, 1542 cm'1, 1220 cm'1, 1025 cm'
\ 7669 cm'1: Nhiệt độ nóng chảy lừ 209 - 214° c [9].
Hàm lượng íìavonoid loàn phẩrL-định ỉượng bằng phương pháp cân là 4,12%.
Hàm lượng này khống thay đổi khi chế biến.
Hàm lượng flavonoid toàn phẩn định lượng bằng phương pháp đo quang trên
các mẫu ở 1 số địa phương như sau: mẫu Thái Bình 1,42%; Nghĩa Đàn - Nghệ
An 1,38%; Nam Đàn - Nghệ An 1,35%; Tuyên Quang 1,31%; Hà nội 1,10%.
2.6.TÁC DỤNG SINH HỌC
- Độc tính: lá Đơn đỏ không có độc tính bán cấp [ 14].
- Đơn lá đỏ có tác dụng chống dị ứng, chống choáng phản vệ đặc biệt
khi kết hợp với Kim ngân hoa, nâng cao lỷ lệ súc vật sống sót qua cơn choáng
phản vệ [11, 12].
- Đơn lá đỏ kết hợp với Thương nhĩ tử và Kinh giới dưới dạng chè nhúng có tác
dụng chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn, chống ôxy hoá [16].
6
- Nhựa cây độc với cá [3, 4, 11]. Hợp chất Daphnane điterpen ester được chiếl từ
nhựa gây kích ứng da [ 19Ị.
- Đơn lá đỏ có tác dụng kháng khuẩn, tác dụng trên các vi khuẩn Bacillus
subtilis, B. mycoides, B.cereus, B.pulmilis [12] và có tác dụng kháng nấm
Candida albicans tốt [12, 14].
- Dịch chiết ^lavonoid từ lá Đơn đỏ có tác dụng ức chế rất tốt đối với vi

khuẩn Gram (+) như: Bacillus sublilis, B.cereus, B.pulmilis, Sarcina lutca.
- Dịch chiết $aponin CÓ tác dụng ức chế đối với vi khuẩn Gram (+) kém, nhưng
lại có tác dụng tốt trên nấm Candida albicans.
- Tất cả các dịch chiết đều không có lác dụng đối với vi khuẩn Gram (-) [14J.
- Thử tác dụng của 1 thành phần lách từ hỗn hợp ílavonoid toàn phần bằng sắc ký
chế hoá, nhận thấy nó có tác dụng trên cả chủng Staphylococus aureus [9Ị.
Theo nghiên cứu gần đây , Erickson đã thông báo về tác dụng chống HIV
của 1 phorbol mới được phân lập từ lá và hạt của E.agaììocha thu hái ở Tây Bắc
nước ức [19].
2.7. CỒNG DỤNG .
Một số loài trong chi Excoecaria đã được nhiều tài liệu nghiên cứu để sử
dụng như lá và nhựa của E.agalloeha được dùng để ruốc cá ở New Caledonia, Ẩn
Độ, Malayxia . vỏ ihân và gỗ cây này, được dùng trong thuốc cổ truyền của Thái
Lan đổ chữa chướng bụng, đầy hơi ị 19].
Hai loài E.aqallocha, E.opposiíi/ơlia được nhân dân địa phưưng tỉnh Songkla
(Thái Lan) dùng làm thuốc, nhưng chưa có tài liệu hướng dẫn cụ thể [19].
7
2.7.1. .Tính vị, qui kỉnh , công năng, chủ trị của vị thuốc Đơn lá đỏ.
- Tính vị, quy kinh'. Đơn lá đỏ có vị đắng ngọt, tính mát [3, 4J.
- Công năng: Hoạt huyếl, chỉ ngứa, thanh nhiệt, giải độc, khu phong trừ thấp, lợi
tiểu, giảm đau [3, 4, 11J.
- Chủ tri: Thường dùng chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, đi lỵ, đái ra máu, đại liện ra
máu, ỉa lỏng lâu ngày [3, 4, 11 Ị.
Ở Thái Lan, lá cây còn dùng làm thuốc trợ đẻ [4] và lợi tiểu [19]. Người ta
thường phối hợp Đơn lá đỏ với một số vị thuốc như: Đơn tướng quân, Mã đề,
Kim ngân dùng để chữa dị ứng, mẩn ngứa, mề đay, mụn nhọt [15 Ị. Rễ cây chữa
kinh nguyệt không đều, trị phong thấp [15].
2.7.2. Đơn thuốc có lá Đơn lá đỏ dùng trong nhân dân.
- Chữa mẩn ngứa, mụn nhợt: Dùng 20-30 g lá sắc uống dùng riêng hay phối hợp
với lá Thài lài tía, Bầu đất tía, Đậu ván tía [3, 4, 8].

- Chữa đi ỉa lỏng ìâu ngày: Dùng 15 g lá khô sao vàng, thêm một miếng gừng
nướng, sắc với 3 bát nước, còn lại 1 hát, chia 3 lần uống trong ngày [3, 4, 11],
-
Chữa đợi íiệìi ra máu và trẻ em đi lỵ: Lấy 1 nắm lá, sắc uống [3, 4, 8].
- Chữa zona, mẩn ngứa, mất ngủ: Lá tươi 400 g, sao vàng, để nguội. Thêm 600
ml nước, sắc còn 200 ml (1 bát), chia 2-3 lần uống trong ngày[llj.
- Chữa mụn nhọt lở ngứa, viêm cơ: Lá Đơn đỏ kết hợp với Kim ngân hoa, Ké đầu
ngựa, Sài đất, Thổ phục linh, Hà ihủ ổ đỏ, Hoàng đằng, Huyền sâm, Kê huyêì
đằng, Lá móng tay, Bổ công anh, Ngưu bàng tử mỗi vị 12 gam sắc uống [11].
8
' PHẦN III - THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. NGUYỀN LIỆU VÀ PHƯƠNG ]>HÁI> NGHIÊN c ứ u
3.1.1. Nguyên liệu , súc vật, hoá chất
-Nguyền liêu: Lá cây Đơn lá đỏ thu hái khi cây đã ra hoa, quả, thu vào tháng 3
trong năm tại tỉnh Thái Bình. Lá sau khi thu hái đem phơi khô tự nhiên rồi tán
ihô.
-Súc vât thí nghiêm: Chuột cống trắng 140-180 g; chuột nhắt trắng 18 - 22 g đạt
tiêu chuắn súc vật Ihí nghiôm do Viộn vộ sinh dịch tễ cung cấp.
- ỉỉoá CÌUÍỊ: methanol, clhanol, cthylacctat, chloroform, carragenin 1% đạl liêu
chuẩn thí nghiệm do phòng Giáo lài Trường Đại học Dược cấp.
3.1.2. Phương pháp nghiên cứu
3.1.2.1. Hoá hoc
- Chiết tách anthocyan trong lá Đơn đỏ theo phương pháp ghi trong lài liệu
113, 20].
- Định lính anthocyan bằng phản ứng hoá học theo lài liệu [1, 2, 7, 211.
- Sắc ký lớp mỏng theo lài liệu 11, 7Ị.
- Sắc ký giấy theo phương pháp ghi trong tài liệu [1,7].
- Phân lập anlhocyan bằng sắc kỷ cộí Iheo tài liệu [7, 20].
(
- Cấl chân không trên máy Buchi Rotavapor R-l 14.

- Định tĩnh chất phân Iâp bằng các phản ứng hóa học và phương pháp
quang phổ [7 |:
+ Đo phổ lử ngoại ừên máy UV- VIS Sptrophotometer carry IE
varian (úc) lại phòng 111 í nghiộm trung tâm trường Đại học Dược.
+ Đo phổ hồng ngoại Iron máy FT-IE-spectrophotometer 1650 Perkin
Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm Irung tâm Đại học Dược.
9
3.1.2.2. Thử mốt số tác dung sinh hoc
* Mẫu thử:
+ Lá khô của cây Đơn lá đỏ được bào chế thành dạng cao lỏng (2:1) theo phương
pháp sắc.
+ Dịch chiết ílavonoiđ thu được bằng cách lắc với ethyl acetat.
I •
+ Dịch chiết anthocyan là lớp nước thu được sau khi lắc với
ethyl acetat
* Thử tác dụng chổng viêm:
Theo phương pháp của Winter và cộng sự trên mô hình thực nghiệm gây phù
chân chuộl hằng carragenin ỉ % Ị 10, 12].
Đo thể tích chân chuột ở các thời điểm trước và sau khi gây viêm. Tác dụng
chống viêm được đánh giá qua tỷ lộ% độ phù chân chuột của lô Ihử so với lô
chứng theo công thức:
I
Vt - Vo
x % = - — — *100 «
Vo
Trong đó:
x%: Độ phù chân chuột
Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
Vt: Thể tích chân chuộl sau khi gây viêm ở thời điểm t.
10

* Thử lác dụng chống dị ứng / / 2 / :
Gây cảm ứng cho chuột theo kỹ thuật của Perper và gây phản ứng quá mẫn
trôn da cho chuột theo kỹ Ihuậl của Church và Miler. Chiết và định lượng xanh
metylen ở vùng da phản ứng theo lài liệu [12]. Đo mật độ quang trên máy quang
điện kế TQ 752 ở bước sóng 620 lim,
Xử lý kết quả nghiền cứu bằng phương pháp thống kê sinh học.
3.2. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT
3.2.1. Hoá học:
3.2.1.1. Chiết tách Anthocvan: Lá Đơn đỏ khô (150 g) tán vừa phải, ngâm trong
MeOH trong 6 giờ ở nhiệl độ phòng, lọc, dịch lọc được cất thu hồi dung môi ở áp
suất giảm. Sau đó thêm nước rồi lắc với chloroform để loại clorophyl. Gộp dịch
chiết nước, cô tới Ihể tích nhất định, sau đó liến hành lắc với ethyl acetat. Gộp
dịch chiết nước, cô lới thổ tích nhỏ nhất, thu được cao mềm anthocyan.
(Quá trình chiết được mổ) íả theo sơ đồ I).
11
Sơ đồ L Quy trình chiết xuất Ànthocyan từ lá Đơn lá đỏ
I ‘
12
3.2.1.2. Đinh tính Anthocvan bằng phản ứng hoá hoc:
Hoà 1 lượng nhỏ cao mềm hằng nước để có dung dịch đem thử các phản ứng
hoá học:
a. Phản ứng với hơi Amoniac:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ hơi Amoniac, thấy chuyển sang màu
xanh tím. Phản ứng dương tính (+).
b. Phẩn ứng với dung dịch NaOH 10%:
Cho vào dung dịch thử 1 vài giọt NaOH 10%, thấy có màu xanh nõn chuối.
Phản ứng dương tính (+).
c. Phản ứng với FeCl35%:
Cho vài giọt FeCỈ3 5% vào 1 ml dung dịch Ihử, thấy có màu xanh đen. Phản
ứng dương tính (+).

d. Phẩn ứng Cyanidùi:
Ống 1: Làm đối chứng.
Ống 2: 0,5 ml dịch thử + 1 ml HC1 đăc + 1 ít bột Mg, thấy có màu hồng đâm.
Ống 3: 0,5 ml dịch Ihử + 1 ml HC1 đặc, thấy có màu đỏ hồng.
Phản ứng dương tính (+).
Kết quả các phản ứng định tính anthocyan được tóm tắt ở bảng 1
13
Bangỉ: Tóm tắt kết quả các phản ứng hoá học định tính Anthocyan
,Phản ứng Màu sắc phản ứng Kết luận
Hơi
Xanh tím (++)
Có Anthocyan
Amoniac
FeCl3 5%
Xanh đen (+++)
Có hợp chất polyphenol
NaOH
Xanh nõn chuối Có Anthocyan
10%
(+++)
Cyanidin
Hồng đậm (++)
Có Anthocyan
Chú giải: Phản ứng: Rấl rõ (+++)
Rõ (++)
3.2.I.3. Phân iủp anthocvan bằng sác ký côt:
Bằng phương pháp chiết trên, trong dịch chiết nước sau khi lắc nhiều lần với
cthyl acetaí, anthocyan là Ihành phẩn chủ yếu, còn lẫn các thành phần flavonoid
khác. Do đó, chúng tôi đã liến hành nghiên cứu phương pháp tách chiết
anthocyan bằng sắc ký cột với chất hấp phụ ODS (octadecyl silan) (l,5xl5cm)

• Chuẩn bị
CỘI
sắc ký: Cộl lắp thẳng, đáy cột lót lớp bông Ihuỷ tinh. Lắc
chấl hấp phụ với hệ dung môi thành hỗn dịch, rót từ từ vào cột, cho dung môi
chảy qua cột liên tục để ổn định CỘI trong 10 giờ.
• Chọn hệ dung môi: Chọn hệ MeOH- H ,0 làm hệ dung môi khai triển sắc
kỷ CỘI. Đổ tăng khả năng tách chiết chA't anlhocyan chúng lôi đã sử dụng hệ dung
môi McOH - H20 có các lỷ lệ khác nhau khi khai triển sắc ký cột.
Mỗi lỷ lệ dùng 100 ml, tốc độ khoảng 10 giọt/phút. Hứng các phân đoạn vào
các bình nón riêng biệt (mỗi phân đoạn khoảng 10 ml). Cất quay chân không các
phân đoạn Irong bình nón còn 1 ml.
14
Kiểm tra thành phẩn các phân đoạn trong mồi bình nón bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng, dùng bản mỏng tráng sẩn của hãng Merck, hệ dung môi khai triển
là: EtOAc- HCOOH- H20 (85:6:9). Sau khi khai triển, bản mỏng được lấy ra đổ
khô. Dựa vào kết quả sắc ký đồ (Hình 5) chúng tôi nhận thấy các phân đoạn 8, 9,
10 cho một vết có màu đỏ lím trong ánh sáng thường, đồng thời có một số vết
nhỏ, mờ. Do đó, để có được chất linh khiết, chúng tôi tiếp tục phân lập lại các
phân đoạn1 này bằng sắc ký CỘI với chất nhồi cột là Sephadex LH 20.
V 01
Hỉnh 5- Sắc ký đồ phân đoạn 8,9,10 trong hệ dung mỗi EtOAc - HCOOH -
Iỉ20 (85:6:9)
Bảng 2*Kết quả sắc ký lớp mỏng định tính anthocyan trong phân đoạn 8, 9,
10.
Màu sắc vết
Vếl
Rf
uv 366 nm
uv 254 nm
Ánh sáng

thường
l . • 0,11 Đỏ tím Nâu sậm Đỏ tím
3.2.I.4. Tinh chế anthocvan bằng sắc kv cỏt
Chấl hấp phụ: Sephadcx LH- 20.
Hộ dung môi rửa giải: EtOH 90%.
• Chuẩn bị cột sắc ký: Cột lắp thẳng, đáy cột lót lớp bông thuỷ tinh. Lắc chất
hấp phụ với hộ dung môi Ihành hỗn dịch, rót lừ từ vào cột, cho dung môi
chảy qua cột liên lục để ổn định cột Irong 10 giờ.
• Mẫu nghiên cứu là các phân đoạn 8, 9, 10 được cất quay tới khô, dùng một
lượng nhỏ cồn 90% đổ hoà tan, rồi đưa lên cột.
• Khải triển sắc ký: Cho dung môi chảy qua cột với tốc độ 10 giọt / phút.
Hứng các phân đoạn rửa giải vào các ống ngliiôm riêng biệt 10 ml / phân đoạn.
Cất quay chân không các phân đoạn trong ống nghiệm còn 1 ml. Kiểm tra
thành phần mỗi phân đoạn bằng sắc kỷ lớp mỏng với các hệ dung môi là:
n BuOH - CH,COOH - H ,0 (85:5:10).
EíOAc - HCOOH - H20 (70:15:15 ).
Qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng nhận thấy các phân đoạn từ 5 đến 9 đều
cho mộl vết có Rf tương đương .Vì vậy các phân đoạn này được kiểm tra hằng sắc
ký giấy với các hệ dung môi:
. . ỉ.n B u 0 H -C H ,C 0 0 H -H 20 ( 4:1:5).
2. CH .COOỈ I - HCI - H ,0 (5:1:5).
3. EtOAc - HCOOH - H20 (3:3:1).
4. conc.HCl - H20 ( 3: 97 ).
16
- — —
~ ~ ~ -

-

0 0

Y t H
0 0
Vèi í
0 0
V ê í l
1
1
irv I
ì
Ư V
£ £
Hộ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 4
Hình 6- Sắc ký đồ sắc ký giấy các phân đoạn từ 5 đến 9
Bảng 3: Kết quả sắc ký giấy
Vết 1
Hộ 1
Hệ 2
Hệ 3 Hệ 4
Rf
0,5
0,49 0,55
0,26
Màu sắc vết ở ánh sáng
thường
Đỏ lfm
Đỏ tím
Đỏ tím
Đỏ tím
Kết quả cho thấy, các phân đoạn đều chỉ chứa 1 thành phần có Rf lương đương.
Các phân đoạn này được phối hợp với nhau và gọi tên là FAD 9. FAD 9 cổ màu

đỏ tím trong ánh sáng thường.
Như vậy bằng sắc ký cột với ODS và Sephadex LH 20, chúng tôi đã Ihu được
một chấl tinh khiết là FAD 9
3.2.I.5. Dir kiến cấu trúc của chất phản lâp đưưc báng các phản ứng hoá hoe
và các phương pháp quang phổ.
% Phản ứng hoá học
Chúng lôi đã thực hiện các phản ứng định lính của aníhoxyan đối với chấl FAD
9 và thấy rằng chất này dương lính với các phản ứng sau :
* Phảỉi ứng với hơi Amoniar. cho màu xanh tím.
* Phản ứng với dung dịch NaOlỉ 10%: cho màu xanh nõn chuối
* Phản ứng với dung dịch FeCI35%: cho màu xanh đen.
* Phản ứng Cyanidin: cho màu hồng đậm.
# Ptiương pháp quang phổ
Ọuang phổ lử ngoại của chất FAD 9 trong dung môi là ElOH có các đỉnh hấp
Ihụ cực đại X max: 212 nm; 274 nm (Hình 7) đặc trưng cho flavonoid. Ngoài ra
còn có đỉnh 546 nm nằm trong vùng hấp thụ cực đại của nhóm anthocyan
(460nm - 550nm), và rất gẩn với sóng hấp thụ cực đại của delphinin (541 nm).
Quang phổ hồng ngoại của chất FAD 9 có các đỉnh (Hình 8).
1214 cm'1 ứng với dao động \)c_o của C-OH phenol.
1450 cm'1 ; 1614cm1 ứng với dao động vc_c của nhân thơm.
1709 cm'1 ứng với dao động của\) r=f) nhóm carbonyl.
I •
2850 cm'1 ứng với dao động của \) 0 . J | nhóm -OCH3
3393 cm'1 ứng với dao động của \)OH nhóm phenol.
Chúng lôi đã liến hành Ihử lest màu với chấl FAD 9 vừa phân lập đưực:
Hoà một ít FAD 9 trong nước, Ihêm vài giọl dung dịch Natri acetat thấy xuất hiện
màu xanh tím.
Từ các kếl quả nghiôn cứu trên, chúng tôi dự kiến FAD 9 thuộc nhóm
anlhocyan.
18

A us
ABS
ABS
0 . 1^134 NM 546 .6 6 7
0 . 62693 NM 274 . I'M
1.3 23 6 7 NM 212.222
0 . 0 0 0 3
nns_
1 .ZOO0_
B.OBWL
0.4000
n.0000-
Mau F<1D-9/EI.0ll 3 May znoi
Gi\ 1 11 lf)r) SUM z.f)
Jlnse I i lie
____
I)I'!•'
__
I’HJI(:
__
Jl_
ADS
"Y
Z00.0H
iVisn.nY nrvfri
'Irin.nn
7 5 0 . 0 0
_________
HML
r

8 .8808
__
->
1-5080
____
nc-sn<\ie ZoomBaseline Erase Uieu
l.!sc_ t Ịie ííràUỈL]cs_cursorJ _tr:ack,s lope
MM
ursor
GOR.00
200.00 -> 750.BB
Label More
PERKIN ELMER
31.39-
XĨ
■'A
, I
/
»1
i , [\
Ị A ;
1
cr»
Ki
14.00-
pi
I .
u !
i
I Í

22
S3
CO
TT
•-O
Ị

i
\ i
\ : w
\ ; \ /
r n ”T
2 ạ
I
in
3
s
~—r

’-~~f 1

J—

4000 3500 3000 2500 2000
1500
10013
cm4 500
•31/03/17 06:43 Phong 7NTT-DH Duo-:
1 span, 4.0cm -l. srroot.n

v x c ị wqpQi
ccL FAt> 9 .
lau r flD -9.L.H o rg*T HCJ•*
3.2.2 T Ắ C DUNG Dươc LÝ
3.2.%1. Tác dụng chống viêm
* Cách tiến hành: Chúng tôi nghiên cứu tác dụng chống viêm của mẫu thử theo
phương pháp của Winter và cộng sự trên mô hình gây phù Ihực nghiộm chân
chuột [10,12].
- Dùng chuột cống Irắng cả 2 giống, trọng lượng 140 -180 g chia ngẫu
nhiên thành 5 lô:
+ Lô chứng: Uống nước muối sinh lý 0,9%, 2 ml/100 g chuột.
+ Lô chuẩn: Cho uống hỗn dịch Aspirin 4%, 2ml / 100 g chuột.
+ Lô thử 1 : Uống dịch sắc (2:1) 2ml / 100 g chuột (25 g/ kg).
+ Lô thử 2: Uống dịch chiết ilavonoid loàn phần,2 ml/ 100 g chuột (25 g/ kg).
+ Lổ thử 3: Uống dịch chiết anthoeyan 2%, 2 ml/ 100 g chuột
Các lô được cho uống 3 lẩn, 3 ngày liên tục vào 9 giờ sáng trước khi cho ăn.
Sau khi cho uống lần 3 được 1 giờ, tiến hành gây viêm.
- Gây viêm: Bằng cách tiêm vào dưới da lòng bàn chân sau phải của chuột 0,05ml
dịch treo caH&genin 1%.
- Đo thể tích chân chuột vào các ihời điểm trước khi gây viêm và 1, 2, 3, 4, 5. 6.
24 và 30 giở sau khi gây viêm
Tính lỷ lệ % độ phù chân chuột theo công thức sau:
• ' x % = 11 ~ — *100
Vo
Trong đó:
x%: Tỷ lệ % độ phù chân chuột.
Vo : Thổ tích bàn chân của chuột trước khi gây viêm.
V t: Thể tích bàn chân chuộl lại thời điểm t sau khi gây viêm.
19
Xử lý kết quả theo phương pháp Ihống kê với độ tin cậy 95%

Kết quả: đươc trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của các mẫu thử Đơn lá đỏ tới tỷ lệ % phù chân chuột
trung bình
Thòi gian
1
Tỷ lệ % phù chân chuột trung bình
Lô
chứng(n=6)
Lô
chuẩn(n=6)
Lô thử
1(11=6)
Lô thử
2(n=6)
Lô thử
3(n=6)
1
19,9 ± 7,8
10,2 ±5,1 18,7 ±6,4 16,2 ± 9,3
16,9 ±3,9
2
43,1 ±7,1
15,9 ±8,3
38,6 ± 4,4
41,9 ± 14,0
38,6 ± 4,9
3
70,7 ± 7,9
15,9 ±8,3
61,8 ± 7,5

59,11 ±5,8 60,7 ± 10,7
4
76,1 ±6,3
19,1 ±7,7
60,2 ± 6,2
63,9 ± 7,6 64,9 ± 12,0
5
71,5 ±6,3 21,6 ± 12,7
53,3 ± 11,3
58,5 ± 11,8
59,3 ± 12,9
6
66,9 ± 6,9
34,0+ 12,2 45,6 ± 11,1
51, ] ± 13,2
56,1 ±9,3
24 ,
53,9 ± 9,9
44,0 ±12,1 32,1 ±9,6
36,7 ± 8,1 43,4 ± 6,7
30
40,8 ± 7,6
48,6 ± 14,1
23,2+11,4
26,0 ± 10,7
31,0 + 8,4
20