Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của quả cây bạch chỉ di thực ở việt nam

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

lyj

VŨ THỊ THU HƯƠNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC
DỤNG KHÁNG KHUAN c ủ a q u ả c â y b ạ c h
CHỈ DI THỰC Ở VIỆT NAM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1996 - 2001)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
PGS.TS. BẾ THỊ THUẤN
Bộ môn Dược liệu
2-5/2001
l e m
HÀ NỘI - 5 / 2001
LỜI CAM ƠN
Vói lòng kính trọng và biết ơn sâu sác nhốt, tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành tới:
PGS. TS. Bế Thị Thuẩn.
Người tháy dỡ trục tiếp huóng dân, tận tình chỉ bảo và dành rát
nhiều thòi gian giúp dỡ tôi trong suốt thòi gian thục hiện vò hoàn thành
công trình tốt nghiệp.
Tôi xin chôn thành cảm ơn TS. Chu Thị Lộc, TS. Nguyên Viết Thân,
TS.ĐỖ Ngọc Thanh và các tháy cô giáo, các cán bộ bộ môn Dược
liệu và bộ môn Vi sinh — Kháng sinh đỡ giúp đ ỡ , tạo diêu kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành dề tài tốt nghiệp.
Hà Nội ngày 15 tháng 05 nám 2001.
Sinh viên

Vũ Thị Thu Hương.
MỤC LỤC
Trang
Phần I: Đặt vấn đề 1
Phần II: Tổng quan 2
2.1 Đặc điểm thực vật 2
2.2 Trồng trọt 3
2.3 Bộ phận dùng, phương pháp thu hái, chế biến 4
2.4 Thành phần hoá học 5
2.5 Tác dụng và công dụng 6
Phần III: Thực nghiêm và kết quả 8
3.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm ' 8
3.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 9
3.2.1 Định lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ 9
3.2.2 Đặc điểm bên ngoài của quả Bạch chỉ 9
3.2.3 Thành phần hoá học 10
3.2.4 Chiết tách, phân lập định tính Coumarin 18
3.2.5 Thử tác dụng kháng khuẩn in vitro 28
Phần IV: Kết luận và nhận xét 33
Tài liệu tham khảo
34
PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học và y học hiện đại, việc sử
dụng rộng rãi các vị thuốc cổ truyền không những hoàn toàn chỉ dựa vào kinh
nghiệm dân gian, mà còn dựa trên cơ sở khoa học đã được chứng minh bằng
những thành phần hoá học và tác dụng sinh học của chúng.
Bạch chỉ là rễ đã phơi hoặc sấy khô của câv Hàng châu Bạch chỉ -
Angelica dahurica (Fisch.), Benth. et Hook, và cây Xuyên Bạch chỉ - Angelica
anomaỉa Lallem họ (Apiaceae), là vị thuốc cổ truyền được sử dụri2 làm thuốc

siảm đau, hạ sốt, chữa tràng nhạc, viêm tuyến vú, nsạt mũi, viêm mũi chảy
nước hôi, mụn nhợt chốc lở Thành phần hoá học và tác dụns sinh học của rễ
Bạch chí đã được nhiều tác 2Íả trong và ngoài nước nghiên cứu.
Ngoài bộ phận dùnơ là rễ ra, chúng tôi thấy quả Bạch chí cũng là nsuồn
nsuyên liệu rất phong phú. nhưng chưa được sử dụns rộnơ rãi. Tài liệu trons
và ngoài nước viết về quả Bạch chỉ cho tới nay hầu như còn rất hiếm. Chúng
tòi mới chỉ thấy một tài liệu duy nhất, đó là quyển "Những Coumarin và
Furocoumarin tự nhiên” của ‘viết về sự có mật của Byak-
angelicin trong quả của câv Angelica dahurica. Với mong muốn 2Óp phần tìm
nguồn nguyên liệu làm thuốc từ nhữnơ dược liệu sẵn có trong nước, chúns tôi
bước đầu tiến hành sơ bộ nghiên cứu quả cây Bạch chi di thực ở Việt Nam-với
những mục tiêu sau:
- Định tính phát hiện một số hợp chất tự nhiên.
- Định lượng thành phần hoá học chính.
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế, phân tích và sơ bộ nhận dạn2 chất phân lập
được.
- Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết quả và thành phần
hoá học chính có trong quả.
1
PHẦN II
TỔNG QUAN
2.1. Đặc điểm thực vật:
Ớ Việt Nam hiện nay chính thức có hai loài cùng cho vị thuốc Bạch chỉ
là Hàng châu Bạch chỉ - Angelica dahurica(Fisch.), Benth.et Hook, và Xuyên
Bạch chỉ- Angelica anomala Lallem họ Hoa tán Ápiaceae [9]. Cả hai loài trên
có nguồn gốc từ Tứ Xuyên - Trung Quốc, đã được di thực vào nước ta từ năm
1960. Cây Bạch chỉ thích nghi và phát triển tốt ở đồng bằng và miền núi phía
Bắc nước ta [7]. Theo Đỗ Tất Lợi [9] và Trần Thuý Nga [11], cây Hàng châu
Bạch chỉ là cây sống lâu năm, cao 1 - l,5m, đường kính thân có thể tới 2-
3cm. Thân rỗng, mặt ngoài có gờ dọc, gốc màu tím hồng, trên màu xanh lục

hoặc toàn thân xanh lục. Phía dưới thân nhẵn, không có lông, nhưng phía trên
gần cụm hoa thì có lông ngắn. Lá phía dưới to, có cuống dài, phiến lá 2-3 lần
xẻ lông chim, thuỳ hình trứng hoặc hình trứng dài, mép có răng cưa. Mặt trên
lá màu xanh lục thẫm, mặt dưới màu xanh lục nhạt. Hai mặt lá đều không có
lông nhưng trên đường gân của mặt trên có lông che chở đơn hoặc đa bào. Lá
phía trên nhỏ hơn, toàn bộ cuống lá phát triển thành bẹ bao ôm lấy thân. Bề
mặt bẹ có gờ nhỏ, không có lông.
Cụm hoa hình tán kép, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, có 1-2 lá bắc phình to
dạng túi, bề mặt lông ngắn. Mỗi tán có 22 đến 26 tán đơn, chiều dài không
đều. Cuống tán nhỏ dài. Hoa màu trắng, đều lưỡng tính, mẫu 5. Quả bế đôi,
cuống treo không có lông. Đỉnh quả có dấu vết đĩa tuyến mật và vòi nhuỵ.
Quả hình bầu dục, gốc quả lõm hình thận, 2 gờ vai nhô lên ít, rộng hơn gốc,
gờ lưng tù tròn, đầy, rộng hơn rãnh. Hai cạnh bên quả dạng cánh, mép cánh
nhăn nheo không có lông. Hạt hình trứng, đầu trên nhọn, vỏ nâu đen. Mặt
bụng hạt có đường gờ trắng đứt đoạn nối liền với cuống hạt.
2
Cây Xuyên Bạch chỉ là cây sống lâu nãm, thường cao hơn cây Hàng châu
Bạch chỉ (cây cao tới 2-3m), đường kính thân nhỏ hơn, chỉ khoảng lcm, toàn
thân màu xanh lục, phủ một lớp lông mịn. Lá có thuỳ mang cuống rõ rệt. Cụm
hoa cũng hình tán kép, nhưng mỗi tán kép mang nhiều hoa hơn, thường từ 24-
36 tán đơn. Quả có 2 gờ vai nhô hẳn lên, rộng bằng gốc quả, gờ lưng nhọn,
hẹp, nhỏ hơn rãnh. Các đặc điểm khác gần giống Hàng châu Bạch chỉ.
Ảnh 1: Cây Bạch chỉ di thực - ảnh chụp tại xã Vạn Phúc-Thanh Trì-Hà Nội.
2.2. Trồng trọt :
Theo Ngô Vân Thu [1], cây Bạch chỉ di thực được trồng ở một số tỉnh
miền Bắc nước ta hiện nay chính là Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)
Benth. et Hook.f. và Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)Benth. et Hook,
f.var.formosana (Boiss) Shan et Yuan, họ hoa tán (Apiacae). Cây mọc tốt ở cả
đồng bằng lẫn miền núi. Hạt giống thu hoạch ở cây mọc hai năm , giữ cây
giống ở vùng có khí hậu mát như Tam Đảo. Gieo hạt vào tháng 10, 11. Bạch

chỉ là cây ăn rễ sâu, cần cày sâu, bừa kỹ. Đánh luống, gieo hốc, mỗi hốc 10 -
3
15 hạt, tưới nước, vì hạt thích ẩm. Khi cây cao 20 - 30 cm thì tỉa bớt còn vài ba
cây ở mỗi hốc. Cần làm cỏ bón phân khi lá chưa phủ hết mặt luống. Nếu có
bệnh đốm đen (trên lá có đốm đen) thì hái lá đốt đi hoặc phun dịch Bordeaux.
Nếu có sâu bọ nhiều thì dùng thuốc trừ sâu để phun.
Ảnh 2: Bạch chỉ mùa thu hoạch tại xã Vạn Phúc-Thanh Trì-Hà Nội
2.3. Bộ phận dùng, phương pháp thu hái, chê biến:
Bộ phận dùng của Bạch chỉ là rễ củ của cả hai loài. Vào mùa thu, khi trời
khô ráo, đào lấy rễ, cắt bỏ thân và rễ con, rửa sạch đất, để ráo nước, cho vào lò
xông sinh một ngày đêm rồi đem phơi hoặc sấy. Khi khô xông sinh lần nữa
[ 1]. Theo sổ tay trung dược tễ [11], có thể chế biến Bạch chỉ theo phương pháp
sau: Bạch chỉ khô đã sơ chế, rửa sạch, để ráo nước, cho vào nồi nhôm hai lớp,
thêm rượu 15°, chưng cách thuỷ trong 8 giờ đến khi mềm không còn chảy
nước. Cho ra khay, sấy ở 60°-70°C cho đến khô.
Dược điển Việt Nam I tập 2 [4] và Dược điển Việt Nam II tập 3 [5] đã
mô tả về hình thái vị thuốc: rễ nguyên, ít khi phân nhánh, hình chuỳ thẳng
4
hoặc cong queo. Rễ của loài Angelica, dahurica có thiết diện gần như vuông
trong khi rễ của loài Angelica anomala có thiết diện gần tròn. Rễ dài 5-25cm,
đường kính từ 0,5 cm trở lên. Mùi thơm hắc. Đầu rễ phía trên to và còn vết
tích của thân cây, phía dướỉ thuôn nhỏ dần. Mặt ngoài màu vàng nâu có vết
tích của rễ con đã cắt bỏ, có nhiều nếp nhăn xếp thành 4 hàng dọc, nhiều bì
khổng lồi nổi lên thành những vết sần ngang. Mặt cắt ngang màu trắng đến
trắng ngà, nhiều bột, tầng sinh libe-gỗ rõ rệt là một vòng màu nâu, mỏng như
sợi chỉ. Phần vỏ có nhiều đám màu nâu là các ống tiết tinh dầu bị cắt ngang.
Rễ có thể chất cứng chắc, đầu phía trên khó bẻ, vết bẻ lởm chởm, nhiều bột.
Đặc điểm vi học của cả hai loài tương tự giống nhau. Vi phẫu rễ cắt ngang có
cậc đặc điểm: mô mềm vỏ có khuyết, nhiều ống tiết nằm chủ yếu trong phần
libe [1].

2. 4. Thành phần hoá học:
Nhiều tài liệu trong nước và nước ngoài đều công bố trong Bạch chỉ có
chất nhựa , tinh bột, tinh dầu và các dẫn chất Coumarin.
2.4.1. Tinh dầu:
Các tài liệu [1,9] đều đề cập đến sự có mặt của tinh dầu trong dược liệu,
nhưng không thấy nêụ hàm lượng cũng như thành phần của tinh dầu.Trong
sách “Những cây tinh dầu Việt nam” [8] có ghi trong tinh dầu của Xuyên
Bạch chỉ có:a-pinen. mycren, |3- xymen. Còn trong tinh dầu Hàng châu Bạch
chỉ, ngoài ba chất trên còn có: camphen, Ị3- pinen, a- phelandren, A3- caren,
a- terpinen, p- phelandren, terpinolen, 4-vinylgmicol, izoelimicin, p-elemen,
caryophylen, ligustilit, osthol.
2.4.2 Coumarin:
Đây là thành phần được nghiên cứu nhiều hơn trong các hợp chất tự
nhiên của Bạch chỉ. Theo Ngô Văn Thu [1], trong rễ Angelica dahurica có các
chất: Scopolethin, Byak-angenlicol, oxypeucedanin, Imperatorin,
isoimperatorin, phelloptenrin, Xanthotoxih, anhydrobyak-angelicin,
5
Neobyak-angelicol, Macmezin. Các tác giả Trung Quốc [17] còn công bố về
sự có măt của các chất Heptatriacontane, Bergapten, Bergaptol, Nodakenin.
Robin Witt và cộng sự [16] đã nêu phương pháp phân lập các chất Coumarin,
5,8-di (2,3-dihydroxy-3-methlbutoxyl) Psoralen từ rễ Angelica dahurica. Còn
trong Angelica anomala có Byak-angelicol, byak-angelicin, Bergapten
Umbeliferon, Anomalin, Ageomalin, Angelicontonxin và acid Angelic [6,9],
Trong quả của Angelica dahurica có byak-angelicin [19]. Theo Đàm Hương
Huyền [7], trong rễ Bạch chỉ di thực có: Tinh dầu, Coumarin, Flavonoid,
phytosterol, chất béo, trong đó Coumarin và tinh dầu là chủ yếu.
2. 5. Tác dụng và công dụng:
Theo Dược thư Trung Quốc 1998 [14], Bạch chỉ được xếp vào nhóm
thuốc giảm đau, hạ sốt, kháng khuẩn, chống viêm. Theo quan niệm của y học
cổ truyền Việt Nam thì Bạch chỉ có tác dụng phát biểu khứ phong, thẩm thấp,

hoạt huyết, bài nùng, sinh cơ, giảm đau, làm huyết trong toàn thân vận chuyển
nhanh chóng, thư gân, ra mồ hôi, dùng chữa cảm‘sốt, nhức đầu (đặc biệt vùng
trán), ngạt mũi do bị lạnh, đau răng. Dùng ngoài chữa sưng vú, tràng nhạc,
ghẻ lở, giảm đau, hút mủ [9,12].
Về tác dụng sinh học, chúng tôi ít thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng
của Bạch chỉ với tự cách là 1 vị thuốc cổ truyền mà đa số nghiên cứu về tính
chất và tác dụng của cao Bạch chỉ, các hợp chất Coumarin phân lập được từ
dược liệu. Phạm Duy Mai và cộng sự [10] đã công bố về tác dụng giảm đau
nội tạng, tác dụng kháng khuẩn rõ rệt của cao lỏng Bạch chỉ đối với các chủng
Diplococcus pneumonia, Streptococcus hemolyticus, Staphilococcus aureus,
Bacilus subtilis. Các tác giả Nhật Bản [18] đã xác định được nồng độ ức chế
tối thiểu của 5,8-di - (2,3-dihydroxy-3-methyl butoxyl) Psoralen,
Isoimperatarin, Imperatorin, Phellopterin, Byak-angelicin, Scopolethin phân
lập từ rễ
Angelica dahurica đối với các chủng Bacilus subtilis, E.coli,
Cladosporium herbarum, Aspergilus Candidas. Năm 1999, Đàm Hương
6
Huyền và cộng sự [13] đã thử một số tác dụng dược lý của nước sắc (1:1)
Bạch chỉ di thực. Kết quả cho thấy:
- Với liều 2,5g/kg, chế phẩm có tác dụng chống viêm trên chuột cống
trắng sau 24 giờ.
- Vói liều 0,3g/kg, chế phẩm có tác dụng chống đông máu trên thỏ.
- Dung dịch chế phẩm ở nồng độ 2 % trong dung dịch Ringer tim làm
giảm biên độ co bóp cơ tim ếch cô lập.
- Với liều 0,3g/kg, chế phấm gây hạ huyết áp thỏ 30 phút sau khi uống.
Ngoài ra, chế phẩm không làm thay đổi nhịp tim ếch tại chỗ, không gây
giãn cơ trơn mạch máu tai thỏ cô lập và dung dịch chế phẩm ở nồng độ 0,1%
trong dung dịch Tyrode không ảnh hưởng đến nhu động ruột thỏ.
Đối với quả Bạch chỉ, ngoài tài liệu [19] ra cho đến nay chúng tôi chưa
thấy tài liệu nào công bố về thành phần hoá học cũng như về tác dụng và công

dụng của nó. Một số địa phương ở miền Bắc Việt Nam, người ta vẫn dùng quả
Bạch chỉ để làm thuốc chống viêm, nhất là bệnh viêm mũi, viêm xoang theo
kinh nghiệm dân gian.
7
PHẨN III.
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.
%
3.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm:
3.1.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu nghiên cứu là quả già đã được phơi khô của cây Bạch chỉ di
thực thu hái tại xã Vạn Phúc, huyện Thanh Trì, Hà Nội vào tháng 7 năm 1999.
3.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
* Lấy mẫu mô tả quả của cây Bạch chỉ.
* Nghiên cứu về hoá học.
• Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
• Định tính các nhóm chất tự nhiên bằng các phản ứng hoá học.
• Định tính Coumarin bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với bản mỏng
silicagel GF254 của hãng Merck.
• Chiết xuất phân lập và tinh chế Coumarin bằng những phương pháp
kinh điển ghi trong các tài liệu.
• Độ chảy các chất được đo trên máy GallenKamP ( UK ) tại phòng thí
nghiệm trung tâm - Trường Đại Học Dược Hà Nội.
• Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy UV-VIS. Spectrophotometer cary IE-
varian (Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học
Dược Hà nội
• Đo phổ hổng ngoại (IR) trên máy 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng
thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà nội.
• Độ ẩm của dược liệu đo trên máy Satorius tại phòng thí nghiệm trung
tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội.
• Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm in vitro tại Bộ môn

vi sinh-kháng sinh trường Đại học Dược Hà nội.
8
3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
3.2.1. Đinh lương tinh dầu trong quả Bạch chỉ [2]:
Cân 20 g dược liệu, cho vào bình cầu cổ mài dung tích 500 ml. Thêm
200 ml nước cất. Lắp dụng cụ. Đun trực tiếp trên bếp điện (qua lưới amiang)
trong 2 giờ. Ngừng cất. Tháo dụng cụ. Lấy riêng phần ống hứng tinh dầu, điều
chỉnh cho tinh dầu vào phần chia vạch. Đọc thể tích tinh dầu và tính kết quả.
Hàm lượng tinh dầu trong được liệu được tính theo công thức:
ỵo/ - ^xlQQ _ Kx 10000
a ~ 2000 - 20 X A/
Trong đó: X : Hẳm lượng tinh dầu (%).
V: Thể tích tinh dầu (ml).
M: Hàm ẩm dược liệu (12,4%).
Ik Z.
Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ khô tuyệt đối là
1,56% (Bảng 1).
Bảng 1: Hàm lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ.
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Lượng dược liệu (g)
20,00
20,00 20,00
Thể tích tinh dầu (ml)
0,28
0,25
0,29
Hàm lượng tinh dầu (%)
1,60
1,43 1,66
Trung bình (%)

1,56
3.2.2. Đặc điểm bên ngoài của quả Bạch chỉ:
Quả bế đôi, cuống treo không có lông. Đỉnh quả có dấu vết đĩa tuyến
mật và vòi nhuỵ. Quả hình bầu dục, gốc quả lõm hình thận, hai gờ vai nhô lên
9
/
ít, rộng hơn gốc, gờ lưng tù, tròn, đầy, rộng hơn rãnh. Hai cạnh bên quả dạng
cánh, mép cánlì nhăn nheo không có lông. Hạt hình trứng, đầu trên nhọn, vỏ
mầu nâu đen, mật bụng hạt có đường gò' trắng, đút đoạn nối liền với cuống
hạt.
Ánh 3: Quả của cây Bạch chỉ di thực.
Đối chiếu với những đặc điểm của quả Bạch chỉ được mô lá trong các
tài liệu [3,7,9], chúng tôi thấy mẫu quả nghiên cứu của chúng tồi có những
đặc điểm giống quả của cây Hàng châu Bạch chỉ Angelica dahurica
(Fisch.),Benth. et Hooli.
3.2.3. Thành phần hoá học:
* Định tính l sô nhóm chất tự nhiên trong dược liệu bằng các phản
úng hoá hục. [1,2,6].
♦> Định tính Phytosterol :
10
cắn bằng 0,5ml anhydrid acetic, lắc đều. Đặt nghiêng ống 45°, cho thêm 0,5
ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Mặt phân cách giữa 2 lớp chất
lỏng xuất hiện vòng nâu đỏ. (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Phytosterol.
♦> Định tính Glycosid tim :
Cho 10 g bột dược liệu vào 1 bình nón có dung tích 100ml. Thêm 80ml
cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng 24h, gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp
bằng 1 lượng chì acetat 30% có dư. Lọc bỏ tủa. Dịch lọc sau khi bay hơi hết
cồn được cho vào bình gạn, lặc kĩ 2 lần với cloroform, mỗi lần 15ml. Gạn dịch
Cloroform vào 1 cốc có mỏ. Bay hơi dung môi. Hoà tan cắn bằng 10ml cồn

90°. Dịch cồn làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng Liberman-Bouchardat:
Lấy lml dịch chiết cồn, thêm vài giọt acid acetic và 2ml hỗn hợp
anhydrid acetic: acid sulfuric (50:1),trộn đều. Không thấy sự thay đổi màu từ
hồng đến xanh lá (phản ứng âm tính).
• Phản ứng Baliet:
Lấy lml dịch chiết cồn, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch
acid picric ỉ % trong cồn và 9 phần dung dịch NaOH 10%) không thấy xuất
hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính).
• Phản ứng legal:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn, thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1%,
thêm từ từ vài giọt dung dịch Natri hydroxid 10% (bảo đảm kiềm dư). Có xuất
hiện mầu đỏ (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Glycosid tim thuộc nhóm
Cardenolid.
♦> Định tính Tanin :
11
Cho vào ốns nghiệm to lg dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực tiếp
trên bếp điện trong vài phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc để làm
các phản ứng định tính:
• Phản ứng với thuốc thử sát (III) clorid 5%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử thấy xuất hiện
màu xanh đen (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với dung dich Gelatin 1%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử không thấy
xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Tanin.
♦> Định tính Saponin :
Cho vào ống nghiệm to lg dược liệu, thêm 10ml cồn 70°, đun cách thuỷ
3 phút, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc để làm phản ứng định tính.

• Quan sát hiên tương tao bot:
Cho lml dịch chiết cồn vào 1 ống nghiệm, thêm 5ml nước cất, lắc mạnh
trong 30 giây, xuất hiện cột bọt cao khoảng lcm, nhưng không bền.
(phản ứng âm tính).
• Quan sát hiên tương phá huyết:
Cho lml dịch chiết cồn vào 1 ống nghiệm, bay hơi cách thuỷ cho hết cồn
thêm 1 ml dung dịch Natriclorid 0,9%, lắc đều. Nhỏ 1 giọt dung dịch máu bò
2% đã loại fibrin pha trong dung dịch Natriclorid 0,9%. Để yên trong 2 giờ.
Dung dịch trong ống có màu hồng nhạt, đáy có hồng cầu lắng, khi lắc vẩn
đục, chứng tỏ không có hiện tượng phá huyết.
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Saponin.
❖ Định tính acid hữu cơ :
Cho vào 1 ống nghiệm to 0,5g dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực
tiếp trên bếp điện 3 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thêm 1 ít bột
Natricarbonat. Thấy xuất hiện bọt khí (phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có acid hữu cơ.
12
♦♦♦ Định tính chất béo và Caroten:
Cho vào bình cầu Ig dược liệu, thêm 10ml ether dầu hoả, đun hồi lưu
cách thuỷ trong 30 phút, lọc. Dịch lọc cho vào hai ống nghiệm nhỏ, khô mỗi
ống lml dịch lọc. Bốc hơi dung môi và làm các phản ứng định tính:
• Đinh tính chất béo:
Hoà tan cắn bằng 0,5ml cloroform, nhỏ 2 giọt lên tờ giấy lọc, hơ nóng
nhẹ đến khô thấy có vết mờ trên giấy, (phản ứng .dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có chất béo.
• Đinh tính Caroten:
Cho vào cắn 2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh nâu (phản
ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Caroten.
♦♦♦ Định tính đường khử và acid amin :

Cho vào ống nghiệm to 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 50°, đun trên nồi
cách thuỷ sôi trong 5 phút, lọc. Dịch lọc để làm các phản ứng định tính:
• Đinh tính đường khử:
Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử fehling A, 2
giọt thuốc thử fehling B, lắc, không thấy xuất hiện màu đỏ nâu (phản ứng âm
tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có đường khử.
• Đinh tính acid amin:
Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin
2%, lắc kỹ, rồi đun trên nổi cách thuỷ sôi trong vài phút, không thấy xuất hiện
màu xanh tím (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Acid amin.
❖ Định tính Flavonoid :
Cho vào 1 bình cầu 3g dược liệu, đun hồi lưu cách thủy với 20ml cồn 70°
trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc. Bay hơi dung môi, hoà tan cắn bằng 10ml
13
nước nóng, để nguội, dịch chiết được lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 15ml.
Phần nước còn lại sau khi lắc được cô tới cạn, hoà tan cắn bằng 5ml cồn 70°
để làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ nóng nhẹ đến khô, hơ lên miệng
lọ đựng amoniac đặc, thấy màu vàng tăng lên rõ rệt.
• Phàn ứng với dung dich sắt (IIĨ) clorid:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III)
clorid 5%, thấy xuất hiện mầu xanh đen.
• Phản ứng Cyanỉdin:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại, vài
giọt dung dịch acid clohydric đặc, đun cách thuỷ vài phút, thấy mầu dịch chiết
không thay đổi.
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Flavonoid.

♦> Định tính Coumarin :
Cho vào bình cầu lg dược liệu, thêm 5ml cồn 90°, đun cách thủy trong 3
- 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được để làm các phản ứng sau:
• Phản ứng mở và đổng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ông lml dịch chiết.
- ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% .
- ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội.
9
Quan sát: Ong 1 :có tủa đục.
ss'
Ong 2: trong.
Thêm vào cả hai ốhg nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều.
Quan sát: ống 1: trong suốt.
ống 2: có tủa đục.
14
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt acid clohydric, ống 1 trở lại đục như ống 2.
(Phản ứne dương tính).
• Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vào đó 2 giọt dung dịch
NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Giỏ vài giọt thuốc thử Diazo,
thấy xuất hiện màu đỏ gạch. (Phản ứng dương tính).
• Huỳnh quang dưới ánh sáng từ ngoai tăng lên ở môi trường kiềm:
Giỏ vài giọt dịch chiết lên 1 miếng giấy lọc, giỏ tiếp lên đó vài giọt Natri
hydroxid 5%, sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng
một đồng xu, rồi chiếu tia tủ ngoại trong một vài phút. Bỏ đổng xu ra, quan sát
tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: Phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn
phần bị che. Tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên bằng phần
không bị che. ( Phản ứng dương tính ).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Coumarin.

♦♦♦ Định tính Ảlcaloid :
Cho 2g dược liệu vào 1 bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung
dịch amoniac, để yên trong 30’. Thêm 30ml cloroform để qua đêm. Dịch chiết
lọc qua giấy lọc vào 1 bình gạn, lắc với 10ml acid sulfuric 10%. Gạn lớp acid
làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử
Dragendorff, lắc kỹ, không thấy xuất hiện tủa màu vàng cam (phản ứng âm
tính).
• Phản ứng với thuốc thử Mayer:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Mayer, lắc,
không thấy xuất hiện tủa trắng hơi vàng (phản ứng âm tính).
15
• Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat.
Không thấy xuất hiện tủa màu nâu. (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Alcaloid.
Nhân xét và sơ bỏ kết luân:
- Các phản ứng: với thuốc thử Legal trong định tính Glycosid tim, với
kiềm trong định tính Flavonoid, với dung dịch sắt (III) clorid trong định tính
Flavonoid và Tanin đều dương tính, song chúng tồi vẫn sơ bộ kết luận không
, có những hợp chất này trong dược liệu,vì những phản ứng đặc trưng của chúng
âm tính.
- Qua kết quả của các phản ứng hoá học đặc trưng cho từng nhóm chất
trên đây, chúng tôi sơ bộ kết luận trong quả bạch chỉ có Coumarin,
Phytosterol, chất béo, Caroten, acid hữu cơ, trong đó có thể coi Coumarin là
thành phần hoá học chính.Không có: Flavonoid, Glycosid tim, Saponin, Tanin,
alcaloid, acid amin, đường khử.
Kết quả được ghi ở bảng 2:
16

Bảng 2 : Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên trong Quả bach chỉ
Hợp chất
Các phản ứng định tính
Kết qủa
Kết luận
Phytosterol Phản ứng với HoS04 đặc
++
Có
Glycosid
Phản ứng Baljet
-
tim Phản ứng Legal
++
Phản ứng Liberman-Bouchardat
-
Không có
Alcaloid
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
-
Phản ứng với thuốc thử Mayer
-
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
-
Không có
Tanin
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%
+
Phản ứng với dung dịch gelatin 1 %
-
Không có

Acid hữu cơ
Phản ứng với Na2C03
+
Có
Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
-
Không có
Quan sát hiện tượng phá huyết
-
Không có
Chất béo
Vết dầu để lại trên giấy lọc
+
Có
Caroten Phản ứng với H2S04 đặc
+
Có
Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling
-
Không có
Acid amin
Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin
-
Không có
Flavonoid
Phản ứng với kiềm
++
Phản ứng với dung dịch FeCl-Ị 5% ++
Phản ứng Cyanidin

-
Không có
Coumarin Phán ứng mở và đóng vòng ỉacton
+++
Phản ứng ghép đôi với muối Diazoni
+++
Hiện tượng huỳnh quang tăng lên khi cho
+++
tác dụng với kiềm và ánh sáng u v
Có
Ghi chú : ( - Phản ứng âm tính.
(+): Phản ứng dương tính
(++): Phản ứng rõ.
(+++): Phản ứng rất rõ.
3.2.4. Chiết tách, phân lập định tính Coumarin trong quả Bạch chỉ:
* Định tính Coumarin toàn phần bằng SKLM [1,6 ]:
Kết quả của những phản ứng hoá học cho chúng tôi thấy trong dịch
chiết cồn của quả Bạch chỉ có Coumarin là thành phần hoá học chính. Để sơ
bộ xác định thành phần Coumarin trong dịch chiết, chúng tôi dùng SKLM với
bản mỏng Silicagel tráng sẵn và khai triển sắc ký trong 3 hệ dung môi:
Hệ I: Cloroform : Methanol [9 : 1]
Hệ II: Cloroform : Ethyl acetat [1 : 1]
Hệ III: Ethyl acetat : Methanol : Nước [70 : 15 : 15]
Bản sắc ký sau khi khai triển được cho ra để bay hết dung môi. Quan sát
các vết trên sắc ký trong ánh sáng thường, bằng huỳnh quang dưới ánh sáng tử
ngoại ỞX = 366nm , hiện màu bằng thuốc thử Diazo và hơi lot.
Kết quả cho thấy cả 3 hệ dung môi đều tách tốt, trong đó hệ 1 là tốt hơn
cả. Chúng tôi sử dụng hệ dung môi này trong quá trình định tính và kiểm tra
độ tinh khiết của các chất phân lập được sau này.,
Dưới ánh sáng tử ngoại, trên sắc ký đồ SKLM có số vết là 8, trong đó có 6

vết đậm ( vết 1,3,4,6,7,8 ) và 2 vết mờ ( vết 2,5 ). Với thuốc thử Diazo và hơi
lot, vết 4 và 7 hiện màu rõ và đậm ( hình I, bảng 3 ).
18
Hình I: sắc ký đồ SKLM định tính Coumarin trong quả Bạch chỉ
Hệ dung môi: Cloroform : Methanol [9:1]
19
Bảng 3: Giá trị Rf và màu sác các vết coumarin trong quả bạch chỉ
trên sắc ký lớp mỏng một clìiều.Hệ dung môi Cloroform:Methanol [9:1]:
Vết RfxlOO
Màu sắc các vết
chất
Hệ
DM 1
Hệ
DM 2
Hệ
DM 3
Ánh sáng
thường
u v
Ằ = 366nm
TT Diazo
Hơi iod
8 89.65 72.41 83.90 Không màu
Tím Hơi vàng
Vàng
7 83.90 85.05 77.01
Không màu
Vàng
Đỏ

Nâu
6
74.71 66.66 51.72 Không màu
Tím
Hơi vàmg
Hơi nâu
5
54.74 40.22 33.33 Không màu Xanh nhạt
Không màu
Không màu
4 48.27 57.47 58.62 Không màu
Vàng
Đỏ đậm
Nâu đậm
3 42.52
80.45 70.11 Không màu Xanh sáng
Không màu
Không màu
2
26.43 48.27 21.83 Không màu Tím nhạt Hơi vàng
Vàng
1 9.19
24.13 44.82
Không màu Xanh sáng Không màu
Không màu
20
Với kết quả thu được trên đây bằng SKLM, chúng tôi không nghĩ rằng
tất cả những vết chất phát quang dưới ánh sáng tử ngoại X = 366 nm đều là dẫn
chất Coumarin và những vết chất không cho mầu, hoặc cường độ mầu yếu với
thuốc thử hiện màu đều không phải là Coumarin, vì đây mới chỉ là định tính

sơ bộ với dịch chiết chưa qua giai đoạn tinh chế, nhưng chúng tôi có thể khẳng
định chắc chắn rằng: Trong dịch chiết cồn của quả Bạch chỉ có Coumarin hàm
lượng tương đối cao và có thành phần phong phú.
♦> Chiết tách và phân lập định tính Coumarin:
Để chiết xuất Coumarin từ quả Bậch chỉ khô, chúng tôi sử dụng phương
pháp chiết nóng với dung môi là Ethanol 90°.
Cho 100 g dược liệu khô vào bình cầu có ống sinh hàn hồi lưu, thêm
dung môi ngập dược liệu, đun hồi lưu cách thủy trong 3 giờ. Rút dịch chiết 1,
bã dược liệu được chiết lại 2 lần nữa. Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay
dưới áp lực giảm, dịch chiết đậm đặc đem cô cách thủy cho hết cồn, thêm
nước, hoà tan cao trên nồi cách thúy sôi, lọc nóng vào bình gạn, lắc nhiều lần
với ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết không màu với thuốc thử Diazo. Gộp
dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cặn được sấy khô bằng Silicagel trong bình
hút ẩm. Thu được 2,30 g Coumarin thô ( Phân đoạn I ) .
Phần nước còn lại sau khi bay hơi hết dung môi lại cho vào bình gạn lắc
nhiều lần với Cloroform cho đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc
thử Diazo nữa. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung mồi, cắn được sấy khô bằng
Silicagel trong bình hút ẩm, thu được 4,63g Coumarin thô ( Phân đoạn II).
Qui trình chiết xuất và phân lập Coumarin được tóm tắt trên sơ đồ 1:
21
Sơ đồ 1: Sơ độ chiết xuất, phân lập Coumarin trong quả Bạch chỉ.
Bằng SKLM một chiều, so với dịch chiết Coumarin toàn phần trên hệ
dung môi Cloroform : Methanol [9 : 1 ], kết quả cho thấy:
Phân đoạn I chỉ cho 1 vết tương ứng với vết số 7 ở dịch chiết Coumarin
toàn phần cả về giá trị Rf và màu sắc.
Phân đoạn II cho 2 vết, tương ứng với các vết 4,5 ở dịch chiết Coumarin
toàn phần.( hình II ).
22