Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng aminazin trong huyết tương bằng huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN THỊ MINH NGHĨA
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
■
ĐỈNH LƯỢNG AMINAZIN TRONG HUYẾT TUƠNG
ĩ ■
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO
■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHOÁ 2002-2006)
Người hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh
DS. Nguyễn Trung Nghĩa
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích và độc chất
Phòng thí nghiệp Trung tâm
Thời gian thực hiện : Từ tháng 3.2006 đến tháng 5.2006
HÀ NỘI, THÁNG 5-2006 \
[f l ' ■■■■

£ Ờ 3 ^ ũ J j l L Ơ n i
Çî^miq. th ồ i gian, Utựe. kiịiL OỈL hơàn. tíứ u th Luận oAm. ữề đầ tà i:
"QlạhiẰTL eứu xAụ. diỷnụ. phuổnạ. p jtá ft địn h lườttg. amÌMoxẦM trmtq, tujujA
tường, íĩằttạ. sẮa UẠ lấttạ. lùẲtí nÚMjạ. ea&". ^ ò i đ ă nhận ituổíi n i ạiúp, it&
qẮãẠ l%án eủxL eÓA ỉhẰ ụ, eầ ạiáiờ^ OỈL eÓA e ú tt lĩở tnjù*L hjơÁ fdtcuL tíelLf
phồng, iiú, nạhiỀm. trunạ. lăm. Irưềtvạ, ^ ạ i hjMt (Dưổe. 'Jôà. Qljệi,
Çîôi XÙL l%àụ. ỈẢ Lànụ. lù â ổn. eh âtt thòutli ixà iAu. iẨe. tê i ÇîhS.
OtqẨiựỈM. Ç îk i 3CiỀu cÂnh nựưồi đã trưe. tíjỂft hẮÌấnụ, íiẪ n lỉÁ ạ iú ft lồ i
tmng, suiết qầiá trình. UuỊe. hiện, đề, tà i.
^ ồ l xin. ehân th ành eảnt ổ*t eÓA thầụ. eầ gẦAớ^, eáe. eán í%ặ tm mỗ*L
hũá. fih â jt tíeh, pUồtvạ. th í nạhiỀm. ừ ^ tạ . lăm, đ ă tọLờ^ ntọi đ tề ti UiệếL thuậtL
lờ i đì. l&i hjôỉuL th àn h khữá. lu ận.

Ç îù i e ũ n ự , dàn. ạ ử i lồ i ítả m ổ ^t đỂ n eAe. ih ầ ụ . eê^ QÌájô^f eán- e á r t íỉẠ
tớỉui tễ^ttònq, đ ã lận. tình. gẦAttg. tLạự,f ụiúp. đễ^ tề i ÌM^Àỳng, qxtú, trin ft hờ4í tậfL
tạ i trưềnjạ
QUkùn. dịfL nàụ. tồ i eũnạ. æÙL ạử i ÍM, eám. ổtt tề i tùàếL thê. luỊtí lĩề,
¿tầtiạ. ẽiạhiỀệi ÜÁ n hữ ttạ nụưồi tkản i. đ ã giáp, đs^ đmiạ, úiỈM. tồ i ữế ntợi tn ặ l
qxiá. tífinh kjỢ^ tậfL ữà L àn t k h ô ú . lu ậ n , i ụ i tr ư è n g , ^ ẹ ù k ạ tt nữ ưốíi '3ÔCL
Q lệ í.
'Jôà Qtội, nụăụ. 15 IhÓLttg, 5 năm 200Ó
'3ôtư>, tù Ế ềt
^tần Q’hi /Hình OlạỉũíL
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng số liệu
Danh mục các hình
Đặt vấn đề
Phần I. Tổng quan 3
1.1- Tổng quan về Clorpromazin (CPZ)
3
1.1.1- Công thức hoá học 3
1.1.2- Tên khoa học 3
1.1.3- Tính chất 3
1.1.4- Dược lý và cơ chế tác dụng 3
1.1.5- Dược động học 4
1.1.6-Chỉ định 4
1.1.7- Chống chỉ định 5
1.1.8- Thận trọng 5
1.1.9- Liều dùng và cách dùng 5
1.1.10-Các dạng bào chế 6
1.1.11. Các phương pháp định lượng 6
1.2- Tổng quan về HPLC 7
1.2.1- Khái niệm 7

1.2.2- Sắc ký phân bố pha đặc 7
1.2.3-Kỹ thuật HPLC 8
1.2.4- Hệ thống máy HPLC ỉ 0
1.2.5- Các phương pháp định lượng bằng HPLC 10
1.3- Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ bằng HPLC

12
MỤC LỤC
1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học

14
1.4.1- Khái niệm 14
1.4.2- Nội dung thẩm định 14
Phần n . Điều kiện thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

17
2.1- Điều kiện thực nghiệm 17
2.2- Nội dung và phương pháp nghiên cứu

18
2.2.1- Chuẩn bị mẫu 18
22.2- Khảo sát và tìm điều kiện chiết CPZ trong huyết tương
19
2.2.3- Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 21
2.2.4- Thẩm định phương pháp phân tích 21
Phần in . Kết quả thực nghiệm và bàn luận 24
3.1- Xây dựng phương pháp định lượng 24
3.1.1- Khảo sát tìm điều kiện để chiết CPZIHT 24
3.1.2- Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký 26
3.1.3- Thẩm định phương pháp phân tích 32

3.2- Bàn luận 39
Phần IV. Kết luận và đề xuất 43
4.1- Kết luận 43
4.2- Đề xuất 44
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
DANH MỤC CÁC CHỮ VIÊT TẮT
CPZ
: Clorpromazin
CBZ
: Carbamazepin
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HT : Huyết tương
IS
: Chất chuân nội ( intemai Standard)
l^g
; Microgam
|Lim
: Micromet
1^1
: Microlit
MeCN
: Acetonitril
MeOH
: Methanol
PA
: Tinh khiết phân tích
STT
: Số thứ tự

SK
: Sắc ký
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Nội dung Trang
1
Một số nghiên cứu định lượng CPZ bằng HPLC
13
2
Danh mục hoá chất, chất chuẩn, thuốc thử 18
3
Kết quả khảo sự phù hợp của hệ thống sắc ký
31
4
Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
34
5
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
36
6
Kết quả khảo sát độ tái lặp
36
7
Kết khảo sát độ đúng
37
8
Kết quả khảo sát độ ổn định trong thời gian phân tích
38
9
Kết qủa khảo sát độ ổn định trong thòi gian bảo quản

39
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Hình Nội dung Trang
1 2.1 Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương 20
2 3.1
Sắc đồ lựa chọn điều kiện chiết CPZ trong huyết
tưcỉng
25
3 3.2
Sắc đồ khảo sát cột sắc ký cho phân tích CPZ trong
huyết tương
27
4
3.3
Sắc đồ lựa chọn dung môi pha động
28
5
3.4
Phổ hấp thụ u v của CPZ trong dung môi pha động
29
6 3.5
Sắc đồ khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội
30
7
3.6
Sắc đồ khảo sát tính chọn lọc của phương pháp
33
8
3.7
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích

CPZ/CBZ và nồng độ CPZ trong huyết tương
35
ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay, trong điều trị bệnh tâm thần ở nước ta, chỉ định liều dùng chủ
yếu dựa vào sự đáp ứng của thuốc với người bệnh và các triệu chứng trên lâm
sàng, kinh nghiệm điều trị của bác sỹ.
Biệt dược "Aminazin" có hoạt chất là Clorpromazin hydroclorid là một
dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra còn có
tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin. Cũng như
các thuốc hướng thần khác, Clorpromazin có cơ chế tác dụng phức tạp hay gặp
trường hợp ngộ độc thuốc, hcfn nữa trong thực tế điều trị các thể thường thể
hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với
thuốc. Vì vậy phải theo dõi sát sao trong quá trình điều trị. Để đạt được kết
quả tốt và hạn chế những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi
bệnh nhân một liều điều trị phù hợp, cần phải theo dõi thường xuyên nồng độ
thuốc trong máu bệnh nhân.
Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong
dịch sinh học là sắc ký lỏng hiệu năng cao^HPLQ, sắc ký khí, sắc ký khí gắn
vói khối phổ, điện di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo
vói detector u v là phương pháp hay được dùng hơn cả do tính ưu việc nổi trội
về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế.
Để có một quy trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc
trong dịch sinh học, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như: cột;
dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng, quy trình xử lý mẫu, khoảng
nồng độ khảo sát,
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminaùn trong
huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao"
Với muc tiêu:
- Xây dựng điều kiện phân tích thích hợp để định lượng Aminazin trong

huyết tương với quy trình chiết cho hiệu suất cao, quy trình sắc ký, khả năng
tách, định tính và định lượng đồng thời loại phần lớn tạp cản trở trong
mẫu phân tích.
- Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng, từ đó đề ra quy trình
phân tích thường quy để định lượng Aminazin trong huyết tương.
Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở ứng
dụng để xác định và đánh giá tương đưofng sinh dược học của Aminazin.
PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1- Tổng quan vê Clorpromazin (CPZ)
Biệt dược Aminazin có hoạt chất là Clorpromazin dùng dưói dạng muối:
Clorpromazin hydroclorid.
1.1.1- Công thức hoá học: [2][3][6]
- Công thức phân tử: C17H19CIN2S. HCl; M = 355,5.
- Công thức cấu tạo: 0 1-|,
.HCl
1.1.2- Tên khoa học: [3][6]
2-Cloro - 10 - (3- Dimethylamino propyl) -phenothiazin hydroclorid.
1.1.3- Tính ctó;[3][6]
Bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà, dễ hút ẩm, bị phân hủy khi tiếp xúc
với ánh sáng, không khí. Rất dễ tan trong nước (1:1), tan trong ethanol,
loroform, không tan trong ether. Nóng chảy ở khoảng 196°c. Hấp thụ ư v
cho 2 cực đại ở 254 và 306 nm.
1.1.4- Dược lý và cơ chế tác dụng: [2] [6]
Clorpromazin là dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng
thần, ngoài ra thuốc có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng
serotonin.
* Trên thẩn kinh trung ương.
- Tác dụng chính là an thần, chống rối loạn tâm thần thể hưng cảm, làm
giảm hoang tưởng ảo giác thao cuồng, vật vã, làm mất các ý nghĩ kỳ lạ, tạo cảm
giác an dịu, lãnh đạm thờ ơ với ngoại cảnh và ức chế các phản xạ có điều kiện.

- Các tác dụng khác trên thần kinh trung ương:
+Gây hạ thân nhiệt do ức chế trung tâm điều nhiệt
+ Chống nôn.
+ Gây hội chứng ngoại tháp khi dùng liều cao.
*Trên Thần kinh thực vật:
- Giãn mạch ngoại vi và hạ huyết áp.
- Giãn đồng tử, táo bón, giảm tiết dịch, khô miệng, khô da, bí tiểu tiện.
* Trên hệ tuần hoàn:
- Chậm nhịp tim, giãn mạch, hạ huyết áp.
* Còn có tác dụng trên hệ nội tiết, kháng hỉstamin.
1.1.5- Dược động học: [2] [8]
Thuốc hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hoá. Thuốc đạt nồng độ tối đa
(Qax) trong máu sau khi uống 2-4 giờ. Thuốc liên kết 95-98% với protein
huyết tương. Thuốc được chuyển hoá nhiều ở gan và bài tiết qua nước tiểu và
mật ở dạng các chất chuyển hoá có và không có hoạt tính. Thời gian bán thải
(ti/2) khoảng 30 giờ. Thuốc được phân bố rộng rãi trong cơ thể qua được hàng
rào máu não và đạt được nồng độ trong não cao hcm trong huyết tưoỉng. CPZ
và các chất chuyển hoá cũng qua hàng rào nhau thai và sữa mẹ.
1.1.6- Chỉ định: [2][6]
- Điều tri tâm thần phân liệt các thể, giai đoạn hưng cảm của tâm thần
lưỡng cực
-Qiống nôn
- Chống nấc
-Tiền mê
-Bệnh uốn ván(điều trị hỗ trợ)
1.1.7 Chống chỉ định [2]
- Ngộ độc thuốc ức chế thần kinh trung ưoỉng: rượu, thuốc ngủ, opiat.
- Có tiền sử giảm bạch cầu hạt, rối loạn tạo máu, nhược cơ.
1.1.8- Thận trọng: [2]
- Người bệnh suy tim và suy tuần hoàn có nguy cơ đặc biệt bị các phản

ứng không mong muốn của thuốc và cần hết sức thận trọng khi sử dụng thuốc
CPZ cho những người có nguy cơ loạn nhịp.
- Ngưòi bị sơ cứng động mạch, bệnh gan, bệnh thận, co cứng và động
kinh cũng dễ bị các tác dụng có hại của thuốc.
- Đối với người cao tuổi phải giảm liều do có nguy cơ cao với các tác
dụng không mong muốn, thường chỉ dùng liều bằng 1/4 đến 1/2 liều người
trưởng thành.
- Các thuốc có tác dụng kháng cholinergic, đặc biệt có nguy cơ cao gây
tác dụng có hại đối với hệ thần kinh trung ương ở ngưòi bệnh sa sút trí tuệ và
người có tổn thương não.
1.1.9-Liều dùng và cách dùng: [2]
- Liều lượng thuốc thay đổi tuỳ theo người bệnh và theo mục đích điều tĩỊ.
- Clorpromazin không được tiêm dưói da vì gây hoại tử mô nặng.
- Tiêm bắp pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,9%.
- Liều lượng và hàm lượng thuốc tính theo Clorpromazin base.
+ Điều trị bệnh loại tâm thần:
- Người lófn: uống 10-25mg/lần - 2-4 lần /ngày.
- Với viên nang giải phóng chậm 30-300mg; 1-3 lần/ngày.
- Tiêm bắp khi có những rối loại nặng, bắt đầu từ 25-50mg, có thể tiêm
nhắc lại trong 1 giờ và sau đó cách 3-12 giờ tiêm một lần, có thể tăng liều nếu
cần.
- Liều tối đa: Ig/ngày (đôi khi có thể tăng dần tới 2g trên ngày hoặc hcm
trong thời gian ngắn).
- Trẻ em 6 tháng tuổi trở lên: 0,55mg/kg cân nặng /llần, uống cách 4-6
giờ hoặc tiêm bắp cách 6-8 giờ.
+ Điều trị buồn nôn và nôn:
Người lớn 10 - 25mg X 4 lần/ ngày nếu cần.
Trẻ em: tính theo cân nặng. Từ 6 tháng tuổi trở lên: 0,55mg/kg thể
trọng X 4 - 6 lẩn/ngày.
+ An thần trước phẫu thuật:

Người lớn: 25 - 50mg; 2-3 giờ trước phẫu thuật.
Trẻ em: 0,55mg/kg thể trọng; 2-3 giờ trước phẫu thuật.
+ Điều trị nấc.
+ Điều trị uốn ván.
+ Điều trị rối loại chuyển hoá porphyrin.
1.1.10- Các dạng bào chế:
Viên nén 10, 25, 50,100, 200mg.
Viên nang tác dụng kéo dài: 30, 75,150, 200, 300mg.
Sirô 10, 25, 100mg/5ml.
Thuốc đạn 25, lOOmg.
1.1.11- Các phương pháp định lượng: [6][9]
Clorpromazin hydroclorid là muối của các base được định lượng bằng
các phương pháp.
* Đối vói nguyên liệu
+ Phương pháp acid - base trong dung môi là acid acetic khan; dung dịch
chuẩn là HCIO4 0,1M phát hiện điểm tương đương bằng đo điện thế hoặc chỉ
thị màu [5] [9]
+ Phương pháp acid base trong dung môi ethanol 96%; dung dịch chuẩn
NaOH 0,1M pha trong nước hoặc ethanol; phát hiện điểm tương đương, đo
điện thế [5] [9]
* Đối với các chê phẩm có chứa Clorpromazỉn
+ Phương pháp quang phổ UV: [9] [11] [15]
Chế phẩm được chiết và pha loãng bằng acid clohydic 0,1M để được
nồng độ 50 |ag/ml. Đo độ hấp thụ ư v ở bước sóng 254nm. Tính kết quả dựa
vào A (l%,lcm) ở 254 là 915
+ Phương pháp HPLC [10]
Cột Cj8 (250 X 2,lmm; 3|Lim)
Pha động: (Natri acetat; iriethylamin; nước tỷ lệ 3,402^; 2m l: 970ml) và
MeCN : MeOH tỷ lệ 600 : 200 : 180
Luu lượng dòng là Iml/ phút

Bước sóng: 254nm
Chuẩn nội: methyl paraben, propyl paraben
* Đối vái dịch sinh học: thường dùng phương pháp HPLC, sắc ký khí,
điện di mao quản
1.2- Tổng quan về HPLC:
1.2.1-Khái niệm: [4][6]
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp. HPLC là
kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tích các chất trên 1 pha tĩnh
chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Pha
tĩnh có thể là chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên bề mặt
1 chất mang rắn đã được liên kết hoá học với 1 chất hữu cơ. Quá trình sắc ký
xảy ra theo cơ chế: hấp thụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử.
- Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký
khác nhau. Với khuôn khổ của khoá luận này chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký
phân bố pha đảo.
1.2.2- Sắc ký phân bố pha đảo:
Sắc ký phân bố gồm có: sắc ký lỏng - lỏng.
Sắc ký pha liên kết
Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang
tạo nên dẫn chất Siloxan.
CH.
CHq
ỢH3 CH^
- Si - OH + Cl - Si - R
- Si - o - Si - R + HCl
CH3
Nhóm Silanol
của Silicagen
CH3
Dẫn chất

clorosilan
CH.
CH,
Dãn chất
siloxan
- Và R là nhóm ít phân cực như:
+ Octyl (Cg), Octadecyl (Cig), phenyl. Dung môi phân cực như:
methanol; acetonitril thì ta có sắc ký pha đảo.
Trong sắc ký pha đảo: Các chất phân cực ra trước.
Các chất ít phân cực và không phân cực ra sau.
- Quyết định của sự tách các chất là tổng hợp các tương tác:
Chất tan - pha tĩnh
Chất tan - pha động
Pha tĩnh - pha động
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước
tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại.
Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả
tách tốt nhất vói nhiều đối tượng tách.
1.23- Một số thông số đặc trưng [4] [6]
* Hệ sô dung lượng k'
Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích
với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của
quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa 2 pha. Sự phân bố này được đặc
trưng bằng hệ số dung lượng k . k được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất
tan A trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau:
k' =
* QÁM)
Trong đó Qa(S) và Qa(M) là lượng chất tan A phân bố trong pha tĩnh và
pha động.
Các chất trong hỗn hợp được tách và được pha động đẩy đến detectơ để

phát hiện, tín hiệu đo được bộ phận ghi tiếp nhận và cho kết quả dưới dạng pic
sắc ký. Số liệu được xử lý cho các giá trị như: Thời gian lưu, diện tích pic,
chiều cao pic, độ cân xứng của pic, độ phân giải của 2 pic liền kề, số đĩa lý
thuyết của cột.
Tùy theo tính chất, cấu trúc của chất phân tích mà người ta sử dụng các
detectơ khác nhau để phát hiện như: huỳnh quang, u v - VIS, điện hoá
Trong đó u v - VIS được dùng phổ biến nhất, vì nó đơn giản, khả năng ứng
dụng cao, độ nhạy đáp ứng nhu cầu phân tích và kinh tế.
* Thời gian lưu (tg): Retention time.
Thời gian lưu của 1 chất tính bằng (phút, giây) là thời gian tính từ lúc
tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc đồ.
So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn
làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
* Số đĩa lý thuyết:
(Biểu thị hiệu lực cột sắc ký).
Bằng thực nghiệm, số đĩa lý thuyết được tính bằng công thức sau;
N= 16
' t /
2
hoặc N = 5.54
tR
w
w
_ 1/2 _
Trong đó: - W: chiều rộng của pic đo ở đáy pic.
- Wi/2: chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Yêu cầu cụ thể về số đĩa lý thuyết sẽ được quy định trong từng phép
phân tích.
Thông thường 1 cột sác ký dùng để phân tích thường có N > 1000 đĩa lý
thuyết.

* Độ phân giải: (Rg)
Là đại lượng đo mức độ tách của 2 pic liền kề trên một cột sắc ký. Rg
được tính theo công thức sau:
R, = hoăc R.=
w,+w, ■
Trong đó: - Ira ; írb là thời gia lưu của 2 pic liền kề của chất A và B
- ; Wß là độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B.
■ Wi/2(a) i Wj/2(B) là độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic cuả
chất A và B.
Để tách riêng 2 chất, ít nhất Rs > 1,5 (khi 2 pic có độ lớn cùng cỡ).
Đáp ứng phân tích: chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng
của chất phân tích.
Khi so sánh chiều cao hay diện tích pic trong sắc ký đồ của mẫu thử và
mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta tính được hàm lượng hoạt chất trong
mẫu thử.
ỉ .2.4- Hệ thống máy HPLC: [4]
Máy HPLC gồm các bộ phận sau:
- Bình chứa pha động.
- Bơm cao áp.
- Bộ phận tiêm mẫu.
- Cột sắc ký.
- Detectơ.
- Bộ phận xử lý số liệu.
1.2.5- Các phương pháp định lượng bằng HPLC: [1][4]
Tất cả các phép định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với diện tích hoặc chiều cao của chất phân tích.
Có 3 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký.
* Phương pháp chuẩn ngoại:
10
Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó

cả 2 mẫu thử và chuẩn đều được sắc ký trong cùng điều kiện. So sánh diện tích
pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử với mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các
chất trong mẫu. Có thể sử dụng phưoỉng pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều
điểm.
- Chuẩn hoá 1 điểm: chọn nồng độ của mẫu thử xấp xỉ nồng độ của mẫu
chuẩn, tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
ở đây: - Cx : nồng độ của mẫu thử.
- Cs : nồng độ của chất chuẩn.
- Sx : diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử.
- Sg: diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu chuẩn.
- Chuẩn hoá nhiều điểm: tiến hành qua các bước sau:
Chuẩn bị 1 dẫy chuẩn vói nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các
đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn.
Vẽ đồ thị đưòfng chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích hoặc
chiều cao pic vói nồng độ của chất chuẩn, sử dụng đoạn tuyến tính của đường
chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
Chú ý: độ lớn của diện tích pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính
của đường chuẩn.
* Phương pháp chuẩn nội:
- Nguyên tắc: Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn nội vào
mẫu thử và mẫu chuẩn có chứa chất phân tích rồi tiến hành sắc ký.
11
- Chuẩn hoá 1 điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính
bằng cách so sách tỷ số giữa chiều cao hay diện tích pic của chất phân tích với
chuẩn nội trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
- Qiuẩn hoá nhiều điểm: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được
tính toán dựa vào đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa tỷ lệ chiều cao hoặc
diện tích của chất phân tích với chuẩn nội và nồng độ chất phân tích .
* Phương pháp chuẩn hoá diện tích:
Hàm lượng % của 1 chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính

bằng tỷ lệ % diện tích pic của nó so với tổng diện tích pic của các pic thành
phần trên sắc đồ.
Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và
được phát hiện và các thành phần đều có đáp ứng detertơ như nhau.
Trong phân tích sinh dược học người ta hay sử dụng các tính kết quả
theo phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có dùng chất chuẩn nội.
1.3. Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ trong huyết tương.
Clorpromazin trong dịch sinh học có thể định lượng bằng nhiều phương
pháp. Nhưng phương pháp HPLC được dùng nhiều hơn cả,
Sau đây là một số phưoỉng pháp định lượng CPZ trong huyết tương.
12
Bảng 1: Một sô nghiên cứu định lượng CPZ trong huyết tưoìig
Tài
liệu
Cột sắc ký
Pha động
Dung môi chiết
Chất
chuẩn nội
TỐC độ dòng
Phát hiện
[14]
Ultrasphere-CN
(250 X 2,lmm)
5|j.m
Natri acetat 0,06M : amoni
acetat 0,06M : acetontril
chứa 0,05% diethylamin
(4: 4: 92)
Isopropanol; n-

pentan: dicloromethan
(5 : 49 : 46)
Mesoridazin
0,5ml/phút Detector u v ở 238 nm
[13]
Symmetry Cjg
(150 X 2,lmiín/)
3,5(im
Acetonitril: amoni acetat
0,05M chứa 0,05% của
acid sulfonic ( 38 : 62)
Teit - butyl methyl
ether
Zusuquidar.HCl 0,2ml/phút Detector huỳnh quang
bước sóng kích thích
và phát xạ là 260 và
460nm
[16]
Spherisorb- CN
(150 X 4,6mm)
3|im
Acetonitril; amoni acetat
0,05M (9:1)
Pentan : 2 - propanol
( 98 : 2)
Promazin l,5ml/phút Detector điên hoá ở
+750mV
[12] Symmetry Ci
8
(250 X 4,6mm)

5|Lim
Acetonitril: amoni acetat
0,05M
pH = 4,2 (35 : 65)
Tert - butyl methyl
ether
GF 120918
Detector huỳnh quang
13
1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học: [1]
1.4.1- Khái niệm:
Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (máu,
huyết tương, nước tiểu) là quá trình xác định bằng thực nghiệm những đặc
điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với
các ứng dụng phân tích thực tế.
Mục đích của thẩm định phương pháp là xác nhận độ tin cậy của phép
đo trên mẫu thử cụ thể trong điều kiện đã xác định.
1.4.2- Nội dung thẩm định:
* Tính chọn lọc - đặc hiệu:
Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng phân biệt các chất trong
mẫu thử dùng khi tách và định lượng 2 hoặc nhiều thành phần trong 1 hỗn hợp
của phương pháp đó.
- Yêu cầu: + Mẫu trắng không được có đáp ứng của chất phân tích
hoặc chất chuẩn.
+ Các chất khác nhau phải cho đáp ứng khác nhau và tách biệt.
* Độ chính xác:
Độ chính xác của 1 phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả riêng
biệt khi phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu phân
tích. Độ chmh xác biểu thị bằng độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối.
Độ chính xác gồm có:

- Độ lặp lại: Độ lặp lại được tính khi phép phân tích được lặp lại trong
cùng một phòng thí nghiệm trong khoảng thòi gian ngắn và cùng một người
phân tích.
- Độ tái lặp: Độ tái lặp được xác định bằng cách lặp lại phép phân tích đó ở
cùng một phòng thí nghiêm, vói cùng một người phân tích, nhưng trong ngày phân
tích khác.
14
* Độ đúng:
Độ đúng của 1 phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân
tích vói giá trị thực của chất phân tích. Độ đmig có thể thay đổi từ 0 -100%.
- Đánh giá kết quả: Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị
trung bình so với giá trị thực.
Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá
15% so với giá trị thực.
* Khoảng nồng độ tuyến tính:
Là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được y và nồng độ đã biết
X của chất phân tích trong 1 khoảng nồng độ xác định.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi qui: y = ax + b
và hệ số tương quan tuyến tính r. Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và
giá trị hệ số r phải không nhỏ hơn 0,99.
* Độ ổn định của chất phân tích:
Độ ổn định của chất phân tích trong mẫu sinh học, bảo quản trong điều
kiện nhất định được theo dõi trong thời gian dài, cũng như trong quá trình
phân tích. Để đánh giá độ ổn định, người ta so sánh kết quả phân tích của mẫu
bảo quản với mẫu mới chuẩn bị. Kết quả phải sai khác không quá 5%.
* Giói hạn định lượng: (LOQ)
- LOQ là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với
tính đúng và tính chính xác chấp nhận được.
- LOQ được xem là nồng độ tại đó:
+ Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng.

+ Pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp
lại với độ chính xác 20%.
Ngoài ra còn có các những yêu cầu khác tuỳ theo loại phương pháp và
đối tượng nghiên cứu.
15
- Giá trị trung bình x = ^ X
i=l
1.4.3. Các thông số tính toán [1]
- Độ lệch chuẩn (SD) SD =
Trong đó: Xj là kết quả xác định lần thứ i
n là số lẩn xác định.
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
SD
RSD(%)= ^ 1 0 0
X
16
PHẦN II. ĐIỂU KIỆN THỰC NGHIỆM
• • •
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1- Điều kiện thực nghiệm:
2.2.1- Máy mốc thiết bị:
- Hệ thống HPLC Thermo Finnigan (Mỹ)
+ Bộ phận loại khí SCM 1000.
+ Bơm cao áp P400.
+ Bộ phận tiêm mẫu tự động + lò cột AS 3000.
+ Detector UV - DAD 6000.
+ Phần mềm điều khiển chromquest
- Cân phân tích Sartorius (Đức).
- Máy li tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).

- Tủ lạnh sâu Frigo (Đan Mạch).
- Máy siêu âm Bransonic (Mỹ).
- Máy lắc Labinco (Hà lan)
- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ sĩ).
- Máy khuấy từ Ikamag.
- Máy quang phổ Beckman DU - 640 (Mỹ).
- Bộ màng lọc, đầu lọc đường kính lỗ lọc 0,45|j,m; 0,2|im.
- Các pipet tự động l-lOp-l; 10-100 ịủ; 100-1000|al.
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, cốc đong, ống đong, pipet, đũa
thủy tinh, ống nghiệm.
2.1.2. Hoá chất - thuốc thử - chất chuẩn:
- Hoá chất, thuốc thử, chất chuẩn được trình bày ở bảng 2
' % - , ■
Bảng 2: Danh mục hoá chất - chất chuẩn - thuốc thử
Tên chất
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn chất
lượng
Hàm
lượng
Hoá
chất
thuốc
thứ
Acetonitril
Merck - Đức
HPLC nhà sản xuất
Methanol
Merck - Đức
HPLC nhà sản xuất

Dicloromethan
Merck - Đức
HPLC nhà sản xuất
Isopropanol
Merck - Đức
HPLC nhà sản xuất
n-pentan
Merck - Đức
HPLC nhà sản xuất
Natri carbonat
Vel - Bỉ
PA - Nhà sản xuất
Natri
hydrocarbonat
Vel - Bỉ
PA - Nhà sản xuất
Amoni acetat Vel - Bỉ PA - Nhà sản xuất
Huyết tưoỉng
người
Viện huyết
học và
truyền máu
TW-Việt
Nam
Natri acetat
Vel - Bỉ PA - Nhà sản xuất
Chất
đối
chiếu
Cloipromazin

hydroclorid
99,9%
Carbamazepin
99,5%
Promethazin
hydrocloiid
99,0%
2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu:
2.2.1- Chuẩn bị mẫu
- Pha dung dịch chuẩn gốc CPZ: ơiất chuẩn Qorpromaãn hydroclorid
được cân chúứi xác (tính theo Qorpromazin base) hoà tan trong nước để được
dung dịch gốc. Từ dung dịch gốc pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng
18