Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của
thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Trong
khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm
phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường. Một trong những vấn đề đánh giá
sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được
trong huyết tương.
Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong
huyết tương (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí
(GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện
di mao quản.... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là
phương pháp hayđược dùng hơn cả, do tinh ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính
chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế.
Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc
trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột;
dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng.... quy trình xử lý mẫu, khoản
nồng độ khảo sát.
Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm
phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp
prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều
trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá
khớp nặng. Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa
có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương.
Do đó
chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng
ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu:
-Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương cho
hiệu xuất chiết cao.
1
-Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng ketoprofen
trong huyết tương .

-Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng
HPLC.
-Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống
thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản.
2
PHẦN I: TỔNG QUAN.
1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KETOPROFEN.
1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá[1] [ 5].




- Phân tử lượng : 254.29
- Tên khoa học :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic
- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong
nước ở 20
0
C, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96
0
, aceton cloroform
và ether. pKa =5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3 : 1). Cực đại hấp thụ
trong methanol ở bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 95
0
C.
1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học [5] [6].
Ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất của acid
aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế
quá trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu.
Ketoprofen được hấp thu rất nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau
45 - 60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống. Liên kết với

protein huyết tương 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ. Sau khi uống 4 giờ
nồng độ ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu. Thuốc qua được
hàng rào nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn
phần lớn liên hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75-
3
CH – COOH
C
O
CH
3
90%), một ít qua phân( 1-8% ). Ở nước tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl,
1% là dạng chưa biến đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50%
qua thận.
1.1.3 Chỉ định [5] [6]:
Ketoprofen được chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:
- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm
cứng khớp cột sống.
- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế.
Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:
- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ... ).
- Viêm khớp vi tinh thể.
- Thoái hoá khớp.
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lưng, đau rễ thần kinh...
1.1.4 Chống chỉ định [6]:
- Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid
cùng loại.
- Loét dạ dày-tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú.
1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]

- Tác dụng phụ ở đường tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ
dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết
tiêu hoá, thủng ruột.
- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.
- Phản ứng quá mẫn ở da( nổi ban, mề đay, ngứa) và đường hô hấp
(suyễn, nhất là những người dị ứng với aspirin và các kháng viêm không
steroid khác).
4
- Giảm nhẹ hồng cầu ở người bị thiếu máu, một vài trường hợp giảm
bạch cầu nhẹ đã được ghi nhận.
1.1.6 Liều dùng:
Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no.
Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn.
Tiêm bắp ngày100-200mg chia 2 lần.
Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường
uống và các kháng viêm không steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm
tăng nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá.
1.1.7 Dạng bào chế [5] [6].
- Viên nang 25mg, 50mg, 75mg.
- Viên nén 100mg, 150mg.
- Viến bao tan ở ruột 50mg.
- Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg,
150mg, 200mg.
- Thuốc tiêm 100mg.
- Thuốc mỡ 2,5%.
 Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron….
1.1.8 Các phương pháp định lượng.
A. Phương pháp acid- bazơ:
Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng
chỉ thị đỏ phenol [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 10] [18].

• Tiến hành:
Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol.
Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N.
Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
5
- Hoc: Ho tan khong 200mg Ketoprofen (cõn chớnh xỏc) vo 25ml
alcol. Thờm 25ml nc Chun vi NaOH 0,1N, xỏc nh im tng
ng bng bc nhy in th.
1ml NaOH 0,1N tng ng vi 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
B. Phng phỏp quang ph [7] [8][10]:
Dựng nh lng ketoprofen trong ch phm.
Ho mt lng ch phm cú cha khong 50 mg ketoprofen (cõn chớnh
xỏc) trong 300 ml methanol 75 %, lc trong 10 phỳt, thờm methanol 75 % va
500 ml. Lc. Ly 5 ml dch lc pha loóng thnh 100 ml vi methanol 75 %
v em o hp th ca dung dich ny bc súng 258nm; cuvet thch anh
cú chiu dy 1 cm vi mu trng l methanol 75%.
Tớnh kt qu da vo A (1%, 1cm) bc súng 258 nm l 662.

C. Phng phỏp sc ký lng hiu nng cao ( HPLC ).
Dựng nh lng ketoprofen trong huyt tng v xỏc nh tp cht
trong nguyờn liu.
STT TI LIU PHA NG CT MU TH
1 [10] [18] m phosphat pH 3,5 - ACN
- H
2
O (2:43:55)
C
18
5àm
150*4,6 mm
Nguyờn liu
2 [10] NH
4
CH
3
COO 1% - MeOH -
ACN (55:30:15)
C
18
5àm
200*4,6 mm
Nguyờn liu
3 [13] m phosphat pH 3,2 - ACN
(60:40)
C
18
2àm
250*4,6 mm

Huyt tng
4 [12] NH
4
CH
3
COO 20 mM -
MeOH; iu chnh pH 7,0.
C
18
4 àm
Huyt tng
5 [11] ACN : AcOH 1%
( 38 : 62 ).
C
18
10àm
3,9*300 mm
Huyt tng
6 [16] m Phosphat 0,05M pH 7 :
ACN (90 : 10 ).
C
18
5 àm
4,6*250mm
Huyt tng
D. Phơng pháp điện di mao quản: Định lợng ketoprofen trong huyết tơng [14]
và tách đồng phân của ketoprofen [17].
1.2 Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
6
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography )

còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm
cuối 1960. Nó đợc xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện
rõ tính u việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dợc học của thuốc.
Phân loại các phơng pháp sắc ký [ 2]:
- Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng.
+sắc ký phân bố pha liên kết.
- Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao.
- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại cỡ ).
Trong phân tích sinh dợc học và kiểm nghiệm, ngời ta hay sử dụng phơng
pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ).
Đặc điểm phơng pháp [2]:
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh đợc gắn hoá học (liên
kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất cơ Siloxan


Nhóm
Silanol
Dẫn chất Dẫn chất Siloxan
của Silicagel clorosilan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực nh octyl (C
8
), octadecyl (C
18
) hay
phenyl và dung môi phân cực nh methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo
(sắc ký pha ngợc ).
7
Si
CH

3
CH
3
CH
3
Cl
CH
3
OH
Si R
SiSi O
CH
3
CH
3
R
+
H
3
C
H
3
C
- Nếu R là nhóm khá phân cực nh: alkylamin - ( - CH
2
- )
n
-NH
2
hay alkyl

nitril -( - CH
2
- )
n
- CN và dung môi ít phân cực nh hexan thì ta có sắc ký pha
thuận.
- Cách chọn pha: thờng chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các
chất cần tách và khác với pha động.
Nguyên tắc của phơng pháp [2] [3]:
Các chất trong hỗn hợp đợc tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau
của chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha
tĩnh và một pha động.
Dung dịch mẫu thử đợc đa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và đợc
dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp. Tại cột xảy ra
quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra
trớc, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra sau.
Chất ra khỏi cột đợc phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay
máy tích phân. Thời gian lu t
R
là đặc trng định tính của chất, chiều cao hay diện
tích pic là đặc trng định lợng của chất. Sắc ký đợc tiến hành so với chuẩn.
Một số thông số đặc trng của HPLC [2]:
Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau:
- Thời gian lu t
R
( phút ) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lu của mẫu thử và mẫu
chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính đợc chất đó.
- Thời gian chết t
M

( phút ) là thời gian của một chất không bị lu giữ tức
là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.
- Thời gian lu hiệu chính t
R
,
đợc tính theo công thức:
8
t
R
= t
R
,
+ t
M
( hay t
R
,
= t
R
- t
M
).
- Thừa số dung lợng k

dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất
Qs t
R
t
R
- t

M
V
R
-V
M
k

= = = =
Q
M
t
M
t
M
V
M
- Thừa số chọn lọc : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
k
B
k
B
t
R,B
= = =
k
A
k
A
t
R,A

Qui ớc B là chất bị lu giữ mạnh hơn A nên 1. Để tách riêng 2 chất thì
> 1, thờng từ 1,05 2,00.
- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N =
2
b
w
r
t
x 16








hoc N =
2
2/1
w
r
t
x 54,5

Trong ú: W
B
chiu rng pic ỏy pic.
W
1/2
chiu rng pic o na chiu cao ca nh.
- phõn gii R
S
l i lng o mc tỏch hai cht trờn mt ct sc
ký. t
R,B
t
R,A
R
s
=
1/2( W
B
+ W
A
)
tỏch riờng hai cht, R
s
1,5 ( khi 2 sc cú ln cựng c ).
- Chiu cao pic hay din tớch pic l c trng nh lng ca cht. Khi
so sỏnh chiu cao pic hay din tớch pic ca mu th v chun trong cựng iu
kin lm ta tớnh c hm lng hot cht trong mu th.

Pha tnh v pha ng trong HPLC [3].
*Pha tnh trong HPLC chớnh l cht nhi ct lm nhim v tỏch mt
hn hp cht phõn tớch. Nú l nhng cht rn, xp v kớch thc ht rt nh,
ng kớnh c ht t 3-10àm, din tớch b mt riờng thng t 50-500
m
2
/g.Cn c theo bn cht chớnh ca quỏ trỡnh sc ký trờn ct tỏch, ngi ta
chia nú thnh nhiu loi nh hp ph, phõn b, trao i ion v rõy phõn t.
9
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật HPLC.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha
liên kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng
tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau.
Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC:
+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký,
không có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân
tích.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
điều kiện sắc ký.
+ Tính chất bề mặt phải ổn định.
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
+ Cỡ hạt phải tương đối dồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO
2
)
+ Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al
2
O

3
)
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...)
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh
được chế tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp
cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt.
*Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích )
ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có
thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng
có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ
phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm,
chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung
môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tốt. Pha động là một trong
10
những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách
sắc ký, ảnh hưởng tới sự phân giải của chất trong pha tĩnh.
Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau:
+ Phải trơ đối với pha tĩnh.
+ Phải hoà tan được chất mẫu
+ Phải bền vững theo thời gian
+Phải có độ tinh khiết cao
+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân
tích.
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực,
nó là những dung môi trộn lẫn đượcvới nước và trong nhiều trường hợp thì
nước lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và được dùng khá
phổ biến trong loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol,
tetrahydrofuran, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước,

với đệm.
Sắc ký phân bố pha liên kết được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều
loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực.
Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hưởng đến kết
quả tách sắc ký.
• Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC.
- Phương pháp đường chuẩn
- Phương pháp thêm
- Phương pháp so sánh
Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán
kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất
chuẩn với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc
ký.
11
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
- Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001).
- Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24).
- Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24).
*Hoá chất:
- Acetonitril ( HPLC grade-Merck ).
- Methanol ( HPLC grade- Merck ).
- Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ).
- Triethylamin ( PA grade - Merck ).
*Dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+ Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000.
+ Detector Merck-Hitachi L-4000 UV.

+ Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator.
+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA.
- Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Ly tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl.
- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
12
2.1.2 Phương pháp thực nghiệm
a.Kh ảo sát điều kiện sắc ký
• Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tương
Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng
loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích.
Mẫu thử được xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau:



Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong
huyết tương, ta tiến hành chiết lặp (chiết 3 lần). Tiến hành như sơ đồ 1 thực
hiện thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu được cắn. Tất cả
các dịch chiết của 3 lần được tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi
thu được cắn như sơ đồ 1.
13
Lọc
Huyết tương
Lắc 5 phút
Ly tâm 15phút(3000

vòng/phút)
Dịch chiết
Cắn
Lắc 1 phút
Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút)
Dịch lọc
Dung môi hữu cơ
Khí
Pha động
Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương ( chiết đơn )