Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan của nhân trần tía thái nguyên và tảo spirulina bình thuận

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Được HÀ NỘI
sv. LẺ VĂN TÚ
TẤC DỤNG CHỐNG OXY HOA BẢO VỆ GAN CỦA NHÂN TRẦN
TÍA THÁI NGUYÊN VÀ TẢO SPIRUUNA BỈNH THUẬN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 51(1996-2001)
Người hướng dẫn:
TS. NGUYỄN QƯAiNG THƯỜNG
PGS.TSKH. LÊ THẢNH PHƯỚC
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vô Cơ-Hoá lý
Thời gian thực hiện:
15/2/2000 -i 5/5/2001
ị
Ị
\
\ J L Ạ .Ỵ L Hà Nội- 2001
L è n e á m m
Em xin bầy tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo:
TS. Nguyễn Quang Thường
PGS.TSKH. Lé Thành Phước
những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khoá luận này.
Đổng thời em cũng xin chán thành biết ơn cô giáo Nguyễn Thị Thơm
củng toàn thể các thầy, cô trong bộ môn Vô cơ - Hoá lý đã giúp em hoàn
thành khoá luận này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2001
Sinh viên
MỤC LỤC
Trang
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2. TỔNG QUAN 2

2 .1 .Những nguyên nhân phát sinh bệnh g a n
2
2.2. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống
oxy hoá (CCOH) trong cơ thể 2
2.2.1. Sự hình thành các oxy hoạt động 2
2.2.2 Chất chống oxỵ hoá (CCOH) trong cơ th ể
.

—
.


3
2.2.3. Ảnh hưởng của các chất độc và tác nhân viêm hoại tử gan qua cơ
chế gốc tự d o 4
2.3.Quá trình peroxyd hoá lipid (POL) 7
2.4.CƠ chế gốc tự do của các thuốc bảo vệ gan 9
2.5.Một số nét về Tảo Spirulina, Nhân trần

11
3. THỤC NGHIỆM

14
3.1.Chọn đối tượng và phương pháp nghiên cứu

14
3.1.1. Chọn đối tượng nghiên cứu 14
3.1.2. Phương pháp, mô hình và nguyên vật liệu nghiên c ứ u 14
3. 2. Kết quả thực nghiệm 18
3.2.1. Các kết quả khảo sát về phương pháp đo 18

3.2.2. Kết quả nghiên cứu tính chất chống oxy hoá của cao đặc Nhân trần
tía Thái Nguyên 24
3.2.3. Kết quả nghiên cứu TCCOH của Tảo Spirulina ở Bình Thuận

29
3.2.4. Kết quả nghiên cứu TCCOH của protecgan - một chế phẩm từ Tảo
và Nhàn trần 31
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
CCOH : Chất chốn2 oxy hoá
DOHĐ
: Dạnu oxy hoạt động
GSH : Glutathion
GSHPO : Glutathion peroxydase
HTCOH
: Hoạt tính chốn a oxv hoá
LO : Gốc lypoxyl
LOO-
: Gốc lypoperoxyl
MDA
Manonyl dialdehyd
NT : Nhân trần
POL : Quá trình peroxyd hoá lipid
TCCOH
: Tính chất chốnu oxy hoá
1. ĐẶT VẤN ĐỂ
Việc tìm các thuốc bảo vệ gan có nguồn gốc từ dược liệu trong nước đang là
vấn đề được quan tâm.
Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

của Nhân trần và Tảo Spirulina. Kết quả cho thấy Nhân trần là vị thuốc bảo vệ
gan,* biểu hiện khá rõ hoạt tính chống oxy hoá invivo và in vi tro. Cũng như
Nhân trần, tảo Spirulina với thành phần chủ yếu là protid, lipid, p-caroten,
vitamin E cũng thể hiện rõ tác dụng bảo vệ gan.
Nhữnỉỉ nguyên liệu cho các nghiên cứu này:
Như Nhân trần thì thường là Nhân trần mọc hoang được thu hái
về và được buôn bán ử các cơ sở kinh doanh.
Với tảo Spirulina mọc hoang ở Hồ Ba Mẫu cũng đã được thu thập
nghiên cứu.
Hiện nay ở Thái Nuuyên có loại Nhân trần tía (Adenosmư caeruleiitn
R.Br.) đã bắt đầu uieo trồng ử diện tích lớn và đang dự kiến qui hoạch thành
một vùng nguyên liệu. Tảo spirulina ở Bình Thuận đã được Công ty nước
khoáng Vinh Hảo nuôi trồng với sản lượng lớn và ổn định.
Những yếu tố này sẽ trở nên quan trợng cho việc sản xuất một dạng
thuốc bảo vệ gan sau này. Vì vậy trong khoá luận này chúng tôi có nguyện
vọng thực hiện được mục tiêu: Khảo tính chất chống oxy hoá của dạng cao
đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, Tảo nguyên Spirulina ở Bình Thuận và
dạng viên nén của 2 nguyên liệu này qua hai chỉ tiêu là HTCOH in vi vo và
hàm lượng GSH gan chuột trên mô hình tiêm CCI4.
Hy vọng với những kết quả thu được sẽ có một số thông tin 2 Óp phần
cho các cơ sở sản xuất trong nước tham khảo, tạo ra một dạng bào chế có tác
dụng bảo vệ gan, từ 2 n.suyên liêu này.
1
2. TỔNG QUAN
2.1. NHỬNG NGUYÊN NHÂN PHÁT SINH BỆNH GAN [9, 6]
Bệnh gan hiện nay vẫn là bệnh phổ biến trên thế giới, đặc biệt là những
nước nhiệt đới như Việt Nam. Bệnh san thườns bắt đầu từ viêm san cấp rồi
chuyên sans viêm ean mạn, suy san, xơ oan và cuối cùng có thể dẫn tới une
thư san.
Các nguyên nhân phát sinh bệnh san rất phong phú như: viêm ean do

virus. Khi các virus vào san nó biên mội thành phần của tê' bào uan thành
khánu nguyên hoặc sắn kháng nguyên lên hề mặt tế hào oan. Khi đó cơ thể
sản xuất ra các khánu thô’ chốns lại các khánu nguyên tạo ra phản ứns viêm.
Viêm sjan hoại tử có thể do các chất độc xâm nhiễm vào cơ thể như:
tetracloruacarbon(CCl4), Trinitrotoluol! (TNT: chất độc chiên tranh) và các
thuốc như tetracyclin, Paracetamol. INH, Rifaimycin, hoặc ethanol. Khi vào
cơ thê dưực uan chuyển hoá tạo ra nhừnu chất độc, ìiày viêm hoại từ uan.
Tinh trạne thiếu dinh dưỡn« kéo dài cùne dản đốn viêm £an hoại tử.
Ncoài ra còn rất nhiều nguvên nhân khác có thể dẫn đến viêm gan như:
viêm gan do amip, do viêm đườns mật, do tăna áp lực tĩnh mạch cửa
Quá trình viêm gan đã được nhiều tài liệu đề cập theo các cơ chế khác
nhau. Cơ chế sốc tự do của quá trình này được trình bày vắn tắt (V phần dưới
đây.
2.2. Sự HỈNH THÀNH CÁC DẠNG OXY HOẠT ĐỘNG VÀ HỆ THÔNG CÁC
CHẤT CHỐNG OXY HOÁ TRONG cơ THE [1,3,10,12]
2.2.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động (DOHĐ)
2
Trone chuỗi hô hấp tế bào oxy nhận điện tử và kết hợp với hydro tạo
thành nước,.Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế qua
nhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chỉ nhận một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu
tiên tạo thành sốc superoxyd (Oj~). Gốc này (0*~) bị SOD phân huỷ tạo
thành H2 0 2 theo phản ứng:
SOD
20 ;- + 2H+ >H20 2 + °2 (1)
với hằne số tốc độ kị = 109 M/s.
H2 0 2 tạo ra nhanh chóng bị GSHPO và cơ chất là GSH chuyển thành
nước theo phản ứns:
GSHPO
H2 0 2 + 2GSH — — > 2H20 + GSSG (2)
với hằns số tốc độ k2 = 1 0 8 iVl/s.

Binh thườns do kị và k2 rất lớn, nên chủ yếu sán phẩm của quá trình hô
hấp tế bào là nước. Tuy nhiên trone cơ thỏ’ vẫn tổn tại một lượng rất nhỏ H2 0 2
và OV". Đây là 2 chất có tính chất oxy hoá mạnh, do chuyển động nhiệt hoàn
toàn nsẫu nhiên mà chúno va đập phản ứnu với nhau tạo ra '(), (oxy đơn hội
)và §OH í sốc hydroxyl). Đây ỉà hai tiểu phàn có khả nănu phán ứnii rất cao.
Chún« tấn côns vào các tổ chức của cư thê tạo ra các gốc tự do mới như LO’,
LOO
Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả nănu phản ứng cao như
vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant.
2.2.2. Chất chống oxy hoá trong cơ thể
Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hoà hoặc phân huỷ các dạng
oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các antioxidant bao gồm:
- Enzym Superoxydismutase (SOD)
Có 2 loại SOD: + MnSOD có ở ty thể
+ CuZnSOD có ở bào tương
3
Cả hai loại này đều phân huỷ đặc hiệu 0 ‘2 theo phản ứng ( 1 ).
- GSH và GSHPO
Cơ chất và enzym này phân huỷ các peroxyd và H2 0 2 theo phản ứng:
LOOH + GSH GSHPQ > GSSG + LOH + H20 (3)
LOOH(peroxyd)
- Vitamin E
Đây là một vitamin tan trong mỡ, có khả nãne nằm ở các tổ chức màne,
vừa có vai trò bẫy các Hốc tự do thứ cấp như LO', LOO vừa loại bỏ ‘0 2 một
chất khơi mào cho quá trình POL. Do đó vitamin E là một chất bảo vệ tốt
màrm tê bào nuăn chận sự tấn cônẹ của các sốc tự do.
- B-caroten. ubiquinon và các chất tươns tự tồn tại ở dạns semiquinon
(sốc hền) và có tác dụns bẫy các sốc tự do.
- Các tác nhàn phức hoá các kim loại chuyển tiếp như sắt và đồng. Bình
thườns phản ứne của Oị với H2 0 2 tạo ra ‘0 2 và 'OH, xảy ra rất chậm (phản

ứnt> Harber-Weiss), nhưns; khi cỏ mặt các kim loại chuyên tiếp ở trạng thái tự
do (F c'\ Cu+) thì phán ứnu xảy ra rất nhanh (khi đó dưựe nại là phản ứnu
Fenton), sắt và đổng trong CƯ thế luôn tổn tại dưới dạng phức như Ferritin,
Ceruloplasmin, Transferin
2.2.3. Ánh hưởng của các chất độc và tác nhân gâv vièm gan hoại tử qua
cơ chế gốc tự do.
2.2.3.1. Viém hoại tử gan do thiếu dinh dưỡng [15]
Khi trons khẩu phần thức ăn không đủ chất dinh dưỡng, đặc biệt là
protid, sẽ thiếu các acid amin như cystein, methionin làm cho GSH và một
số chất bảo vệ san khác không được tổng hợp. Khi đó tế bào gan sẽ bị hoại tử
,do cạn kiệt GSH là một chất chốns oxy hoá mạnh có khả năne cùns với
GSHPO loại bỏ các peroxyd hình thành, ức chế quá trình POL ở tế bào san.
A
Hàm lượns GSH trong cơ thể được coi là một chỉ tiêu đánh giá sức đề
kháng và mức độ nhiễm độc của cơ thể.
Thiếu dinh dưỡng còn thiếu cholin làm cho gan không tổng hợp được
phospholipid . Khi đó mỡ tích tụ lại ở gan, tạo tiền đề cho quá trình POL sinh
ra nhiều sản phẩm độc.
2.23.2. Viêm hoại tử gan do các chất độc xàm nhập vào cơ thể [11,12,19]
Các hợp chất như tetracloruacarbon (CCỊị), trinitrotoluen (TNT), hợp
chất nitro thơm, rượu hoặc các thuốc như paracetamol, tetracyelin, INH,
riíầmycin Khi vào cơ thể , được gan chuyên hoá tạo ra nhiều sản phẩm trung
»ian có tính oxy hoá mạnh. Các dạn« trung sian này làm tăng quá trình POL,
giảm CCOH ở san làm cho các tê' bào gan bị hoại tử . Một số chất điển hình
được trình bày dưới đây.
* Viêm gan hoại tử do CCl4
Các dẫn chất halogen và điển hình là tetracloruacarbon (CC14), khi vào cơ
ihe được oan chuyển hoá như sau:
CC14

> CC1Í + C1-
+0 2
V
CClịOO

> Cl2CO (phosaen)
Trước khi thành phosgen, CC14 được men ean (cytocrom P450)chuyển
thành các dạng eốc tự do như CCI3 , C1‘, CCI3 OO gây huỷ hoại các tế bào
gan thông qua quá trình POL.
* Viêm gan hoại tử do các hợp chất nitro
Các dẫn chất nitro (RN02) khi tới gan được chuyển hoá như sau:
Qua sơ đồ ta thấy từ RN02 được men gan chuyển thành RN Oj , chất
này nhường điện tử cho oxy tạo gốc 0*2 và RNOÌ" lại trở về R N 02. Như vậy
không có sự khử thực sự nào mà các hợp chất này chỉ xúc tác cho sự hình
thành sốc 0*~. Từ gốc này sẽ hình thành '0 2 và 'OH làm tăng quá trình POL,
gây phá vỡ màng tế bào (hoại tử tế bào gan).
* Viêm gan mạn do rượii
Khi ethanol vào gan, nó được men gan (cytocrom p450) chuyển hoá như
sau:
hoá lipid trị vào các protein
Như vậy sau khi được gan chuyển hoá, từ ethanol đã tạo ra các sản phẩm
truns sian là các gốc tự do, làm cho quá trình POL tăng mạnh, đồng thời làm
giảm lưựng GSH.VÌ các lý do này nên nếu ethanol được đưa vào cơ thể với
một lượng lớn trong thời gian dài sẽ gây hoại tử các tế bào gan.
* Tổn thương gan do Trìnitrotoluen (TNT)
Theo Zimmerman H.J., TNT là một chất thân mỡ và quá trình đào thải
chúns ra khỏi cơ thê cần có thêm một nhóm phàn cực đê có thể hoà tan vào
nước. Quá trình chuyển hoá này xảy ra ở san và được hệ thốns men oxy hóa
6
đa chức năne (bao sồm: cytocrom p450, NADPH-cytocrom khử và

phosphotidyl cholin), chuyển hoá tạo ra các sản phẩm trung gian và các gốc tự
do. Những chất trung gian chuyển hoá tạo liên kết đồng hoá trị với các protein
phân tử nhỏ của tế bào san gây tổn thương gan. Những gốc tự do có hoạt tính
oxy hoá rất cao, làm tăng quá trình POL trên các tổ chức màng tế bào gan. Từ
đó một loạt các tổn thương gan xuất hiện như: thoái hoá hạt, thoái hoá rỗ,
thoái hoá mỡ, hoại tử, u hạt, tăng sinh xơ.
Ngoài ra một số thuốc như INH, Rifamycin, tetracyclin, halothan tương
tự như các hoá chất trên, khi qua gan được gan chuyển hoá tạo thành các dạng
trung gian có tính oxy hoá cao, làm tăng quá trình POL sầy huỷ hoại tế bào
gan. Do vậy nếu duns các thuốc trên với liều cao kéo dài có thể dẫn tới nguy
cư viêm gan hoại tử. •
2.3. QUÁ TRÌNH PEROXYD HOÁ LIPID (QT POL) [3,12]
Cơ thể nsoài nước ra thì phần lớn là các tổ chức màng có thành phần chủ
yếu là acid béo chưa no và phospholipid .Vì vậy khi các uốc tự do có khả
nănu phán ứnu cao xuất hiện thì xác suất nhiều hơn chúnu sẽ tấn công vào
các ihành phần lipitl của tổ chức many, gây ra quá trình peroxyd hoá lipid.
Đày là một phản ứng đặc trưng của iìốc tự do, xảy ra theo 3 giai đoạn sau:
2.3.1. Giai đoạn khơi mào
Khơi mào là giai đoạn tạo các peroxyd. Tác nhân khơi mào thường là ‘o ,
và gốc 'OH (gốc hydroxyl) theo phản ứng:
LH + ‘0 2

> LOOH
LH +-OH -» H20 + L- LOO- — > LOOH + Lị*
L: sốc acid béo; LOOH: peroxyd
Gốc Lj' lại cộna oxy và sau đó phản ứne tiếp với L2H cho ra L[OOH và
cứ như vậy các peroxvd tạo ra nhiều ở nưi có sốc ’OH và ‘0 2.
7
2.3.2. Giai đoạn phát triển mạnh
Đây là giai đoạn chuyển tâm gốc tự do từ phân tử nàv sang phân tử khác

theo cơ chế:
Gốc + Phân t ử

» Gốc mới + Phân tử mới
L2H
Lj + 0-) —^ L ịOO* —
-

^ LịOOH + Lo*

Nhiều tâm gốc mới và mạch phản ứng mới xuất hiện do các peroxyd dễ
dàng phân tách đồng ly tạo gốc mới như sau:
2L O O H

» LO- + LOO* + H20
Quá trình nàv xảy ra nhanh khi có mật của các kim loại chuyển tiếp như
Fe2+, Cir+.
Các gốc peroxyd LO', LOO dễ dịch chuyển điện tử ở cạnh nối đôi tạo các
peroxvd nội. Các peroxyd nội này dễ bị cắt ở vị trí ị3 tạo ra những gốc và phân tử
ngắn hơn. Chẳng hạn như sự phân cắt gốc peroxyd của acid arachidonic như sau:
0
-
0
«
Gốc LOO* của
acid arachidonic
A A A A
Ằ J
♦ A ^ N y ' C0,0H
Các phân tử nhỏ xuất hiện,

N/ialonyl dialdehyd màng bị phá vỡ
(MDA)
Giai đoạn phát triển mạch mà xảy ra mãnh liệt ờ một cơ quan tổ chức nào
thì ĩihiều chất bị tấn công tạo ra các peroxyd và sự phân cất ị3 làm cho nhiều tổ
chức màne bị ly giải tạo ra các sản phẩm aldehyd độc hại. Đó là lý do giải
thích phản ứng gốc tự do xảy ra mãnh liệt ở các tổ chức viêm hoại tử
2.3.3. Giai đoạn dập tát mạch
Phản ứnẹ sốc tự do chỉ bị dừns lại khi sản phẩm của nó không phải là
gốc như R' +Rj' = R-Rị
Quá trình 2 gốc phản ứng tạo thành phân tử ít xảy ra. Trong cơ thể tác
nhân dập tắt mạch quan trọng là vitamin E và các chất có cấu tạo tương tự như
ubiquinon.
vit.E(OH)2 + 2LOO

► vit.E(0 2) + 2LOOH
'vii.Ckhử V itC o x
LOOH lại dược GSH và enzym GSHPO chuyển về acid béo theo phản
ứnu (3)
Như vậy nếu nồnu dộ GSH và hoạt độ GSHPO còn đủ lớn thì khả năn«
chuyên peroxyd về acid héo được dễ dàng, ngăn chặn được quá trình POL gia
tãnti. Nếu ngược lại thì phản ứng eốe tự do cứ tiếp tục xảy ra cho đến khi hết
cơ chất, tức là tế bào bị phá huỷ hoàn toàn.
2.4. Cơ CHẾ GỐC Tự DO CỦA CÁC THUỐC BẢO vệ GAN
2.4.1. Vitamin E (a-tocopherol) [1,12]
Cấu tạo phân tử vitamin E có mạch cacbon dài (R=C1 6 H13) nên nó có thể
hoà tan vào mỡ, sắn vào các tổ chức màng. Vitamin E có khả năng phản ứng
với các gốc tự do thứ cấp như LOO, LO' (là các gốc peroxyd) chuyển các gốc
này về trạns thái không gốc, làm cho chuỗi phản ứng peroxyd hoá bị dập tắt.
Vitamin E còn trurm hoà ‘0 2 (oxy đơn bội) ngăn neừa sự khơi mào quá trình
POL. Mật khác vitamin E làm tăng lượnu GSH và tỷ lệ SH/S-S ở trong mans

9
tế bào gan, khi gây viêm san thực nghiệm bằne CC14. Do đó nhiều thuốc
bảo vệ ean có chứa vitamin E.
2.4.2. Selen [2,1]
Vitamin E chuyến các gốc tự do như LOO, LO* về dạng peroxyd các
peroxyd sẽ không phân huỷ đồng ly tạo gốc tự do được, bởi cơ thể có men
GSHPO mà tâm hoạt động là selen cùng với GSH chuyển các peroxyd về dạng
lipid theo phản ứng:
2GSH + LOOH

> 2GSSG + LOH + H20
GSHPO
Như vậy Selen là một chất chống oxy hoá tham gia loại bỏ peroxyd.
Nsoài ra Selen có còn tham gia xúc tác cho sự tổng hợp Co-Enzym Q.
Chất này có cấu tạo kiểu semiquinon có tác dụng trune hoà gốc tự do. Trên thị
trường cỏ nhiều thuốc chứa vitamin E và selcn như protecton, belaf, saylom
được chí định cho dự phòng và điều trị các bệnh ở gan.
2.4.3. Các flavonoid [16]
Các llavonoid là nhữno sắc tố phổ hiến rộnu rãi tron« thực vật. chúng có
mộl số tính chất sau:
+ Tham eia dẫn truyền điện tử.
+ Tạo chelat với các kim loại do đó chúng khoá Fe2+, Cu2+ ở dạng phức
,làm cho những kim loại này mất khả năng xúc tác phản ứng Fenton, ngãn
ngừa xúc tác cho sự đồng ly của các peroxyd; Do đó góp phần ngăn ngừa tạo
gốc tự do và quá trình POL.
+ Flavonoid có khả năng phản ứns với gốc tự do.
Khi vào cơ thể, các flavonoid tồn tại ở dạng gốc bền. Ở dạna này chúng
có tác dụng truns hoà các dạne oxy hoạt động, ngăn chặn quá trình huỷ hoại
cấu trúc và chức năn2 của tế bào san, Các Flavonoid còn bảo toàn hoạt độ các
enzym tănọ cườns chức năne chốnc độc của ean, rmăn chặn sự phân huỷ

phospholipid, nsăn chặn sự nhiễm mỡ và sự huỷ hoại nhu mô san.
10
Do vậy trong các liệu pháp điều trị viêm gan cấp và mạn, xơ gan,
một số Flavonoid đã được chỉ định dùng cho bệnh nhân với các biệt dược như
cilymarin, carsil, cilibinin, ciliborun, fortex
2.5. VÀI NÉT VỀ NHÂN TRẦN VÀ TẢO SPIRULINA
2.5.1. Nhân trần
- Nhiều tài liệu công bố hiện nay ở Việt Nam [5,7] có ba cây mans tên
Nhân trần thuộc chi Adenosma đang được sử dụng để điều trị bệnh ean theo
phương pháp y học cổ truyền, đó là:
+ Nhân trần: Adenosma caenileum R.Br. Cầy này đã được hai danh y Việt
Nam là Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông ghi vào tác phẩm y học của mình.
+ Nhân trần Bồ bổ: Adenosma indianum Lour.
+ Nhân trần Tây Ninh (chè cát, nhân trần cái ): Aclenosma bracteosum
Banati.
- Các nuhiên cứu trước đây về thành phần hoá học đều cho thấy rằng
thành phẩn chính của Nhân trần cón Flavonoid: 0,1-5-0,15%,tinh dầu:
0,25-5-0,5%. Neọài " 'òn có polyphenol, cumarin
- Cây Nhân trần tía
Thái Nguyên (mẫu 1 ) với
các đặc điểm như trons
ảnh đã dược Hội thảo
khoa học ở Thái Nguyên
và GS. Vũ Văn Chuyên
xác định là loại Nhân
trần tía có tên khoa học
là Adenosma caemleum
R.Br.họSeroplìulariaceae
Một số công
trìnhtrướcđây [6,17,18]

đã nghiên cứu TCCOH
của Nhân trần mọc
hoan2 lấv từ
o J
11
các cơ sở kinh doanh, các nghiên cứu thể hiện rõ TCCOH của dịch chiết
hước Nhân trần và cũng đã chứng íỏ phần quyết định HTCOH chủ yếu là do
Flavonoid [17]. Theo kinh nghiệm của các lang y thì Nhân trần tía có tác dụng
tốt hơn các loại Nhân trần khác 1,5 lần, mùi thơm đạc trưng hơn, có lẽ đây là
điểm đáng chú ý nhất của loại Nhân trần tía.
2.5.2. Tảo Spirulina [14]
Có 2 loại là: + Spỉniỉina pỉcitensis
+ Spirulina maxima
Với thành phần hoá học rất phong phú, theo như kết quả kiểm nghiệm
của Sở Khoa học Cône nehệ Môi trường thành phố Hồ Chí Minh thì thành
phần hoá học của Tảo Spirulina ở Binh thuận bao gồm:
Protein
64.19%
Glucid
3,47%
Lipid 3,949fr
Na 0 ,6 6 c/1 0 0 u tảo
Ca
0,56 u/lOOiì tảo
K
1,34 g/100g tảo
Mg
0,41 g/1 0 0 g tảo
Fe
0,14 g/100g tảo

p
0,14 g/1 0 0 g tảo
Zn
1,4 s/100g tảo
(3-caroten 1 ,0 2 %
Vitamin B2
7,53 ppm
Vitamin B12
0,08%
Vitamin Bị
0,03%
Vitamin B6
0,31%
Vitamin E
5,05ppm
12
Với thành phần như vậy, tảo có tác dụng dinh dưỡng rất tốt cho
heười và động vật.
* Gần đày, một loại tảo Spirulina mọc ở Hồ Ba Mẫu - Hà Nội cũng đã
được nshiên cứu tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế gốc tự do [4, 6 , 18]
Có tác giả đã cố gắng chiết từ tảo ra các dạng khác nhau và thử tác dụng
chống oxy hoá của các phân đoạn chiết. Kết quả đều khảng định tác dụng tốt
của Tảo. Song hầu hết các dạng đều chiết bằng nước và loại tạp. Vì vậy hầu
như nhiều thành phần quí tan trone dầu như Vitamin E, 3-caroten không
chiết được. Mặt khác khi tiến hành sản xuất lớn thì việc chiết này sặp nhiều
khó khăn tronẹ điều kiện nước ta hiện nay, đặc biệt trong khâu lọc loại tạp.
Một dạng chế phẩm của nước ngoài như "Phyto-spliat" của Nga, ở dạng viên
nén cũng dùniì dạnu tảo ní>uyên.Vì vậy có ý kiến cho rằng sử dụng đạno tào
nguyên thì có lựi cho sàn xuấl nhiều hơn.
* Nhìn chung:

/ - Môt số nnhiên cứu đều khẳng dinh Nhàn trần và Tảo có HTCOH bảo vê
Ịìan iron mổ hình thực ntihiệm vứi CC14.
- Nguồn neuyên liệu cho các nuhiên cứu thường được cunu cấp từ các cơ
sở kinh doanh (Nhân trần) hoặc mọc tự nhiên (Tảo Spirulina).
- Đã dùns kỹ thuật phun sươns là một kỹ thuật tiên.tiến và chiết ở môi
trườno acid, rồi loại tạp bằng than hoạt sau đó trung tính hoá. Đây là cách tạo
ra một dạns nguyên liệu rất tốt, thể hiện rõ HTCOH. Tuy nhiên nếu đưa vào
sản xuất lớn thì rất tốn kém và khó thực hiện đặc biệt là khâu lọc trước khi
phun sương đối với tảo. Vì vậy trước mắt chúng tôi dùng dạng nguyên liệu:
Dạns tảo nguyên ở Xí nehiệp nước khoáng Vĩnh Hảo Bình Thuận và dạng
cao đặc của cây Nhân trần tía của Thái Neuyên cho các thí nehiệm.
13
3.THỰC NGHIỆM
3.1. CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.1.1. Chọn đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi chọn hai Dược liệu là : Nhân trần tía Thái nguyên và Tảo
Spirulina ở Bình thuận .
- Cây Nhân trần tía ở Thái Nguyên trồng tới khi ra hoa, thu hoạch về nấu
thành cao đặc có hàm ẩm từ 15-20%, độ tro dưới 9°/(, hàm lượng flavonoid
0,15%.
- Tảo spirulina ở Binh thuận có tiêu chuấn kiểm tra chất lượng để bán ra
thị trườnR.
+ơ dạtm sàn phẩm được dỏng oỏi Ikiì của Xí nghiệp nước khoáng Vĩnh
. Lổ sản xuất: 030799
. Hạn dùng: 24 ihánu
có phiêu kiêm níìhiệm số: 991019
Đó là hai nguyên liệu được chọn đế đánh giá tác dụng chốns oxy hoá
riêns biệt và chê thành viên nén protecsan theo công thức:
đánh giá sơ bộ TCCOH qua 2 chỉ tiêu MDA và GSH.
3.1.2. Phương pháp, mỏ hình và nguyên vật liệu nghiên cứu

3.1.2.1. Mô hình nghiên cứu
Chuột thí nshiệm loài Swiss trọng lượns 18-ỉ-22o, ứns với 40-45 ngày
tuổi được nuôi trons cùns điều kiện, lô chứns cho uốns nước cất, lò thử cho
Hảo:
0,15g
0,15g
14
uống chất thử là cao đặc Nhân trần tía Thái Nguyên hoặc tảo Spirulin
Bình Thuận. Tất cả các con chuột đều được tiêm dung dịch CCỊị 10% pha
trone dầu thực vật và cách ly Hoàn toàn với thức ăn(Mh)Sau đó giết chuột thật
nhanh lấy gan làm homogenat xác định MDA và GSH.
3.1.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá
3.1.2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp
Tiến hành peroxyd hoá acid béo chưa no ở một nhiệt độ và thời gian nhất
định. Phản ứn° này tạo ra sản phẩm là malonyl dialdehyd (MDA). Chất này
phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra phức màu hồng bền. Đo mật độ quang
của phức này ta biết được lượng MDA trong mẫu nhiều hay ít. Mầu thử có
chất chống oxv hoá (CCOH) thì lượng MDA thấp hơn so với mẫu chứng
không có CCOH.
HTCOH được biểu thị thành oiá trị phần trăm lượno MDA bị ức chế ở
mẫu thừ so với mẫu chứng.
Phản ứrm iiiừa M DA và acid thiobarbituric:
Phức màu hỏng
3.1.2.2.2. Phương pháp do HTCOHỊ21]
Cất đầu con vật, lấy gan lira sạch máu bằng nước muối sinh lý. Cân một
khối lượng ean trên cân chính xác. Nghiền san trên máy Homoaenizer, tạo
dịch đồns thể 2% với đệm Tris 0,04M, pH:7,4. ủ hỗn hợp này ở 37°c trone
vòne 45’, sau đó thêm lml dune dich acid tricloacetic 30% vào Ốn2 nshiệm
có 5ml dịch đồns thể, lắc kỹ, lọc, hút chính xác 2ml dịch lọc thêm 0.2ml dung
dịch HC1 5N và 2ml dun2 dịch acid thiobarbituric 0,25%. Lắc kỳ. đun cách

15
thuỷ ở t° = 100°c/15’. Để nguội đến nhiệt độ phòng, đo quang ử bước
sóns A.max = 532nm. Từ đó tính ra hàm lượng MDA với hệ số tắt mol
8 = 1 ,5 6 x 1 0 5 iM' 1 .em'1
3.1.2.3. Phương pháp đo GSH [20]
Trons điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phươne pháp đo
quane dựa trên nguyên tắc cho GSH trong dịch chiết tổ chức phản ứng với
thuốc thử Ellman (5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic)) tạo phức màu vàng theo
phản ứng:
Đo mật độ quang ở hước sóniỉ Ằ=412nm ta xác định được lượn 12 GSH
tronti duno dịch.
* Tiến hành xác định GSH
Tiến hành theo mổ hình nghiên cứu, sau khi giết chuột, lấy gan rửa sạch
máu bằng nước muối sinh lýlạnh, cân một khối lượns gan trên cân chính xác .
Tạo dịch đồns thể 9% với acid metaphosphorie 5%, thêm 0,4ml dung dịch
acid tricloacetic 20%, lắc đều, ly tâm 4000V/phút. Lấy dịch sau ly tâm thêm
0,4ml NaOH 2,5% được dung dịch A(ddA), tất cả các thao tác đều tiến hành ở
nhiệt độ 0-4°C sau đó hút chính xác 0,5ml ddA, thêm 4,5ml dune dịch gồm
thuốc thử Ellman 0,lnmol/lml trone hỗn hợp đệm Na3 PO_i 0,1M và EDTA
0.05M, để 2 phút ở nhiện độ phòns, tiến hành đo quans ở bước sóng X =
412nm.
Cône thức tính hàm lượns GSH là:
COO' coo
Phức màu vàng
16
v _ C.õxKtlOOO , , ,
x = ~ nV (-L[g/g)
O.Sxm
Trong đó. -C : là hàm lượns GSH (uơ/ml) trong V mlddA
-m : khối lượng gan (mg)

-V : thể tích dung dịch A (ml)
3.1.2.4. Dụng cụ, hoá chất, thiết bị
*Hoá chất:
1 .GSH chuẩn (Merk)
2 .Thuốc thử Ellman (Merk)
3.Acid metaphosphoric
4.x'\cid tricloacetic
5. Acid thiobarbituric
*Dụng cụ và thiết bị
1.Máy ly tám Heirnle Z320
2.Tủ lạnh
3.Tủ ấm
4.Ong nghiệm, dao, kéo, kẹp, bơm tiêm.
5.Máy đo quang Trung Quốc 752
ó.Máy tạo dịch đổng thể Homogenize!' của Mỹ
* Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng loài Swiss
6 . Natri hvdroxyd
7. Đệm Tris
8 . Acid hydrocỉoric
9. .EDTA
10. Trinatriphosphat
7.Cân phân tích
8 .Máy đo pHmet (Metron 744)
3.2. Kết quả thực nghiêm
3.2.1. Các kết quả khảo sát về phương pháp đo
3.2.1.1. Kết quả khảo sát phương pháp đo hoạt tính chống oxy hoá
3.2.1.1.L Xác định sai sô phương pháp
Để xác định sai số của phép đo chúng tôi tiến hành trên 1 gan chuột cân
8 mẫu, xác định hàm lượng MDA theo phương phương pháp đã nêu, kết quả
được trình bày ở bảng 1

Bảngl hàm lượng MDA trong 8 mầu gan của một ganchuột
Stt
Màm lượnẹ MDA(*)
1
0,165
2
0,159
3 0,177
4
0,179
5
0,145
ì 6
0,150
ị 7
0,161
: 8
0,177
9 0,155
TB
0,163±0,009
SSTĐ
5,59?
(*) Đơn vị MDA biểu diễn theo mật độ quang
Như vậy sai số của phương pháp là 5,5%.
3.2.1.1.2.Xác định sai số sinh học
Để đánh giá sai số sinh học chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng
MDA trên một lô chuột bình thường £ồm 8 con. Kết quả ở bảng 2.
Bảng 2 Hàm lượng MDA trong các mẫu gan chuột khác nhau
STT

Hàm lượng MDA(*)
1
1
0,164
2
ị
0.208
3 0,209
18
4 0,180
5
0,190
6
0,160
7
0,163
_ 8
___
0 , 2 1 0
TB
0,185±0,018
SSTĐ
9,7%
(*)Đơn vị MDA biểu diễn theo mật độ quang
Vậy sai số sinh học của phươns pháp đo là 9.7c"(. Kết quả nàv phù hợp
với các tác siả trước đã làm.
3.2.1.1.2. Kết quả kiểm tra mô hình thí nghiệm
Nhiều tài liệu công bố dùne mô hình CCỊị tiêm cho chuộí thì lượns gốc
tự do tăng cao, làm che) quá trình POL tăns: mạnh mẽ. chúns tôi tiến hành
kiếm tra lại mỏ hình này với 2 lô chuột. Lô 1 để nguyên, lô 2 tiêm 0,1 ml duns’

dịch CC14 ICKí tron ° dầu thực vật, xác định MDA theo phưừn.s pháp đã nêu.
Kết quả trình bày ờ bản 2 3.
Bảng 3: Sự thay đổi hàm lượng MDA khi tiém CC14
STT
Hàm lượng MDA1* 1
Lô chứng
Lô thử
ỉ
\ 0,152 0,290
2 0,152
0,270
3 0,179
0,253
4
0,164
0,251
5
0,208 0,244
6
0,209
0,209
19
7
0,190 0 , 2 1 0
8
0 , 2 1 0 0 , 2 1 2
TB
0,183±0,021 0,242±0,025
%
1 0 0 132

(*)Đơrt vị MDA biểu thị theo mật độ quang
Vậy khi tiêm CC14 liều 0,5g/kg cân nặng cho chuột thì giá trị hàm lượng
MDA ở lồ thử đã tăng 32% so với lô chứng (p<0,01).
3.2.1.2. Kết quả khảo sát phương pháp đo G SH
3.2.I.2.I. Xây dựng đường chuẩn GSH
Để đánh giá sự thay đổi hàm lượng GSH ở gan chuột, trước tiên chúng
tôi xây dựng đường chuẩn theo phương pháp thêm chuẩn.
Tiến hành: - Pha duns dịch GSH chuẩn ở các nồnơ độ 10, 20, 30, 40, 50 và
60jicg/lml.
- Chuột thí nshiệm, giết lấy gan làm homosenat theo phương pháp
đã nêu, sau khi ly tâm. hút vào 7 ốnỉỊ nghiệm mỗi ống 4ml rồi thêm lần lượt
lml dung dịch GSH chuẩn các non? độ trên (được duns dịch B). Từ duníỊ dịch
B hút chính xác lấy 0,5ml. thêm 4,5ml thuốc thử Ellman. để 2 phút ở nhiệt độ
phòng sau đó đo mật độ quang. Kết quả thu được ở bảng 4.
Bảng 4
STT
Lượng GSH thêm vào (ụg)
D
1 0 0,356
2
1 0,427
3
2
0,475
4 3
0,530
5 4
0,604
6 5
0,653

7 6
0,735
XO
Từ bans 4 chúns tôi tính được lượng GSH nền (trong 0,5ml) là
5,8j.icg/ml Do đó sự liên quan oiữa mật độ quang và hàm lượng GSH như sau:
Hàm lượng GSH (jLie)
5,8
6 , 8
7,8 8 , 8
9,8
1 0 , 8 1 1 , 8
Mật độ quang (D)
0,356
0,427
0,475
0,530
0,604
0,653 0,735
Xừ lý kết quả theo phương pháp bình phương tối thiểu, chúng tôi có sự
liên quan siừa mật độ quane và hàm lưọng GSH theo phương trình:
y = 0,06136x + 0,00006
tronu dó: y - Mật độ quane (D)
X - Nồng độ GSH (,Lig/ml) Với hệ số tưưng quan r = 0,998.
Như vậy ui LÌ a hàm lượtm GSH và mật dộ-quanií có sự tương quan chặt chẽ.
Biêu diễn kôt quã trên đổ thị chúng tôi thu được hình 1.
Hình 1. Sự tương quan giữa mật độ quang và hàm lượng GSH
21