Ảnh hưởng của thuốc chống viêm phi steroid và hoạt chất chống viêm cây kim ngân đối với màng hồng cầu

BỘ Y TẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
sĩí* 'Jd* *Ẳf ^Ằif
rỊ^ rỊ^ 0^ 0^ 0^ 0Ỵ\ 0Ỵ% *T^
NGUYỄN THỊ THƯƠNG THƯƠNG
ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC CHÔNG VIÊM
PHI STEROID VÀ HOẠT CHAT CHốNG VIÊM CÂY
KIM NGÂN ĐỐI VỚI MÀNG HổNG CẦư
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001-2006)
Người hướng dẫn: Ths.Lê Thị Diễm Hồng
Nơi thực hiện: Bộ môn Sinh hóa
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian: Tháng 02/2006 đến 05/2006
i ' Ầ ỹ ị i m
. l i ' “ '
. , tì •
'L
Hà Nội, tháng 05 năm 2006.
M Ẵ i
LỜI CẢM ƠN
Để CÓ được kết quả ngày hôm nay, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu
sắc nhất tới GS. TS Nguyễn Xuân Thắng - Chủ nhiệm bộ môn Sinh
hóa và Th.s Lê Thị Diễm Hồng - Giảng viên bộ môn Sinh hóa Trường
Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đd tôi trong suốt
quá trình học tập và làm khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo đặc biệt
các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên Bộ môn Sinh hóa Trường
Đại học Dược Hà nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi hoàn thành tổt khóa luận này. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới
Khoa lưu máu Bệnh Viện Việt Đức đã tạo điều kiện cho tôi trong thời
gian làm khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân
và bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đd và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Nguyễn Thị Thương Thương
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN

3
1.1. Cơ sở lý thuyết về YÌêm 3
1.1.1. Nguyên nhân gây viêm 3
1.1.2. Phân loại viêm 3
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm 4
1.1.4. Các chất trung gian hóa học tham gia vào quá trình viêm

6
1.2. Một sô nghiên cứu về màng 8
1.2.1. Tầm quan trọng của màng tế bào 8
1.2.2. Cấu trúc màng tế bào 9
1.2.3. Cấu trúc của màng tế bào hồng cầu 11
1.3. Các thuốc chống viêm
11
1.3.1. Các thuốc chống viêm Steroid 11
1.3.2. Thuốc chống viêm phi Steroid 12
1.4. Dược liệu có tác dụng chống viêm 13
1.4.1. Vài nét về dược liệu chống viêm 13
1.4.2. Vài nét về Flavonoid 13
1.4.3. Vài nét về Saponin 14

1.4.4. Cây kim ngân 16
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 19
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 19
2.1.2. Thiết bị dụng cụ 22
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm 22
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 22
2.1.5. Phương pháp xử lý số liệu
24
2.2. Kết quả và nhận xét 24
2.2.1. Định tính flavonoid 24
2.2.2. Định tính saponin 25
2.2.3. Ảnh hưởng của các thuốc chống viêm phi steroid đối với màng
hồng cầu 26
2.2.4. Ảnh hưởng của hoạt chất chống viêm cây Kim ngân (Lonicera
japónica Thunb., Caprỉpholiaceae) đối với màng hồng cầu

28
2.3. Bàn luận 37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EDRF Endothelium-Derived Relaxing Factor
<Yếu tố dãn cơ có nguồn gốc từ nội mô>
LFA Leukocyte factor of adhension <Các phân tử dính>
NSAIDs Non-Steroid anti-inflammatory drug
<Thuốc chống viêm phi steroid)
PGI2 Prostaglandin Ej
IL Interleukin
ADP Adenosin diphosphat

TNF Tumor necrosis factor <Yếu tố hoại tử u>
PAF Platelet activating factor <Yếu tô hoạt hóa tiểu cầu>
cox Cyclooxygenase
ĐẬT VÂN ĐỂ
Viêm là một quá trình bệnh lý đã được phát hiện từ rất lâu, nó xuất
hiện trong nhiều bệnh khác nhau. Tuy viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể
nhưng nếu viêm kéo dài có thể ảnh hưỏỉng tới sức khỏe thậm chí đe dọa tính
mạng con người.
Ngay từ những ngày xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng các nguồn dược
liệu phong phú trong thiên nhiên để điều trị bệnh viêm và cho hiệu quả tương
đối tốt. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, hàng loạt các thuốc chống
viêm ra đời, dựa vào cấu trúc người ta phân làm hai nhóm lớn là thuốc chống
viêm steroid và thuốc chống viêm phi steroid (NSAIDs). Tuy hiệu quả chống
viêm của các thuốc này tương đối cao nhưng qua thực tế điều trị đã phát hiện
ra nhiều tác dụng không mong muốn: loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo
dài Do đó xu hướng điều trị bệnh viêm bằng cách sử dụng nguồn dược liệu
sẵn có trong thiên nhiên hiện đang được ưu tiên.
Theo kinh nghiệm dân gian, việc sử dụng cây Kim ngân trong các
trường hợp viêm là rất có hiệu quả. Ngày nay, với các phương tiện khoa học
kỹ thuật hiện đại, các nhà khoa học đã tìm ra hai chất chính có trong cây Kim
ngân
là Aavonoid: Scolymosid và saponin: Loniceroside c. Tuy cơ chế chống
viêm của hai chất này chưa được hiểu thật sâu sắc nhưng có nhiều công trình
nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh về tác dụng chống viêm.
Nghiên cứu bệnh học của quá trình viêm người ta thấy trong quá trình
viêm xuất hiện nhiều chất trung gian hóa học như prostaglandin, leukotrien,
histamin Các chất này có tác dụng thúc đẩy và duy trì tình trạng viêm.
Nguồn gốc của các chất này là từ tế bào, lysosom, bào tương, hồng cầu, bạch
cầu vì các chất trung gian này chỉ có thể được giải phóng khi tế bào bị tổn
thương hoặc chết, do đó màng tế bào có vai trò hết sức quan trọng.

Tế bào hồng cầu có vai trò chính là vận chuyển oxy. Trong quá trình
viêm nếu màng tế bào hồng cầu bị phá hủy sẽ dẫn tới tình trạng thiếu oxy tại
chỗ gây ra các rối loạn chuyển hóa nghiêm trọng, tổn thương tổ chức và viêm
phát triển toàn diện. Do đó màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng đối
với quá trình viêm. E.Myles Glenn, Barbara J.Bowman và T.C.Koslowske đã
sử dụng màng hồng cầu để nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc chống
viêm phi steroid. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của
hoạt chất chống viêm chiết xuất từ cây Kim ngân (Aavonoid và saponin) đối
với màng hồng cầu.
Đê tài được thực hiện nhằm một sô mục tiêu sau:
> Nghiên cứu ảnh hưởng của NSAIDs: Aspirin và Indomethacin đối
với màng hồng cầu trên invitro.
> Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất chống viêm cây Kim ngân đối
với màng hồng cầu trên invitro.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Cơ sở LÝ THUYẾT VỂ VIÊM.
Theo Ado (1973), viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu, tổ
chức liên kết và hệ thần kinh đối với tác nhân gây bệnh và có liên hệ với tính
phản ứng của cơ thể [10, 3].
Theo Vũ Triệu An, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền tảng
là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần
trong quá trình tiến hoá của sinh vật [5, 202-203].
1.1.1. Nguyên nhân gây viêm.
Các nguyên nhân dẫn đến tổn thương và làm chết một lượng tối thiểu tế
bào tại chỗ đều có thể gây viêm tại chỗ đó. Nguyên nhân gây viêm gồm:
* Nguyên nhân bên ngoài:
- Tác nhân sinh học: Là nguyên nhân phổ biến nhất gồm: virut, vi khuẩn,
ký sinh trùng, đơn bào, đa bào hay nấm
- Tác nhân lý hóa học: Chấn thương do va đập, vết thương kể cả vết
thương vô khuẩn, bỏng nóng hoặc bỏng lạnh, acid mạnh, kiềm mạnh

* Nguyên nhân bên trong:
- Thiếu oxy tại chỗ, hoại tử tổ chức, tắc mạch, xuất huyết, rối loạn thần
kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch).
- Thay đổi nội sinh của các chất gian bào, hình thành phức hợp miễn dịch
kháng nguyên - kháng thể, sinh sản ung thư [5, 202-203], [7, 6-8].
1.1.2. Phân loại viêm.
- Theo nguyên nhân: viêm nhiễm khuẩn và viêm vô khuẩn.
- Theo vị trí; viêm nông, viêm sâu hoặc viêm bên ngoài và viêm bên trong.
- Theo dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ
- Theo diễn biến; Viêm cấp và viêm mạn.
- Theo tính chất: Viêm đặc hiệu và viêm không đặc hiệu [5, 202-203].
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.
Khi quá trình viêm xảy ra, tại ổ viêm và trong cơ thể xảy ra nhiều phản
ứng theo các giai đoạn khác nhau được tóm tắt ở hình 1.1.
QUÁ TRÌNH VIÊM
( Xâm nhập các tác nhân gây viêm)
PHẢN ÚNG TẠI CHỖ
Giãn nở thành mạch
Giảm lưu lượng mao mạch
Tăng độ nhớt máu, rò rỉ nội mô
Ngưng tụ hồng cầu, đông vón tiểu cầu
Giải phóng các chất trung gian hóa học
Hình thành cục máu đông
Tích tụ fibrin và lắng cặn
Tích tụ BC trung tính, lympho
Tăng thực bào, phá hủy mô
Tăng enzym huyết thanh
Giải phóng lysosom bào tương
Tăng sinh và phì đại nội mô
PHẢN ỨNG HỆ THỐNG

Tăng thân nhiệt, đau
Tăng bạch cầu hạt
Tăng Lympho bào
Tăng ESR, tăng fibrinogen
Tăng Protein c hoạt hóa
Tăng a,p,y globulin
Giảm albumin
Giảm sắt, tăng đồng
Tăng glycoprotein
Tăng mucoprotein
GIAI ĐOẠN TOÀN THỂ
TẾ BÀO CHẾT VÀ HOẠI TỬ
PHỤC HỔI
THOÁT DỊCH MÀNG TÊ BÀO
(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưõng bào, màng trong bào tương)
Hình 1.1. Các phản ứng tại chỗ và hệ thống của quá trình viêm [26, 28].
*1* Phản ứns tuần hoàn'. [10, 5], [5, 204],
Phản ứng này thường xảy ra rất sớm, dễ thấy ngay khi tác nhân gây viêm
xâm nhập vào cơ thể, và phát triển với mức độ khác nhau tùy thuộc vào mức
độ tổn thương của mô. Các phản ứng này diễn ra theo trình tự sau:
- Co mạch chóp nhoáng: xảy ra sớm và ngắn, có tính phản xạ tại các tiểu
động mạch do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn được kích thích.
- Sau co mạch là hiện tượng giãn mạch. Ban đầu là các tiểu động mạch,
sau đó là mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng lưu lượng máu và áp lực
máu tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và
đỏ) và đưa các bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ.
- Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn đến các rối loạn nghiêm trọng
như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành
mạch dẫn tới làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô xung quanh
huyết quản gây phù. Do sự chèn ép của của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố

của mạch máu như liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mô sưng to, hình thành
huyết khối, tăng độ nhớt máu dẫn tới ứ máu ở ổ viêm khiến yếu tố gây bệnh
không thể lan rộng, làm mất tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch gây thiếu
oxy dẫn tới rối loạn chuyển hóa nghiêm trọng, làm tổn thương tổ chức do đó
quá trình viêm phát triển toàn diện (Biểu hiện lâm sàng là phù và đau) [10, 5].
Phản ứns tê bào:
Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể chống
lại quá trình viêm. Trong đó vai trò của bạch cầu vô cùng quan trọng. Hoạt
động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng kế tiếp nhau:
* Bạch cầu thoát mạch :
Do tốc độ tuần hoàn chậm lại các bạch cầu rời khỏi dòng trục tiến về
thành mạch, bám vào nội mô và dừng lại tại một điểm gọi là vách tụ bạch cầu.
Dưới tác động của các chất trung gian hóa học như: yếu tố hoại tử u (TNF),
interleukin- 1 (IL-1), yếu tố giãn mạch prostaglandin (PGI2), yếu tố giãn cơ
nguồn gốc từ nội mô (EDRF), làm cho các phân tử dính (LFA, M 0| ’ Pl5o)
được hoạt hóa làm tăng khả năng bám dính của bạch cầu vào các tế bào nội
mô. Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu di chuyển nhẹ nhàng dọc theo
bề mặt nội mô, tìm các khe hở rồi luồn các chân giả xuyên qua tế bào nội mô
5
để xen vào giữa tế bào nội mô và màng đáy, từ đó đi vào khoảng gian bào
ngoài mao mạch [19, 351-354] [3, 139-140].
Hiện tượng bạch cầu di chuyển tới ổ viêm được gọi là hiện tượng hóa ứng
động. Hiện tượng này xảy ra do sự có mặt của các chất gây hóa ứng động tại ổ
viêm: Các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có các acid amin tận cùng là N-
formyl-methionin), các thành phần của hệ thống bổ thể bị hoạt hóa (C3a, C5a,
C5b, Q , C7), các sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic theo con đường
lipoxygenase hóa, các cytokin, mảnh vụn sợi tạo keo và các sản phẩm phân
hủy tế bào, fibrin và các sản phẩm phân hủy của fibrin [3, 141-142].
* Hiện tượng thực bào và mất hạt
Thực bào là khả năng thu hút và tiêu hóa những vật sống hay những

mảnh trơ của các tế bào. Tại ổ viêm bạch cầu được hoạt hóa khi đó khả năng
thực bào của chúng tăng lên rõ rệt. Quá trình thực bào diễn ra như sau: Ban
đầu bạch cầu tiếp cận, nhận dạng và bao vây đối tượng thực bào. Sau đó chúng
tiêu diệt hoặc phân hủy các đối tượng thực bào nhờ các enzym thủy phân có
trong lysosom, hiện tượng này gọi là hiện tượng bạch cầu mất hạt dần.
1.1.4. Các chất trung gian hóa học tham gia vào quá trình viêm.
Các chất trung gian hóa học tham gia vào quá trình viêm có nguồn gốc
từ huyết tưofng, tế bào và tổn thương mô ngay sau các tác động ban đầu và
trong suốt quá trình viêm, nó duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm. Bao gồm:
a. Các amìn hoat mach:
- Histamin là dẫn chất của histidin, một acid amin có trong nguyên sinh
chất tế bào. Khi tế bào bị thoái hóa, histidin bị khử carboxyl và giải phóng ra
histamin. Histamin còn được dự trữ trong các hạt và được giải phóng do sự
mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích: Tổn thương vật lý,
phản ứng miễn dịch gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn bổ thể được coi là
độc tố gây phản vệ (C3a và C5a), các protein giải phóng histamin xuất phát từ
bạch cầu, các neuropeptid, các cytokin (IL-l,IL-8). Histamin gây giãn các tiểu
động mạch và tăng tính thấm thành mạch của các tiểu tĩnh mạch.
- Serotonin có tác dụng tương tự histamin được giải phóng ra từ tiểu cầu
bị kích thích khi kết dính với các sợi keo, ADP, các phức hợp kháng nguyên -
kháng thể hoặc dưới tác động của chất hoạt hóa tiểu cầu (PAF) [7, 82-84].
b. Các protease của huyết tươns:
Hệ thống bổ thể trong đó đáng chú ý nhất là các thành phầii C3a và C5a
có tác dụng làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch do giải phóng
histamin từ các dưỡng bào. Ngoài ra C5a còn hoạt hóa đường chuyển hóa
lipooxygenase của acid arachidonic ở bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu
đơn nhân gây giải phóng tiếp các chất trung gian hóa học của viêm. Đồng thời
C5a còn là tác nhân hóa ứng động mạnh đối với các bạch cầu [10, 9-10].
Hệ thống đông máu và tiêu fibrin; Hệ thống đông máu là một loạt những
protein của huyết tương có thể bị hoạt hóa bởi các yếu tố Hageman. Quá trình

kết thúc bằng sự chuyển fibrinogen thành fibrin dưới tác động của thrombin.
Trong quá trình đó các fibrinopeptid được hình thành gây tăng tính thấm
thành mạch và có hoạt tính hóa ứng động đối với bạch cầu [7, 85-86].
Bradykinin, gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch, được giải
phóng từ a2-glubolin khi hệ thống kinin bị hoạt hóa dưới tác dụng của yếu tô
Hageman.
c. Các chất chuyển hóa của acid arachỉdonic.
Acid arachidonic được giải phóng ra từ phospholipid màng tế bào dưới
tác dụng của hai enzym là phospholipase A2 và diglyceridlipase. Các chất
chuyển hóa của acid arachidonic bao gồm prostaglandin, prostacyclin,
thromboxan (chuyển hóa theo con đường cyclooxygenase) và leucotrien
(chuyển hóa theo đường lipooxygenase). Trong đó PGE2 có tác dụng làm tăng
tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác gây tăng tính thấm thành
mạch và gây đau, prostacyclin và thromboxan có vai trò quan trọng trong điều
hòa đông máu. Leucotrien là chất tiền viêm mạnh gây hóa ứng động bạch cầu
7
đa nhân, mất hạt và dính bạch cầu vào tế bào nội mô [7, 87-88 .
d. Yếu tô hoat hóa tiểu cầu (PAF).
PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng tế bào được sinh ra sau khi
hoạt hóa phospholipase A2 và thường được giải phóng đổng thời với các chất
chuyển hóa của acid arachidonic. PAF là một yếu tố hoạt hóa mạnh bạch cầu
đa nhân trung tính, kích thích sự dính và xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng
các enzym của thể tiêu và sinh oxy phản ứng và các eicosanoid [7, 90-91],
e. Các cvtokin.
Cytokin là những polypeptid do nhiều loại tế bào sản xuất ra đặc biệt là
lympho bào và đại thực bào bị hoạt hóa, các cytokin chính gồm các yếu tố
hoại tử u và các interleukin, chúng tham gia vào phản ứng miễn dịch tế bào và
giữ vai trò quan trọng trong phản ứng viêm. Trong viêm, cytokin gây hoạt hóa
nội mô, kích thích tổng hợp các phần tử dính của nội mô. Ngoài ra còn có tác
dụng lên bạch cầu và gây phản ứng hệ thống [7, 97-98].

f. Các sốc dẫn xuất oxv tư do.
Các gốc tự do được hình thành trong ty thể đại thực bào đã hoạt hóa có
vai trò tiêu hủy đối tượng thực bào. Trong viêm khi đại thực bào bị ly giải gây
tràn các gốc tự do ra ngoài tạo điều kiện cho quá trình peroxy hóa lipid màng
tế bào. Ngoài ra còn gây tăng tính thấm thành mạch, tạo điều kiện thuận lợi
cho sự giải phóng acid arachidonic từ phospholipid màng tế bào để tạo ra các
chất trung gian hóa học.
g. Các thành phần của lysosom.
Các hạt lysosom có trong bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn
nhân khi được giải phóng có thể tham gia vào phản ứng viêm, nó có tác dụng
phân hủy vi khuẩn và các mảnh vụn của tế bào nhờ các enzym [7, 91-92].
1.2. Một sỏ nghiên cứu về màng.
1.2.1. Tầm quan trọng của màng tế bào.
Màng chiếm khoảnu 80% khối lượng tế bào gồm; màng bào tương, màns
8
lưới nội nguyên sinh, màng ty thể, ]ạp thể, màng Golgiũ do đó màng đóng vai
trò quan trọng đối với mọi hoạt động của tế bào, chúng phân chia khu vực bên
trong tế bào thành các phần và quá trình chuyển hóa riêng, chúng là trung tâm
của quá trình chuyển hóa năng lượng và quá trình thông tin giữa các tế bào.
Nhờ có màng nên tế bào cũng như các bào quan của nó ngăn cách với môi
trường xung quanh để duy trì được chức phận riêng [13, 98].
Màng tế bào giữ vai trò quan trọng trong vận chuyển năng lượng, sinh
tổng hợp lipid, vận chuyển thông tin, sinh tổng hợp protein từ đó có tác dụng
kiểm tra và điều hòa chức phận cơ bản của tế bào như sinh sản biệt hóa, nhận
diện, di chuyển, vận chuyển qua màng [13, 98].
Trong những năm gần đây, bệnh học về màng tế bào đã được chú ý.
Dưới ánh sáng của sinh học và bệnh học phân tử của màng, người ta nhận thấy
nhiều bệnh liên quan tới chức phận của màng tế bào như: cao huyết áp, teo cơ,
dị ứng, viêm nhiễm Một trong số chúng bắt nguồn từ có chế chung đó là lầm
lỗi trong truyền đạt tín hiệu ở màng bề mặt ở mức độ phân tử. Trong quá trình

viêm màng tế bào bị phân hủy dẫn tới giải phóng các enzym từ đó giải phóng
các chất trung gian hóa học, các chất này duy trì và thúc đẩy quá trình viêm.
Do đó vai trò của màng tế bào trong viêm là vô cùng quan trọng.
1.2.2. Cấu trúc màng tê bào.
Cho đến nay người ta đưa ra nhiều mô hình về cấu trúc màng tế bào,
s. Jonathan Singer và Garth Nicolson (1972) đã đưa ra mô hình khảm động về
cấu trúc màng sinh chất và mô hình này được thừa nhận hơn cả.
- Lóp kép lipid của màng tế bào; Cấu trúc cơ bản của màng tế bào là lớp kép
lipid. Thành phần cơ bản của lipid gồm: Phospholipid, cholesterol và
glycolipid. Thành phần phospholipid có hai đầu một đầu phân cực là vùng ưa
nước hướng ra phía môi trường bên ngoài, tiếp giáp với môi trường bên trong
và phần không phân cực là vùng kỵ nước bị nước gian bào cũng như nước nội
bào đẩy nên hướng vào phía bên trong gặp nhau. Những thành phần này
thưòỉng phân phối không đều trong hai lớp của màng. Thành phần cholesterol
của màng tế bào dưới dạng este liên kết lỏng lẻo với màng, chúng có thể ảnh
hưởng đến một số chức phận quan trọng của màng như vận chuyển các chất,
dính kết và nhận diện cũng như hoạt động của một số enzym màng tế bào hay
khả năng thấm của các chất qua màng.
y n ỉ ỉ i ỉỉỉ Ỉ,'I Ỉ
/ ¡,ị:U-
Ỉ 'n ỉ ii iỉỉ .\ ir. 17 / m à ỉi'^
Hình l.l.C áu trúc mô hình khảm động màng tế bào.
Theo mô hình này cấu trúc của màng tế bào bao gồm:
- Thành phần protein gồm: Protein rìa màng nằm ở bên trong hay phía
ngoài màng trong đó các gốc acid amin ưa nước thì phô bày trên bề mặt phân
tử còn các gốc acid amin kỵ nước thì được thu dọn vào phía bên trong màng.
Thành phần thứ hai là protein xuyên màng có acid amin kỵ nước được liên kết
với nhóm kỵ nước của lipid màng, thành phần này có thể mang cực và cho
phép liên kết dễ dàng với các nhóm phân cực của lipid và protein rìa màng.
Protein xuyên màng đóng vai trò sinh học quan trọng như: protein enzym,

protein vận chuyển hay protein nhận diện của màng.
- Thành phần glucid tồn tại với một lượng rất nhỏ dưới dạng phức họp:
glycoprotein và glycolipid. Glycoprotein là những chuỗi oligosaccarid được
gọi là glycocalyx liên kết với gốc serin hay gốc treonin của chuỗi polypeptid
của protein rìa hay protein xuyên màng [17, 103-104],
10
1.2.3. Cấu trúc của màng tê bào hồng cầu.
Màng hồng cầu gồm 3 thành phần với tỷ lệ là lipid 45% protein 45% và
khoảng 10% là đường.
- Thành phần lipid: Màng hổng cầu có hai lớp lipid, lóp tiếp xúc với
môi trường bên ngoài và lófp tiếp xúc với bào tương của tế bào (lớp phía bào
tương). Thành phần phospholipid cấu tạo nên màng tế bào hổng cầu ở hai lớp
không giống nhau. Lớp phía ngoài có thành phần chủ yếu là phosphotidyl
cholin và sphingomyelin, còn lớp phía bào tương được tạo thành bởi
phospholipidamin như phosphatidyl serin, phosphatidyl ethanolamin.
Cấu trúc không cân đối của màng hồng cầu gây ra bởi sự không cân
xứng trong cách sắp xếp các nhóm có cực của phospholipid, các phần acyl và
các điện tử của chúng. Sự mất cân đối này được duy trì có thể là do sự có mặt
của các phân tử glycolipid chỉ ở phía ngoài của màng tế bào.
Glycol ipid có vai trò quyết định hoạt động của nhóm máu A, B, o và
hoạt động các chất nhận diện bề mặt đối với các độc tố của vi khuẩn.
Thành phần protein; Protein màng tế bào hồng cầu cũng có sự sắp xếp
không đều, ở lớp ngoài protein liên kết với đường tạo thành glycoprotein. Hiện
nay người ta xác định được ở màng tế bào hồng cầu có từ 8 đến 20 loại protein
trong đó 3 loại được hiểu rõ nhất là protein đỉnh 3, glycophorin và spectrin.
Ngoài ra màng hồng cầu còn có những protein và enzym khác nhưng số lượng
ít hơn như Na^, K^, ATPase, acetylcholin esterase
Hồng cầu có vai trò quan trọng là vận chuyển oxy, trong quá trình viêm
màng hồng cũng như các màng tế bào khác bị phá hủy ngoài việc giải phóng
ra các chất trung gian hóa học nó còn dẫn tới hiện tượng thiếu oxy tại chỗ gây

hoại tử và thúc đẩy quá trình viêm.
1.3. Các thuốc chống viêm.
1.3.1. Các thuốc chống viêm Steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc gần giống với hormon glucocorticoid của vỏ
1 1
thượng thận. Cơ chế chống viêm là do ức chế phospholipase A2 thông qua kích
thích tổng hợp lipocortin do đó ức chế tổng hợp acid arachidonic từ
phospholipid màng tế bào dẫn tới ức chế tổng hợp leucotrien và prostaglandin.
Tuy hiệu quả chống viêm cao nhưng thực tế điều trị các thuốc này bộc lộ
nhiều tác dụng không mong muốn như: ức chế miễn dịch, xốp xương, hội
chứng suy thượng thận khi ngừng sử dụng thuốc đột ngột, loét dạ dày tá tràng,
các bệnh về xương, phù, tăng huyết áp, chậm phát triển ờ trẻ em [2, 258].
Hìnhl.3. Cơ chế tác dụng chống viêm của các thuốc chông viêm
steroid và phỉ steroid
1.3.2. Thuốc chông viêm phỉ steroid (NSAIDs).
Thuốc có tác dụng chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid, ngoài ra
còn có tác dụng hạ nhiệt giảm đau ngoại vi. Cơ chế chống viêm: là do ức chế
enzym cyclooxygenäse (COX), ngăn cản qúa trình tổng hợp các prostaglandin
và thromboxan từ acid arachidonic, đó là các chất trung gian hóa học tham gia
vào quá trình viêm do đó có tác dụng chống viêm. Gần đây người ta thấy cox
có các isoenzym là COXl và C0X2. Trong đó COXl có nhiều ở các tế bào
lành, tham gia vào quá trình tổng hợp prostaglandin E2 và prostaglandin I2 cần
cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan trong cơ thể như bảo vệ
12
thận và dạ dày. Còn COX2 chỉ xuất hiện tại các tổ chức bị tổn thưoíng, có vai
trò tạo ra các prostaglandin gây viêm. Các thuốc chống viêm phi Steroid
không chọn lọc tác dụng lên cả COXlvà COX2 do đó gây ra nhiều các tác
dụng không mong muốn: loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [10, 11-
12], [2,232-2331.
Ngoài ra các thuốc chống viêm phi Steroid còn có tác dụng đối kháng với

hệ enzym phân hủy protein, ngăn cản quá trình biến đổi protein làm vững bền
màng lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hóa học như
bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hóa hướng động bạch cầu, ức chế sự di
chuyển của bạch cầu tới ổ viêm [2, 232-233].
1.4. Dược liệu có tác dụng chống viêm.
1.4.1. Vài nét về dược liệu chống viêm.
Bằng kinh nghiệm, ngay từ xa xưa ông cha ta đã biết đã khai thác nguồn
tài nguyên cây thuốc cực kỳ phong phú trong thiên nhiên để dùng trong các
bài thuốc cổ truyền điều trị viêm. Rất nhiều loài cây quen thuộc như bồ công
anh, ké đầu ngựa, kim ngân hoa, cúc hoa đã được sử dụng theo kinh nghiệm
dân gian, vừa mang lại hiệu quả tốt, lại rất ít tác dụng phụ và độc tính, đặc biệt
là dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số các vị thuốc này đều thuộc nhóm thanh nhiệt giải
độc và thường được sử dụng trong các trường hợp mụn nhọt, mẩn ngứa, ban
sởi, mày đay Người ta chưa hiểu một cách tưòfng tận cơ chế tác dụng của các
vị thuốc này, tuy nhiên thực tế điều trị và một số nghiên cứu thử nghiệm đã
cho thấy hiệu quả chống viêm cao và rất ít tác dụng không mong muốn.
Các nghiên cứu khảo sát về nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc đã cho thấy
đa số vị dược liệu có chứa flavonoid và một số có chứa saponin, các chất này
đã được chiết tách phân lập và chứng minh về tác dụng chống viêm.
1.4.2. Vài nét vê flavonoid.
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bô rộng rãi trong thiên
nhiên, nó có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây. Hiện nay người ta đã xác
13
định được cấu trúc và tính chất của khoảng 3000 hợp chất flavonoid.
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học và
được ứng dụng trong thực tế để điều trị. Các flavonoid có tác dụng sinh học
gọi là bioflavonoid. Một số tác dụng sinh học của flavonoid có thể kể đến:
- Flavonoid có tác dụng làm vững bền thành mạch, điều hòa làm giảm
tính thấm thành mạch, chống lại hiện tượng thoát dịch ra khỏi lòng mạch. Tác
dụng này là do flavonoid làm mất hoạt tính của enzym O-methyl transferase,

enzym thủy phân adrenalin nên kéo dài tác dụng co mạch của adrenalin.
- Flavonoid có tác dụng triệt tiêu các gốc tự do do khi vào cơ thể nó sinh
ra các gốc tự do bền vững và ít hoạt động hơn so với các gốc tự do sinh ra
trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa ). Do đó các ílavonoid
có tác dụng chống viêm, ngăn chặn quá trình hủy hoại cấu trúc và tế bào gan,
ngăn chặn sự hoại tử mô gan và sự phân hủy phospholipid màng tế bào.
Flavonoid có tác dụng làm ổn định màng tế bào, loại trừ các tác nhân gây độc
hại, làm giảm quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào.
- Flavonoid có tác dụng ức chế enzym cycloxygenase và 5-lipoxygenase,
ức chế quá trình tổng hợp các chất trung gian hóa học gây viêm như
prostaglandin và leucotrien do đó có khả năng chống viêm.
- Flavonoid có khả năng hoạt hóa enzym histaminase, do đó ức chế giải
phóng histamin và các chất trung gian hóa học khác có trong viêm nhiễm, dị
ứng và choáng phản vệ. Flavonoid có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối
u, kìm hãm hoạt tính của enzym oxy hóa khử, kìm hãm sự tổng hợp protein
trong các tế bào ung thư.
- Một số flavonoid có tác dụng làm giảm nhiễm trùng, ở liều cao có khả
năng làm mất hoạt tính của virus do tác dụng chống sao chép [10, 16-18].
1.4.3. Vài nét về Saponin [11, 170-184].
Saponin là một loại glycosid tự nhiên thường gặp trong thực vật, một số
động vật cũng chứa saponin như các loài hải sâm, cá sao. Cho đến nay người
14
ta đã tìm ra khoảng hơn 500 loài thuộc 80 họ thực vật có chứa saponin.
Saponin có trong hầu hết các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt ).
Tính chất đặc trưng của saponin là hiện tượng tạo bọt và hiện tượng phá
huyết. Đây cũng là hiện tượng đặc trưng để xác định sự có mặt của các
saponin. Hiện tượng phá huyết chính là sự phá vỡ màng hồng cầu, saponin
làm vỡ màng hồng cầu ngày ở nồng độ loãng. Nguyên nhân gây ra hiện tượng
phá huyết chưa được giải thích rõ ràng, có giả thiết cho rằng sự phá vỡ màng
hồng cầu có liên quan đến tới sự tạo phức với cholesterol và các este của

cholesterol trên màng hồng cầu, tuy nhiên sự tạo phức với cholesterol và este
của chúng không tỷ lệ thuận với chỉ số phá huyết nên người ta cho rằng phải
xét đến ảnh hưởng trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Tuy nhiên
người ta thấy rằng khi thêm cholesterol thì hiện tượng phá huyết bị kìm hãm.
Saponin là một loại glycosid có nhiều tác dụng sinh học, một số tác
dụng có thể kể đến là:
- Tác dụng chống viêm của saponin đã được chứng minh trên thực
nghiệm, điển hình là glycyrrhizin có trong cam thảo đã được ứng dụng trong
thực tế để chữa viêm. Trong một số trường hợp thí nghiệm trên súc vật cho
thấy tác dụng của glycyưhizin bằng 1/5 hydrocortison.
- Tác dụng kháng khuẩn và chống nấm, người ta thấy rằng sự có mặt
của saponin trong cây có tác dụng bảo vệ cây chống lại sự xâm nhập của nấm
mốc. Tác dụng kháng nấm thay đổi trong một giới hạn rất rộng phụ thuộc vào
cấu trúc của saponin và chủng loại nấm. Các saponin steroid có tác dụng
chống nấm mạnh hơn triteipenoid.
- Tác dụng kháng khuẩn của saponin cũng đã được khẳng định,
asiaticosid, một saponin có trong rau má có tác dụng kháng trực khuẩn Koch
và trực khuẩn Hansen, trước đây đã được sử dụng để chữa bệnh hủi. Tác dụng
này được lý giải là do saponin làm tan màng sáp của vi khuẩn.
- Sapnonin có tác dụng tăng tính thấm của màng tế bào, sự có mặt của
15
saponin làm cho các chất khác dễ hòa tan và tăng hấp thu.
- Một số tác dụng khác: tác dụng chống khối u, long đờm chữa ho, tác
dụng trên hệ thần kinh trung ương, hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng đã
được gây tăng đường huyết bằng glucosa huyết, ngoài ra còn có tác dụng làm
giảm mức ị3-lipoprotein, chống tăng lipid máu, chống phân giải protein
1.4.4. Cây kim ngán
a.Sơ lươc vé cây kim nsán
Tên khoa học: Lonicera japónica Thunb. thuộc họ l^im ngân Caprifoliaceae.
Tên khác; Dây nhẫn đông.

Bộ phận dùng:
- Hoa kim ngân (Flos Lonicerae) là hoa phơi hay sấy khô của cây k^im ngân.
- Cành và lá kim ngân (Caulis cum folium Lonicerae) là cành và lá phơi hay
sấy khô của cây l<íim ngân.
Thành phần hóa học:
- Cây chứa tanin và một saponin triterpenoid là Lonicerosid c có cấu tạo là:
3-ỡ-P-D-glucopyranosyl hederagenin 28-ớ-a-L-rhamnopyranosyl (1-^2)- [P-
D-xylopyranosyl (1-^6)]- P-D-glucopyranosyl ester.
- Hoa chứa một flavonoid là scolymosid (lonicerin) có cấu tạo luteolin-7-
16
rutinosid, một số carotenoid ((p-caroten, P-cryptoxanthin, auroxanthin).
- Lá chứa loganin.
\
■I !
OH
Rutinose-0
'c =0
CH,
' 0 ° / cH,OH , o Ỹ
OH OH ■ O H ;
oh" I
OH OH
CH,
OH OH
Loniceroside c
o
OH
OH
OH o
Scolymosid

b. Tác duns dươc lý của cây kim nsân:
- Tác dụng kháng khuẩn: Kim ngân có phổ kháng khuẩn rất rộng, nước sắc
hoa kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với liên cầu khuẩn, tụ cầu
khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trực khuẩn Shigella, trực khuẩn coli, phế cầu
khuẩn. Nước sắc lá kim ngân với nồng độ 1,2-20% có tác dụng ức chế trực
khuẩn Shigella, 5-20% ức chế vi trùng phó thương hàn A, 100% ức chế tụ cầu
khuẩn.
- Tác dụng trên chuyển hóa chất béo; Kim ngân hoa có tác dụng tăng cường
chuyển hóa chất béo. ^ ■,
/ [ m o ị o ì \
t / - 1 2 4 |'
17
\
M i:
- Tác dụng trên đường huyết: Đỗ Tất Lợi đã trích dẫn một số tài liệu nghiên
nghiên cứu vế Kim ngân Lonicera japónica Thunb. cho biết khi cho thỏ uống
nước sắc hoa kim ngân thì lượng đường huyết tăng, hiện tượng này kéo dài 5-6
h mới trở lại bình thường.
- Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ: Nước sắc kim ngân có khả năng
ngăn ngừa choáng phản vệ trên chuột lang. Khi cho chuột lang uống nước sắc
kim ngân, không có sự thay đổi đáng kể số lượng tế bào hạt (mastocyte) ở
màng treo ruột của các súc vật này. Hàm lượng histamin ở phổi chuột lang bị
choáng phản vệ lớn hơn 1,5 lần chỉ sô này ở chuột lang bình thường hoặc ở
chuột đã được uống nước sắc kim ngân trước khi gây choáng phản vệ.
- Lonicerosid C: Năm 2003 Wie Jong Kwar và cộng sự đã phân lập và xác
định được cấu trúc của saponin này bằng cách sử dụng kỹ thuật phổ và sự biến
đổi hóa học, đồng thời cũng chứng minh được tác dụng chống viêm, chống lại
chứng phù tai chuột gây bởi dầu croton trên in vivo. Cùng năm, J.Tae và cộng
sự cũng chứng minh được tác dụng chống phù chân do chất dẫn truyền
receptor 2 kích hoạt proteinase.

- Độ độc: Khi cho chuột nhắt trắng uống nước sắc kim ngân trong thời gian
7 ngày với liều gấp 150 liều điều trị cho người (Tính theo gam thể trọng),
không có sự thay đổi đáng kể trong phủ tạng và không có con nào bị chết.
Điều này chứng tỏ rằng nước sắc kim ngân thực tế không độc.
c. Côns duns và liều dùns:
+ Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày đay, lở ngứa, nhiệt
độc, tả, lỵ, ho do phế nhiệt. Người ta còn dùng kim ngân trị dị ứng (viêm mũi
dị ứng và một số trưòng hợp dị ứng khác) và trị thấp khớp [16, 109].
+ Liều dùng: Ngày dùng 4-15 g hoa hay 10-16 g cành lá dưới dạng thuốc
sắc, hãm, cao, rượu thuốc hoặc hoàn tán. Có thể dùng riêng kim ngân hay phối
hợp với nhiều vị thuốc khác [6, 633J, [ 12 ,15-11],
18
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u .
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu.
a. Kim ngân hoa.
Kim ngân hoa là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân: Lonicera
japónica Thunb. thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.
b. Kim ngân cuộng.
Kim ngân cuộng là thân, cành, lá của cây kim ngân: Lonicera
japónica Thunb. thuộc họ kim ngân Caprifolỉaceae.
Toàn bộ cây kim ngân được thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang,
huyện Văn Lâm Tỉnh Hưng Yên và được bộ môn Thực vật trường Đại học
Dược Hà Nội định tên khoa học. Nguyên liệu sau khi thu hái được loại tạp sơ
bộ, phơi nơi râm mát và sấy ở nhiệt độ 50-60”C đến khô.
c. Flavonoid kim ngân hoa toàn phần.
Dịch chiết flavonoid toàn phần từ kim ngân hoa dùng trong nghiên cứu
được chiết tách theo quy trình sau: Dược liệu được sấy ở 50-60®C trong tủ sấy
một giờ, tán nhỏ thành bột. Sau đó cân 500g bột dược liệu, chiết hổi lưu cách
thủy bằng cồn 80® (1,51 X 3 lần). Gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi dung môi

đến khi còn khoảng 50% thì cô cách thủy lấy cắn. Hòa tan cắn trong 500 ml
nước cất, lọc loại tạp. Dịch lọc cho vào bình gạn lắc với ether dầu hỏa đến khi
không còn màu. Dịch chiết nước đem đun cách thủy 15 phút để loại bỏ hết
ether. Tiếp tục chiết bằng cloroform trên bình gạn đến khi dịch chiết
cloroform không còn màu. Đun cách thủy dịch chiết nước 15 phút để loại hết
cloroform. Dịch chiết nước cho vào bình gạn, chiết bằng ethyl acetat nhiều
lần, gộp các dịch chiết ethyl acetat lại cô cách thủy cho hết duns, môi ethyl
acetat, thu được cắn flavonoid toàn phần. Quy trình được mô tả theo hình 2 .1.
19
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết táchßavonoid toàn phần từ kim ngân hoa
20