Nghiên cứu độc tính bán cấp của dẫn xuất artemisinin gắn fluor ở động vật thực nghiệm

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
t r ự Ạ g j h ị íịặ n g
lỈỊ ‘cỊ
,V' I*' ì
NGHIÊN cúu
BÁN CẤP CỦA
DẪN XUẤT ARTEMISININ GẮN FLUOR ở DỘNG VẬT
■ ■
THỰC NGHIỆM
■ ■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợc s ĩ KHOÁ 2001 - 2005)
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Trường
TS. Trương Văn Như
Nơi thực hiện: VIỆN SR - KST - CT TRUNG ƯƠNG
Thời gian thực hiện: 2/2005 - 4/2005
HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2005
ì í m
Q c À M Ơ Q l
OlhảẽL d ịf t kẨứưt thòưih Uhỡéi LuÁn tấ t ểLạídệftf
æÙL b ò jf tẢ lÌM ig. k ú i h ÚỈL b i ê í a â h ẹ ư i i ê i ÇîS^,
QỈjạAijụẪềL (XjuâiL Q'ifttòfiạ,f ÇÎS^. Çîv^d^iq. (Dă^L Q lh u lỈL k a i
nạẪtòi útầự, đ ă trự e m ịt hưêi^ig. dẫễ^i giúfL đẽ^ £jrwL kíỳăễL
ih à n lt Uhiỳú. lu ãtL , Ò m æÙL c h ă n ikiư tÍL ecưn. ổfL lùỀsL S(J¿
• •
3CSÇÎ - tn u iạ - ưjổníỊ. đjỄL tạLi% đỉỀLL UiềĩL ũ ề e đ Ãjâ o ú i
châí^ ÌMĩ^ưig. t h i â b if d iư ig. eiJi OỈL đỗ4^iạ- ữ ú l (th À ) ehẨ% í^n
làm . Uhúă iíiậ n .
Qủng. n h á tt ílịp. iiMMf eMi xitL dujç^ (ĩăụ^ iÀ Làftg. lùeJt
đểL tớ i eÚA thÂiỊ. giáj^f eầ qiáo^ đ ã dạụ, d ẫ tồ i tí^ iạ , 3ÂjjỐt
€ịAijCL trh th h ợe tộfL tụ i trưè^Lg.^ xỉễL eảển đwL eáe th ầ ự eẵ

gẦắ& bẠ màễL noưđe, iíửi đ ă ghífL đ ẵ lítúătL th cư ih t s ỉ
Izhú íí lit ậ ít Hfl ụ ,
ốm - xiiL ũÂm đẽt ẳẤJỦ ạiáfL đõ^ nlùỀi tìn h eủ a eha. mjLf
a n h ũhi eiit^ hạn hè^ đ ề tiq itíỊÍiiệp íTè em Íio àít th cưih tỗ t
Uhúíi iítậ it ítíítj .
'JÔCL Q íệiị 2 0 thÓLếiạ. 0 5 n ăển 2 0 0 5
S in h úiỀML
Çîm£iing. Çîhi 'X>ằj^iạ-
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ART
BB134
KST
NC
p.
SGOT
SGPT
SR
SR-KST-CT
Artemisinin
16 - piperazinoethanol - lOa - triíluoromethyl
- anhydrodihydro artemisinin
Ký sinh trùng
Nghiên cứu
Plasmodium
Serum glutamat oxalate transaminase
Serum glutamat pyruvate transaminase
Sốt rét
Sốt rét - ký sinh trùng - côn trùng
MỤC LỤC
Trang

ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Tình hình sốt rét trên thê giối và Việt Nam 2
1.1.1. Tình hình sốt rét trên thê giới
2
1.1.2. Tình hình sốt rét ở Việt Nam
2
1.2. Tình hình KST sốt rét kháng thuốc SR 3
1.3. Tình hình nghiên cứu artemisinin và dẫn xuất của nó

6
1.3.1. Nguồn gốc tách chiết và xác định cấu trúc

6
1.3.2. Tính chất của Artemisinin

8
1.3.3. Độc tính của Artemisinin và dẫn xuất của nó 9
1.3.4. Dược động học
10
1.4. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn flour

11
1.4.1. Sơ lược vê qui trình tổng hợp các dẫn chất artemisinin
gắn fluor 11
1.4.2. Đặc điểm các dẫn chất artemisinin gắn fluor và BB 134 12
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 14
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nhiệm

14

2.1.1. Đôi tượng nghiên cứu 14
2.1.2. Nguyên liệu 14
2.1.3. Phương tiện 14
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 14
2.1.5. Xử lý sô liệu 18
2.2. Kết quả nghiên cứu
19
2.2.1. Kết quả nghiên cứu về thê trọng thỏ 19
2.2.2. Kết quả nghiên cứu về hoá sinh

20
2.2.3. Kết quả nghiên cứu về huyết học
25
2.2.4. Kết quả nghiên cứu điện tim
28
2.3. Bàn luận 30
2.3.1. Ảnh hưởng của BB 134 lên chức năng gan, thận

30
thỏ thực nghiệm
2.3.2. Ảnh hưởng của BB 134 lên các tê bào máu

31
thỏ thực nghiệm
2.3.3. Ảnh hưởng của BB 134 lên chức năng tim mạch

32
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỂ

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium gây ra,
bệnh sốt rét đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khoẻ cộng đồng
ỏ những vùng sốt rét lưu hành.
Mặt khác tình trạng KST SR kháng thuốc SR ngày càng trở lên phức tạp [1]
và đã lan rộng ra tất cả các vùng SR lưu hành trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Kháng thuốc của p. falcipanum đã làm tăng tỷ lệ SR ác tính, tăng các vụ dịch SR và
tăng tỷ lệ tử vong. Trước tình hình trên việc nghiên cứu một thuốc mới chống SR có
hiệu lực với p . falcipanum là hết sức cần thiết.
Artemisinin và dẫn xuất là những thuốc SR mới được chiết từ cây Thanh hao
hoa vàng (Artemisia annua.L. ), hiện nay đang được sử dụng rộng rãi để điều trị
bệnh SR ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. ART và dẫn xuất có ưu điểm là ít độc,
lại có hoạt tính và hiệu quả điều trị cao. Tuy nhiên, ART và dẫn xuất của nó còn có
nhược điểm là thời gian bán thải ngắn, tỷ lệ tái phát bệnh sốt rét còn cao (47%).[ 2 ]
Để khắc phục tình trạng trên một loạt các dẫn xuất của ART như: artesunat,
artemether, arteether, dihydroartemisinin đã được ra đời. Các nhà khoa học Pháp
cũng đã tổng hợp ra một dẫn suất mới của ART là BB 134. Viện SR - KST - CT
trung ương đã phối hợp với cộng hoà Pháp nghiên cứu tiền lâm sàng dẫn xuất trên
trong đề tài cấp nhà nước giai đoạn 2002 - 2005. Thực hiện một phần của đề tài,
trong khoá luận này chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu độc tính bán cấp của
dẫn xuất artemisinin gắn flúor ở động vật thực nghiệm”.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau;
1. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên một số chỉ sô' huyết học ở thỏ thực
nghiệm.
2. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên một sô chỉ số hoá sinh ở thỏ thực
nghiệm.
3. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên tim mạch ở thỏ thực nghiệm.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sốt rét trên thê giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới.
Mặc dù đã có tiến bộ trong công tác phòng chống nhưng bệnh sốt rét

vẫn được xếp vào loại bệnh lây nhiễm hàng đầu trên toàn thế gới.
Cho tới ngày nay sốt rét vẫn là bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ con
người cũng như sự phát triển kinh tế, xã hội của các nước trên thế giới. Mỗi
năm trên thế giới có từ 300 - 500 triệu người mắc sốt rét và khoảng 1-1,5
triệu người tử vong vì sốt rét, trong đó chủ yếu là trẻ em dưới 5 tuổi, tập trung
chủ yếu ở Châu Phi (90%). Đông Nam Á và Châu Đại Dương. Theo WHO
năm 2001 có hơn 1,1 triệu người ở Châu Phi và khoảng 65 nghìn người ở
Đông Nam Á chết vì sốt rét.
Năm 1992, tại Hội nghị Bộ trưởng y tế về SR tại Amsterdam - Hà Lan,
WHO đề ra mục tiêu chiến lược cho phòng chống SR là: Giảm chết, giảm
mắc, giảm thiệt hại về kinh tế xã hội, thông qua cải thiện tăng cường khả năng
của từng địa phương và quốc gia [26, 27].
1.1.2. Tình hình SR ở Việt Nam.
Việt Nam là nước có nhiều nhóm dân tộc có tập quán sống du cư hoặc
bán du cư và có nhiều ngôn ngữ, phong tục và nhận thức khác nhau. Các nhóm
dân tộc thiểu số này sinh sống ở các vùng sâu, vùng xa họ rất nghèo và không
thể hoặc hạn chế trong việc tiếp cận với các dịch vụ y tế, họ sống trong rừng
hoặc gần rừng nơi có loài muỗi sốt rét chính sinh đẻ và phát triển cùng với
người lao động di cư là đối tượng có nguy cơ mắc bệnh sốt rét cao. Bên cạnh
đó Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ và độ ẩm rất
thích hợp cho sự phát triển của vector truyền bệnh của muỗi Alopheles.
Ngày nay với cơ chế mở cửa thị trường, kinh tế Việt Nam có sự giao luti
kinh tế với nhiều nước, mỗi năm có hơn 20 triệu người qua lại dọc theo biên
giới Vân Nam, Myanmar và Việt Nam, trong số này có một số lượng lớn dân
cư bất hợp pháp qua biên giới là điều kiện thuận lợi cho sốt rét phát triển [14].
Việt Nam đã tham gia vào chương trình “Thanh toán bệnh sốt rét” của
WHO từ năm 1956. Chương trình đã đạt được kết quả là khống chế được bệnh
sốt rét trên toàn Miền Bắc thập kỷ 60 - 70, giảm được 20% số người mắc sốt
rét [19]. Tuy nhiên từ năm 1981 trở đi do nhiều nguyên nhân như thiếu nguồn
lực, mạng lưới y tế cơ sở xuống cấp, KST SR kháng thuốc lan rộng và đa

kháng, do vậy nguy cơ bùng nổ SR vẫn còn là mối đe doạ cho những vùng có
SR lưu hành.
Tình hình SR ở Việt Nam từ năm 1991 đến năm 2003 được trình bày
tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Sô ca mắc SR, sốt rét ác tính, sô vụ dịch SR và sô bệnh nhân
tử vong ở Việt Nam từ năm 1991 - 2003 [2,18].
Năm
BNSR
KSTSR
BNSRAT
Sô vụ dịch
SR
Tử vong
1991 1.091.251
187.994 31.741
144 4.646
1995 666.153
100.116 4.222 3
348
1998 383.341 72.091
1.447 4 183
1999
341.529
75.534
1.516 8 190
2000 293.016
74.316
1.161 2 148
2001 257.793
68.699

878
1 91
2002
185.529
47.807 599 0 50
2003
164.706
38.790 423 2 50
1.2. Tình hình KST sốt rét kháng thuốc SR.
Có 4 loại ký sinh trùng sốt rét gây bệnh ở người là: p.palciparum,
p. vivax, p. ovaỉe, p. malariae nhưng phổ biến nhất và nguy hiểm nhất là
chủng p. falciparum [22]. Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc là một trong
những trở ngại lớn cho mọi chương trình phòng chống sốt rét ở các nước. Trên
thế giới đã có 73 nước có báo cáo KST SR kháng thuốc, đặc biệt đối với với
các nước có chủng p. falciparum lưu hành, trong đó có Việt Nam là nước có
tỷ lệ KST p. falciparum chiếm tới 71% tổng số KST [24].
Kháng thuốc sốt rét được tổ chức y tế thế giới định nghĩa như sau:
“Kháng thuốc là khả năng của một chủng KST có thể sống sót và phát triển
mặc dù bệnh nhân đã được phòng và hấp thụ một lượng thuốc và chính xác
hơn là trong máu bệnh nhân có nồng độ thuốc mà trước đây vẫn ngăn cản và
diệt được loại KST SR đó”. Định nghĩa này được xem như là kháng tương đối
và trong thực tế là tiếp tục tăng liều lượng lên đến giới hạn mà bệnh nhân có
thể chịu đựng được nhưng không khỏi bệnh, đó là kháng hoàn toàn. Hiện nay
“kháng thuốc” mang ý nghĩa kháng hoàn toàn [7].
Các nghiên cứu lâm sàng về kháng thuốc được đánh giá theo tiêu chuẩn
của tổ chức y tế thế giới (1973) đáp ứng của p.falciparum theo test invivo 7
ngày và 28 ngày:
* Test invivo 28 ngày:
- Nhạy (S): Trong 7 ngày đầu bệnh nhân hết sốt, sạch KST sốt rét,
không tái phát KSTSR cho đến ngày thứ 28.

- Kháng độ 1 (RI): Hết sốt và sạch KST SR trong tuần đầu nhưng lại tái
phát KST từ ngày 8-28.
- Kháng độ 2 (R II); Số lượng KSTSR giảm dần nhưng không hết hẳn,
tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng < 25% so với ngày NO.
- Kháng độ 3 (R III): Số lượng KST SR giảm dần nhưng không hết hẳn,
cho tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng > 25% so với ngày NO hoặc lượng KST
không giảm, thậm chí còn tăng cao hơn so với NO.
Việt Nam là một trong những nước xuất hiện KST kháng thuốc sớm
trên thế giới. Trường hợp đầu tiên p. falciparum kháng cloroquin được phát
hiện tại Nha Trang năm 1961, An Khê (1964)
Năm 1968 lần đầu tiên xuất hiện một vụ dịch khá lớn do p .falciparum
kháng cloroquin xảy ra ở Quỳnh Thắng Nghệ An [1]. Sau giải phóng miền
Nam, có sự giao lưu giữa hai miền, biến động dân cư lớn. Đến năm 1995 đã
xác định p .falciparum kháng cloroquin ở hầu như 100% vùng sốt rét ở các
tỉnh miền Nam và rộng ra nhiều tỉnh miền Bắc [18],
Những nghiên cứu 20 năm gần đây ở Việt Nam cho thấy: đáp ứng của
p. falciparum với thuốc SR ở các khu vực SR lưu hành khác nhau thì có mức
độ kháng cũng rất khác nhau. Giai đoạn 1991-1995 các nghiên cứu tại các
vùng khác nhau cho thấy p. falciparum kháng cloroquin RII, RIII, từ 10,5 -
96,7%. Giai đoạn 1996 - 2000 tỷ lệ thất bại muộn p. falciparum bằng
cloroquin từ 22,2% - 56,3% [2].
Nghiên cứu năm 2001 - 2002 tại một số tỉnh miền Trung cho thấy
p.falciparum kháng cloroquin RII, RIII là 37,5%, tỷ lệ điều trị thất bại đến
ngày thứ 28 từ 48,0% - 71,9%. Với hỗn hợp sulfadoxin - pyrimethamin, tỷ lệ
điều trị thất bại 73%. Phác đồ artesunat đơn thuần, liệu trình 5 ngày tỷ lệ thất
bại muộn là 17,5%. Viên sốt rét CV-8 chưa thấy có thất bại [16].
ở nước ta tỷ lệ kháng fancidar tương đối cao mặc dù thuốc này đưa vào
sử dụng chưa lâu. Năm 1998, trong một nghiên cứu tại nhiều điểm trong cả
nước của Nguyễn Duy Sỹ đã xác nhận tỷ lệ kháng RI = 31,7%, RII = 25,8%,
RIII = 14% (n=243).

Như vậy, p .falciparum kháng thuốc ngày càng tăng và lan rộng nhiều
nơi trẽn cả nước, do đó việc nghiên cứu để tìm ra một loại thuốc mới thay thế
loại thuốc đã bị kháng là vấn đề hết sức cần thiết trong tình hình sốt rét diễn
biến ngày càng phức tạp hiện nay [8],
Trong lúc chờ đợi vaccin và các thuốc trong chủng đặc hiệu, vấn đề
phòng bệnh vẫn là biện pháp hàng đầu. Cần khuyên khích các bệnh nhân nằm
màn, phun thuốc diệt muỗi, tẩm màn
Bảng 1.2. Thời gian xuất hiện kháng một sô thuốc SR ở trên thế giới [6]
Thuốc
Năm bắt đầu dùng trên
người
Năm và nơi KST SR
kháng thuốc đầu tiên
Quinin 1630
1910 - Brazil
Chloroquin 1945
1960 - Colombia
Pyrimethamin 1951
1952 - Giambia
Fansidar
1964
1968 - Campuchia
Mefloquin 1972
1982 - Thái Lan
ART 1972
Chưa kháng
1.3. Tình hình nghiên cứu artemisinin và dẫn xuất của nó.
1.3.1. Nguồn gốc tách chiết và xác định cấu trúc.
* Nguồn gốc.
Cây Thanh hao hoa vàng có tên khoa học là Artemisia annua L. họ cúc

(Asteraceae) là cây thảo, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng
đồi ven suối, ven sông, ở những nước ôn đới và nhiệt đới như Trung Quốc,
Mông Cổ, Iran, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ, một số nước Đông Nam Á. Cây
cao từ 1,2 - 1,5 m, lá xẻ lông chim 2 lần, thành phiến dẹt, phủ lông mềm, có
mùi thơm. Cụm hoa hình thành một thuỳ kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc
bầu dục, hoa màu vàng nhạt. Trong một cụm hoa có sáu hoa, xung quanh là
hoa cái, ở giữa là hoa lưỡng tính. Hoa nhỏ chỉ dài bằng một màng lọc, mặt vỏ
có tuyến dẩu [12].
ở Việt Nam cây mọc nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng còn ở Quảng Ninh,
Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Hưng cũng có cây Thanh hao mọc nhưng thưa thớt,
không có khả năng khai thác [15].
Hiện nay, cây Thanh hao hoa vàng được trồng ở nhiều tỉnh phĩa Bắc và
một số tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Lâm Đồng, Long An nhằm đáp ứng
cho nhu cầu chiết xuất artemisinin
* Tách chiết và xác định cấu trúc của astemisinin.
Năm 1972 các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất từ dịch chiết
ether của lá cây Thanh hao hoa vàng một chất có hoạt tính chữa sốt rét đầu
tiên gọi là artemisinin.
Tiếp đó năm 1984, Klayman D.L., và cộng sự đã chiết ART từ dược
liệu khô bằng ether dầu hoả sôi, tách ART bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong
cyclohexan. Sau đó nhiều tác giả khác đã nêu phương pháp chiết và phân lập
ART từ hỗn hợp các sesquiterpen để thu được ART.
ở Việt Nam từ năm 1989 nhóm nghiên cứu của Đinh Huỳnh Kiệt đã
công bố kết quả chiết ART từ lá cây Thanh hao hoa vàng bằng ete dầu hoả
[11]. Sau đó việc chiết xuất artemisinin phát triển rất nhanh chóng và năng
suất tăng lên rất nhiều.
* Cấu trúc. Cấu trúc của ART được xác định bằng kết hợp các phương pháp
phân tích nguyên tố, nhiễu xạ tia X, cho công thức phân tử là: C|5H220g.
15 C H 3
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artemisinin.

Trong công thức trên, vòng A có dạng Cyclohexan, vòng D là 5 lacton,
vòng B và c đều là dị vòng oxy bão hoà, trong đó vòng c là một vòng trioxan
có liên quan nhất đến hoạt động chống sốt rét của artemisinin [25].
1.3.2. Tính chất của artemisinin.
* Tính chất lý học.
Artemisinin có dạng tinh thể hình kim, không màu, không mùi, điểm
nóng chảy 156 - 157°c, rất ít tan trong nước và trong dầu, tan trong hầu hết
các dung môi hữu cơ. Artemisinin bền trong môi trường trung tính ở nhiệt độ
150°c hoặc tới 50°c trên điểm nóng chảy (khoảng 200°C) trong gần 2,5 phút
[10]. Các dẫn xuất của ART artemisinin không bền trong môi trường acid hoặc
bazơ ngay cả ở nhiệt độ phòng nhưng rất ổn định trong môi trường trung tính.
* Tính chất hoá học.
Trong phân tử ART có cầu peroxid (-0-0) là mối liên kết nhạy cảm
nhất, có vai trò quyết định hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét. Với các điều
kiện khử hoá thay đổi, phân tử ART bị khử ở các nhóm khác nhau. Khử hydro
hoá ART với tác nhân hydrogen có xúc tác Pd/ CaC03 thì cầu peroxyd bị mất
một nguyên tử Oxy tạo ra deoxyartemisinin là một epoxid không có hoạt tính
chống sốt rét. Khi khử hoá ART với borohydrid, nhóm lacton chuyển thành
nhóm lacton cho dihydroartemisinin (không mất cầu peroxid) có hoạt tính
chống KST SR mạnh hơn cả ART.
* Các dẫn xuất của ART.
Với mục đích tăng cường hiệu lực chữa SR của ART năm 1976 các nhà
khoa học Trung Quốc đã khử artemisinin bằng natri borohydrid thành
dihydroartemisinin, chất này cho hoạt tính chống sốt rét mạnh hơn artemisinin
2 lần. Khi thay thế gốc R bằng các gốc khác nhau ta có các dẫn xuất khác
nhau của artemisinin.
R= -H : dihydroartemisinin (DHA)
R= - CH3: artemether
R= -C2H5 : arteether
R=-CO-CH2-CH2-COONa: artesunat

R= -0 -CH2-C6H4-C0 0 Na : artelinat
•4
H,c
Hình 1.2. Các dẫn xuất của artemisinin.
1.3.3. Độc tính của artemisinin và dẫn suất của nó.
* Độc tính cấp.
Artemisinin và dẫn chất là những thuốc ít độc [21]. Các nghiên cứu về
độc tính cấp và bán cấp của artemisinin và các dẫn xuất của nó đối với động
vật thực nghiệm là tương đối thấp. Độc tính của ART và dẫn xuất trên chuột
nhắt trắng thấp hơn chloroquin (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Liều chết 50% (LD50) của ART và dẫn xuất.
Loài súc vật
Tên thuốc
Đường dùng
thuốc
LD 50 (mg/kg)
Artemisinin
Uống
Tiêm bắp
4228
3840
Chuột nhắt
Artesunate
Uống
Tiêm bắp
1180
475
Dihydroartemisinin
Uống
1150

Artemether
Tiêm bắp
267
Chloroquin
Uống
Tiêm bắp
400
63
Các triệu chứng nhiễm độc cấp của ART trên động vật là sự bồn chồn,
run rật, suy giảm hô hấp và mất phản xạ chính xác, ở các động vật nhỏ hơn thì
biểu hiện không rõ ràng trên hệ thống thần kinh nhưng trên động vật lớn thì
biểu hiện lúc đầu là sự co giật ở cường độ cao và mất phưofng hướng, sau đó là
suy hô hấp rồi ngừng tim, các động vật sống sót thì hồi phục từ từ trở lại trong
vòng 10 - 24 giờ [21].
* Độc tính bán cấp.
Các nghiên cứu về độc tính, dược lý lâm sàng artesunat do Việt Nam
sản xuất cho thấy với liều cao gấp 14 lần liều dùng ở lâm sàng, artesunat
không làm thay đổi số lượng hồng cầu, công thức bạch cầu của thỏ, không ảnh
hưởng đến các chức năng gan, thận nếu như dùng từng đợt ngắt quãng. Uống
artesunat liều 20 mg/kg/ngày liên tục trong 30 ngày, các chỉ số enzym GOT,
GPT, hàm lượng cholesterol, creatinin trong huyết thanh khác nhau không có
ý nghĩa giữa lô chứng và lô uống thuốc. Điều này chứng tỏ chức năng gan,
thận đã không bị ảnh hưởng. Liều artesunat 40 mg/kg/ngày uống liên tục 15,
30 ngày và uống liều 3 đợt cách nhau 7 ngày, thấy có tổn thương nhẹ ở gan,
thận bình thường, nhưng những tổn thương này được hồi phục hoàn toàn sau
7 -1 5 ngày ngừng thuốc [9]. Liều artesunat 100 mg/kg/ngày X 28 ngày trên
thỏ chưa thấy ảnh hưởng tới tim mạch và thể trạng. Có giảm số lượng hồng cầu,
tỷ lệ hemoglobin giảm, tăng nhẹ bạch cầu [4]. Tổn thưoỉng khá nặng cấu trúc vi
thể của gan, thận thỏ. Những biến đổi này được hổi phục lại hoàn toàn bình
thường sau 7 - 15 ngày ngừng thuốc [5]. Artesunat ở liều 100 mg X 5 ngày

chưa thấy ảnh hưởng đến các quá trình hưng phấn và ức chế lên hệ thần kinh
cấp cao ở chuột nhắt trắng và liều 50 mg X 5 ngày trên chuột cống trắng [13].
Artemether và arteether liều 12,5 mg/kg đến 50 mg/kg thể trọng ảnh
hưởng rõ đến chức năng não bộ của chó. Meshlick và cộng sự đã nhận thấy
khi dùng artemether liều cao trên chuột cống đã gây hoại tử neuron ở các vùng
đặc biệt (nhân đỏ và nhân tiền đình) của não [23].
Các nghiên cứu trên chuột cống trắng cho thấy với liều uống 250- 500
mg/kg dùng 14 ngày liên tục, ART và dẫn xuất của nó không ảnh hưởng đến
trọng lượng, không làm thay đổi điện tâm đồ, công thức máu, hình ảnh vi thể
gan, tim, phổi, thận ở chuột thí nghiệm [3,4],
ART và dẫn xuất có thể qua được hàng rào sau thai và hàng rào máu
não, nên ảnh hưởng của ART và dẫn xuất khi dùng cho người mang thai còn
có nhiều ý kiến khác nhau. Các nghiên cứu về đột biến động vật đã cho thấy
rằng ART không phải là chất gây đột biến [21], không gây quái thai của bào
thai chuột cống.
1.3.4. Dược động học.
Các nghiên cứu trên động vật cho thấy, nồng độ ART thấp trong huyết
tương sau khi uống, nhưng nồng độ ART cao hơn sau khi tiêm bắp. Nghiên
cứu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đo nồng độ ART trên chuột nhắt
và chuột cống cho thấy, nồng độ ART cao hơn trong huyết tương 1 giờ sau khi
uống và thời gian bán thải là 4 giờ ở chuột nhắt và 1 giờ ở chuột cống. Thuốc
phân phối rộng khắp cơ thể, thuốc được bài tiết qua thận và nước tiểu trong 24
giờ.
Các nghiên cứu về dược động học trên người còn rất hạn chế, trong một
số nghiên cứu cho thấy thời gian tồn tại ART trong cơ thể ngắn. ART gắn vào
Protein của huyết tương khoảng 65%.
1.4. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor.
1.4.1. Sơ lược về qui trình tổng hợp các dẫn chất artemisinin gắn fluor
15 Ç H 3
.R

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của các dẫn chất artemisinin gắn fluor
Để tổng hợp ra các dẫn chất artemisinin gắn fluor người ta gắn nhóm
trifluoromethyl (-CF3) vào Cịo của dihydroartemisinin tạo ra 10-trifluoromethyl
deoxoartemisinin, từ đó tổng hợp ra các dẫn chất khác theo sơ đổ sau;
H aCv/ĨỌ
I
I “
•Ò[ 16
CF.
Hình 1.4. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất artemisinin gắn fluor [20].
1.4.2. Đặc điểm của các dẫn chất artemisinin gắn fluor và BB 134.
Nhược điểm lớn nhất của artemisinin, dihydroartemisinin và các dẫn chất
acetal trước đó chính là kém bền trước các enzym oxy hoá của gan (-OH và nhóm
bán acetal ở Cio dễ bị oxy hoá bởi enzym cytocrom trong gan), đồng thời dẫn chất
bán acetal ở C|0 còn bị thuỷ phân bởi các acid dịch vị nên sinh khả dụng cũng như
thòd gian hấp thu thuốc chậm. Để khắc phục nhược điểm kém bền của artemisinin
và các dẫn xuất trước, các nhà khoa học Pháp đã tìm cách thay thế nhóm -C=0,
nhóm acetal và hemiacetal ở C|0 bằng liên kết -C-C bền vững hơn nhằm tăng độ
bền với các enzym oxy hoá và ngăn cản sự thuỷ phân của acid dạ dày đối vói
thuốc. Kết quả cho thấy rằng một loạt các dẫn xuất cùng loại có chứa nhóm
acetal -C - c ở vị trí Cịo có độ bền gấp 15 đến 20 lần so với những dẫn xuất
cùng loại có chứa nhóm acetal - c - o ở vị trí C|0 trong điều kiện thí nghiệm
acid gần giống trong dạ dày. Dưới đây là kết quả cho thấy điều đó.
Bảng 1.4. Độ ổn định của dạng acetal C-O và không acetal C-C của các dẫn
xuất artemisinin trong dung dịch acid (Img/ml, 0,01N HCl, pH = 2,0,
Hợp chất
Ti/2
Dạng acetal
Artemisinin
23,5

Dihydroartemisinin
17,9
Arteether
10,98
Artelinic acid
13,11
Dạng không acetal
Deoxartemisinin (DOA)
213,36
10-(n-by tyl)-DO A
165,12
10-benzyl-DOA
385,6
10-cacboxy propy 1-DO A
386,88
10-cacboxybytyl-DO A
374,4
Ngoài ra , các kết quả nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chống sốt rét
invitro của dạng không acetal mạnh hơn 8 - 9 lần so với dạng acetal.
Dựa vào các nghiên cứu này, các nhà khoa học Pháp chủ trương gắn
một nhóm chức bền vững với chuyển hoá là -CF3 trong đó liên kết C-F rất bền
vững với các phản ứng oxy hoá và thuỷ phân). Điều này vừa làm tăng độ bền,
tăng thời gian bán thải của thuốc, mặt khác nó còn ngăn cản các phản ứng
thuỷ phân và oxy hoá góp phần làm giảm các tác dụng gây độc đối với thần
kinh.
Khi thay ửiế gốc R bằng nhóm piperazinoethanol sẽ được chất BB134
(16 - piperazinoeửianol-10a - triluoromethyl - anhydrodihydroartemisinin) [20].
lí CH3
M M .
-OH

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của BB 134.
Ngoài các ưu điểm về độ bền vững như các dẫn chất artemisinin gắn
fluor cùng loại, nó còn có nhóm chức piperazinoethanol ở C|6, chính điều này
cải thiện đáng kể độ tan cũng như tác dụng của chúng trên invivo (do dược
động học khá thuận lợi). Theo những nghiên cứu ban đầu tại Pháp, BB134 là
một trong những hợp chất artemisinin gắn flour có hiệu lực mạnh nhất đối với
KST SR cả invitro và invivo.
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm.
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.
Thỏ trưởng thành (Oryctolagus cunniculus L), số lượng 20 con khoẻ
mạnh, không phân biệt giống, có trọng lượng trung bình 2 ± 0,2 kg/ con, do
trung tâm nghiên cứu dê thỏ Ba Vì cung cấp được nuôi trong cùng điều kiện,
chế độ ăn uống như nhau.
2.1.2. Nguyên liệu.
- BB 134 dạng tinh khiết do Jean PierreBegue và viện khoa học Việt
Nam cung cấp.
- Gôm arabic 1% tiêu chuẩn dược dụng dùng làm dung môi để hoà tan
BB 134 và dùng cho thỏ chứng.
- Chất chống đông heparin
2.1.3. Phương tiện.
- Cân đồng hồ để xác định trọng lượng thỏ.
- Cân Sartoriuss có độ chính xác d= 0,01 mg dùng để cân thuốc
- Bơm tiêm, cốc pha thuốc, ống đong
- Xét nghiệm sinh hoá được đo trên máy Photometer 5010 của hãng
Mannhein Boringger (Đức)
- Xét nghiệm huyết học bằng các dụng cụ: Buồng đếm hồng, bạch cầu,
kính hiển vi, tiêu bản
- Hàm lượng ASAT (GOT), ALAT (GPT) protein, creatinin, bilirubin,
hemoglobin được xác định bằng các loại KIS của hãng Diasys của Đức.

- Điện tim thỏ được ghi trên máy điện tim Cardiofax của Camperation
Việt Nam - Japan 1994
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu.
* Thiết kế nghiên cứu.
Độc tính bán cấp của BB 134 được nghiên cứu trên thỏ, thỏ gồm 20 con
được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 uống BB 134 liều 9 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục
- Lô 2 lô chứng uống Gôm arabic 1% như lô uống BB 134.
SỐ thỏ này dùng để xét nghiệm các chỉ số huyết học, sinh hoá, điên tim
vào các ngày trước uống thuốc (NO), sau 14 ngày uống thuốc (N14), sau 28
ngày uống thuốc (N28)
Hình 2.1. Hình ảnh thỏ thực nghiệm đang uống thuốc.
* Các chỉ số nghiên cứu.
+ Các chỉ số về huyết học:
- SỐ lượng hồng cầu (x T/1)
- SỐ lượng bạch cầu (x GA)
- Công thức bạch cầu (%)
- Hàm lượng Hemoglobin (gA)
+ Các chỉ số về sinh hoá bao gồm:
• Các chỉ số về hoá sinh gan.
- Hàm lượng SGOT (uA)
- Hàm lượng SGPT(uA)
- Hàm lượng bilirubin (M mol/l)
• Các chỉ số về hoá sinh thận.
- Hàm lượng Creatinin (Mmol/1)
- Hàm lượng protein (g/1)
- Hàm lượng Bilirubin(Mmol/l)
+ Các chỉ số về điện tim: Nhịp tim (lần/phút), sóng p [biên độ (mv),
thời khoảng (sec)], khoảng PQ (sec), phức bộ QRS [biên độ (mv), thời khoảng
(sec)], sóng T [biên độ (mv), thời khoảng (sec)], khoảng QT (sec).

* Phương pháp tiến hành.
Toàn bộ số thỏ ở lô uống BB 134 liều 9 mg/kg/ngày và thỏ chứng được
uống thuốc hàng ngày bằng kim tiêm đẩu tù, kim dài khoảng 10 cm vào lúc 9^
sáng uống liên tục trong 28 ngày. Theo dõi các biểu hiện ăn uống, đại tiểu
tiện, hình dáng bê ngoài hàng ngày.
Các chỉ số sinh hoá, huyết hoc, điện tim được tiến hành vào các thời
điểm trước ngày uống thuốc ngày (NO), ngày thứ 14 (N14), ngày thứ 28 (N28)
* Phương pháp xác định các chỉ sô về huyết học.
Số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, hàm lượng
hemoglobin được xác định bằng kỹ thuật thường qui.
* Phương pháp xác định các chỉ sô vê sinh hoá.
+ Hoạt tính enzym SGOT được xác định theo phương pháp của
Bermeryer H.u theo nguyên lý sau:
a - cetoglutamat + L-aspartat < L- glutamat + oxaloacetat
_ _ ^ MDH _
Oxaloacetat + NADH + H ^ ► L.malat + NAD"^
MDH: malad dehydrogenase
Đo NADH ở bước sóng 340 nm trên máy quang kế 4010 của Đức.
+ Hoạt tính enzym SGPT được xác định theo phương pháp Bermaryer
H.u theo nguyên lý sau:
GPT
a - cetoglutamat + L-alanin ^ ^ L - glutamat + pyvuvat
MDH
pyvuvat + NADH + ^ ► L. lactat + NAD^
Đo NADH ở bước sóng 340 nm trên máy quang kế 4010 của Đức
+ Hàm lượng bilirubin huyết thanh.
Nguyên lý: Dùng dung dịch caíein benzoat để hoà tan bilirubin tự do.
Bilirubin tạo với thuốc thử diazo (acid diazo phenylsulyonic) thành
azobilirubin màu hồng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 nm, đậm độ
màu tỷ lệ thuận với nồng độ lilumbin.

A thử
Kết quả: Nồng độ lilurubin x =

X 85,5
- A mẫu
+ Hàm lượng protein toàn phần trong huyết thanh.
Nguyên lý: Protein huyết thanh tạo phức màu với muối đồng trong môi
trường kiềm. Đậm độ màu tỷ lệ với nồng độ protein có trong dung dịch.Tiến
hành đo màu ở bước sóng 550 nm trên máy tự động LISA của hãng Viphaco
(Pháp) ở nhiệt độ 37°
A thử
Kết quả: Protein (g/1) =

X 60
A mẫu
+ Hàm lượng creatinin trong huyết thanh.
Creatinase
Creatinin + HiO
Creatin + H2O
Creatin
Creatinase
■> Sarcorin + Urê
Sarcorin + O2 + H2O
Sarcorinoxy dase

>■ Glyxin + HCHO + tỈ2v^2
H2O2 + EHSPT + 4 aminoantipyrin

> Đỏ quinon
Đậm độ đỏ quinon tỷ lệ với nồng độ Creatinin có trong dung dịch. Tiến

hành đo màu ở bước sóng 500 nm trên máy tự động LISA của hãng Viphaco
(Pháp) ở nhiệt độ 37°c
Athử
Kết quả: Creatinin (MolA) =

X 176,8
A mẫu
Các enzym và các chất chuyển hoá ừên được định lượng nhờ hoá chất
của hãng Diasys (Đức) dưới dạng các kis, đo ttên máy photometer 4010 (Đức)
* Phương pháp nghiên cứu điện tim.
Đặt thỏ nằm ngửa cân đối trên bàn ghi điện tim, buộc cố đinh 4 chi thỏ
về 4 phía góc bàn bằng 4 sợi dây đay để thỏ không dãy được.
Tiến hành đặt điện cực vào các vị ừí và ghi điện tim thỏ ở 12 chuyển
đạo ngoại biên (6 chuyển đạo ngoại biên, 6 chuyển đạo trước tim). Ghi điện
tim kM thỏ nằm yên. Đọc kết quả theo Trần Đỗ Tinh và cộng sự. [17]
Hình 2.2. Hình ảnh điện tim thỏ thực nghiệm.
2.1.5. Xử lý sô liệu.
Các kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê y - sinh
học, dùng các mẫu nhỏ (n < 30) trên máy tính theo chương trình Epilnío 6.0
để đánh giá trung bình ( và độ lệch chuẩn (SD) ứieo các nội dung sau:
- So sánh ngang sự tíiay đổi các chỉ số nghiên cứu ở các thời điểm NO,
N14, N28 trong từng lô theo phương pháp tự chứng.
- So sánh đọc giữa các lô ở từng thời điểm nghiên cứu NO, N14, N28
theo phương pháp so sánh giữa các nhóm độc lập.
Nếu p > 0,05 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Nếu p < 0,05 là khác biệt có ý nghĩa thống kê
Nếu p < 0,01 là khác biệt rất có ý nghĩa thống kê
2.2. Kết quả nghiên cứu.
2.2.1. Kết quả nghiên cứu về thể trọng thỏ.
Tiến hành cân ữọng lượng thỏ trước ngày uống thuốc (NO), giữa đợt

uống thuốc (N14) và sau 28 ngày uống thuốc (N28), kết quả được tìình bày ở
bảng 2.1
Bảng 2.1. Ảnh hưỏng của BB134 lên thể trọng thỏ
(X±SD, n ^10)
Thời điểm NC
LôNC
Lô chứng
(1)
LôuốngBB134
(2)
p
(l)-(2)
NO
1^7 ±0,05
1^ 7±0fi3
>0,05
N14
2,22 ± 0,13
2^2 ±0,06
>0,05
N28
2^3 ±0,09
2^2 ±0,04
>0,05
PN14-N 0
>0,05
<0,05
PN28-N 0
<0,05
<0,05

Trọng loọng thô
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
□ Lô chứng
OLô uống
thuốc ^ 1 3 4
Thời điểm NC
NO
N14 N28
Biểu đồ 2.1. Trọng lượng thỏ ỉô chứng và lô uống thuốc BB134
Kết quả ở bảng 2.1 và biểu đồ 2.1 cho thấy trọng lượng thỏ ở lô uống
BB134 liều 9 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục tại các thời điểm sau 14 ngày và
sau 28 ngày uống thuốc tăng có ý nghĩa thống kê so với ngày trước uống
thuốc (p < 0,05).
2.2.2. Kết quả nghiên cứu vê hoá sinh.
* Các kết quả nghiên cứu về hoá sinh gan gồm các chỉ số hàm lượng
SGOT, SGPT, bilirubin trong máu thỏ được trình bày trên các bảng 2.2 -ỉ- 2.4.
Bảng 2.2. Hàm lượng SGOT (u/1) trong máu thỏ lô chứng và lô
uống thuốc BB 134 (X±SD, n =10).
Thời điểm NC
Lô NC
Lô chứng
(1)
Lô uống BB134
(2)

p
(1) - (2)
NO
21,44 ±8,11
22 ± 12,4
>0,05
N14
17,56 ±7,91 16,75 ± 5,72
>0,05
N28
24,22 ± 5,63
20,08 ± 7,28
>0,05
PN 14-N 0
>0,05
>0,05
PN 28-N 0
>0,05
>0,05
Qua kết quả bảng ở 2.2 cho thấy hàm lượng SGOT trong máu thỏ của lô
uống thuốc BB 134 liều 9 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục tại thời điểm NO,
N14, N28 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và so với
trước uống thuốc (p > 0,05).