NGHIÊN cứu QUY TRÌNH PHÂN lập tế bào gốc từ MÀNG ối NGƯỜI

Y học thực hành (806) số 2/2012




33
1.3. Phỏt hin serotype ca DENV trờn bnh nhõn
st xut huyt
ng dng mPCR trờn 80 mu huyt thanh ca bnh
nhõn st xut huyt, cú 36 mu (45%) phỏt hin RNA ca
virus dengue v c 36 mu u l serotype I (Hỡnh 3).

Hỡnh 3: Sn phm PCR ca cỏc mu t bnh nhõn
st xut huyt. M: marker DNA 50bp; 1: mu HN-3; 2:
mu HN-8; 3: mu HN-15; 4: HN-25; 5:chng õm.
2. Bn lun
DENV c cnh bỏo l mt trong nhng Arbovirus
quan trng nht gõy nh hng ln n sc khe cng
ng trờn ton th gii, c bit l cỏc serotype ca
DENV. Bi vy, phỏt hin nhanh cỏc serotype ca
DENV trong cng ng l mt ũi hi cp bỏch nhm
khng ch, ngn chn v dp tt nhng v dch do
chỳng gõy ra. Hin nay, trờn th gii v trong nc s
dng nhiu phng phỏp sinh hc phõn t phỏt hin
cỏc mm bnh sinh hc. Cỏc phng phỏp ng dng
PCR cú th xỏc nh cỏc serotype ca DENV trong mu
bnh phm khi tp trung vo nhng on gene c hiu
ca virus. Phng phỏp mPCR c s dng trong
nghiờn cu ny ó c chng minh tớnh vt tri so
vi cỏc phng phỏp khỏc. S dng mPCR trong phỏt
hin sm virus DENV m ra hng i mi trong cụng

tỏc phũng v chng bnh st xut huyt nc ta. Kt
qu cho thy, trong 80 mu bnh phm, t l nhim
serotype DENV 1 l 36/80 (45%). T l v serotype ca
DENV cng phự hp vi s liu cụng b mi õy ca B
Y t v t l nhim DENV v serotype trờn bnh nhõn st
xut huyt trong v dch 2009.
KT LUN
Hin nay, phng phỏp chn oỏn nhanh l cụng c
hu hiu nht trong cụng tỏc phũng chng dch bnh.
Phng phỏp mPCR c s dng phỏt hin nhanh
cỏc serotype ca DENV trong nghiờn cu ny cho thy
t l nhim serotype DENV 1 trờn bnh nhõn st xut
huyt l 45% (36/80).
TI LIU THAM KHO
1.De Paula S. O., de C., (2004) One-step RT-PCR
protocols improve diagnosis compared to two-step RT-
PCR approaches. J. Clin Virol 30: 297 301.
2.Gubler, D. J. (1997). Dengue and dengue
hemorrhagic fever: its history and resurgence as a
global public health problem, p. 122. In D. J. Gubler
and G. Kuno (ed.), Dengue and dengue hemorrhagic
fever. CAB International
3.Guzman, M. G., and G. Kouri. (1996). Advances in
dengue diagnosis. Clin.Diagn. Lab. Immunol. 3:621
627.
4.Innis, B. L., A. Nisalak, (1989). An enzyme-linked
immunosorbent assay to characterize dengue infections
where dengue and Japanese encephalitis co-circulate.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 40:418427.
5.Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ,

Vorndam AV (1992). Rapid detection and typing of
dengue viruses from clinical samples by using reverse
transcriptase-polymerase chain reaction. J. Clin
Microbiol, 30:545-51.
6.Nimmannitya, S. 1987. Clinical spectrum and
management of dengue hae-morrhagic fever. Southeast
Asian J. Trop. Med. Public Health 18:392397.

Nghiên cứu quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối ngời

Phạm Văn Trân, Huỳnh Quang Thuận.
Hc vin quõn y B quc phũng;

TểM TT
T bo gc l t bo cú kh nng t lm mi v bit
hoỏ thnh cỏc t bo chuyờn bit cú chc nng mi
tng ng. Mc tiờu ca ti l nghiờn cu qui trỡnh
phõn lp, nuụi cy tng sinh t bo gc mng i ngi.
Phng phỏp nghiờn cu: phõn lp t bo bng trypsin,
collagenase B, percoll vi t trng khỏc nhau. Xỏc nh
t bo gc bng du n OCT-4. Kt qu: Quy trỡnh tỏch
phõn lp t bo gc t mng i t hiu qu cao, t bo
thu c cú biu hin du n ca t bo gc. Kt lun:
Quy trỡnh phõn lp t bo gc mng i bng trypsin,
collagenase B v percoll t hiu qu cao v d ng
dng. Cỏc t bo gc mng i biu hin du n OCT-4,
du n ca t bo gc.
T khúa: Mng i, t bo gc, trypsin, collagenase
B, hyaluronidase.
Tờn ting anh: Isolation, storage and culture of

amniotic membrane stem cells.
SUMMARY
The amniotic membrane stem cell can differentiate
into different mature cells. The aim of study is to
examine the process of isolating and culturing of stem
cells isolated from amniotic membranes. Method: We
isolated stem cell by trypsin, percoll and characterised
its by marker OCT-4. Results: Protocol for isolation of
stem cells from amniotic membrane has high efficiency.
Amniotic membrane stem cells collected express OCT-4.
Conclusion: Amniotic stem cells can be isolated from
amniotic membrane by trypsin, collagenase B and
percoll.
Keywords: Amniotic membrane, stem cell, trypsin,
collagenase B, hyaluronidase.
T VN
T bo gc l t bo nn múng ca tt c cỏc t
bo, mụ v c quan trong c th, õy l nhng t bo
cha bit hoỏ nhng cú kh nng tr thnh cỏc t bo
chuyờn bit v cú chc nng mi tng ng. Da vo
ngun gc, cỏc t bo gc c phõn chia thnh 4 loi
ú l: T bo gc phụi (Embryonic stem cells) v t bo
mm phụi (Embryonic germ cells), t bo gc thai
(Foetal stem cells), t bo gc trng thnh (Adult stem
cells/Somatic stem cells). Da vo c tớnh hay mc
bit hoỏ, t bo gc c chia thnh: T bo gc ton
nng hay t bo gc thy t (totipotent stem cells), t
bo gc vn nng (pluripotent stem cells), t bo gc a
nng (multipotent stem cells), t bo gc n nng
(mono/unipotential progenitor cells).

Mng i l mt sn phm thng b i trong quỏ
trỡnh sinh n l mt ngun cung cp t bo gc lý
tng. S dng t bo gc mng i khụng gp phi
Y häc thùc hµnh (806) – sè 2/2012




34
những vấn đề về đạo đức, xã hội. Các tế bào gốc phân
lập từ màng ối có tính sinh miễn dịch thấp, không có khả
năng ung thư hóa và có khả năng biệt hóa thành nhiều
loại tế bào khác nhau. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài
với mục tiêu nghiên cứu quy trình phân lập, nuôi cấy
tăng sinh tế bào gốc từ màng ối người phục vụ cho
nghiên cứu và điều trị.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối
Tế bào gốc được phân lập từ màng ối của các sản
phụ mổ đẻ bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc âm
tính với HIV, HBV, HCV, HTLV và giang mai. Tiến hành
tách tế bào bằng các enzym phân cắt mô trypsin 0,02%,
collagenase B 0,1%, hyaluronidase 0,1% có phối hợp
với các biện pháp cơ học. Ly tâm với percoll 40,8% và
50,8% (Sigma, Viet Nam) để thu được khối tế bào gốc.
Tế bào gốc màng ối được nuôi cấy trong môi trường
DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml),
streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10
-3
M), huyết

thanh bào thai bê (10%) đồng thời cấy chuyển tế bào 2
tuần một lần để duy trì trong phòng thí nghiệm.
- Bảo quản tế bào gốc màng ối trong điều kiện lạnh
âm sâu (-196
0
C) trong môi trường DMEM có 10%
DMSO.


Hình 1: Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối

2. Kỹ thuật RT-PCR xác định biểu hiện của ARN thông tin
Tách chiết RNA tổng số từ các tế bào (Kit -Qiagen) sau đó tổng hợp cDNA từ RNA tổng số (Kit - Fermentas).
Phản ứng PCR định lượng được thực hiện trên máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics) sử dụng kít QuantiTect
®

SYBR
®
Green PCR (Qiagen). Cặp chất mồi đặc hiệu cho từng gen được mô tả trong bảng sau.
Bảng 1: Các mồi dùng để chạy RT-PCR.
Sens: 5'-TGAGAAACGGCTACCACATC-3'
18S rRNA
Anti-sens: 5'-TTACAGGGCCTCGAAAGAGT-3'
Sens: 5'-AGGTGTTCAGCCAAACGACC-3' Oct-4 octamer-binding
transcription factor 4
Anti-sens: 5'-TGATCGTTTGCCCTTCTGGC-3'
Sau khi làm biến tính cDNA 15 phút ở 95°C, từ 40 đến 50 chu kỳ PCR được thực hiện (15 giây: 95°C, 25 giây:
58°C và 20 giây: 72°C). Điện di sản phẩm PCR trên gel arcrylamid Nồng độ ARNtt của dấu ấn OCT-4 được tính toán
dựa trên nồng độ ARNtt của gen 18S.
3. Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào

Tế bào trên đĩa nuôi cấy được cố định bằng etanol 98% sau đó được ủ với kháng thể thứ nhất kháng OCT-4.
Kháng thể thứ hai được gắn với chất huỳnh quang. Quan sát tế bào và chụp hình ảnh trên kính hiển vi huỳnh quang.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối.
Các enzym khác nhau có thời gian tác dụng khác nhau lên quá trình phân rã màng ối, giải phóng tế bào (bảng 2).
Bảng 2: Thời gian tác dụng của enzym phân cắt mô.
Số thứ tự Tên enzyme Thời gian làm tan rã màng ối (phút)
1 Trypsin 0.2% 45+/-10
2 Collagenase B 0.1% 50+/-10
3 Trypsin 0.2% + Collagenase B 0.1% (tỷ lệ 1:1) 20 +/- 10
Bóc tách và rửa màng ối
Phân l
ậ
p t
ế
bào

Ly tâm thu lấy tế bào
Đ
ế
m t
ế
bào

Nuôi c
ấ
y t
ế
bào

B
ả
o qu
ả
n t
ế
bào

Y häc thùc hµnh (806) – sè 2/2012




35
4 Hyaluronidase 0.6% Không tác dụng
- Sau khi được phân lập, tế bào gốc màng ối được nuôi cấy trong đĩa plastic. Sau 24 giờ, các tế bào gốc bám
dính vào bề mặt đáy đĩa nuôi cấy, các tế bào gốc màng ối có hình tròn hoặc hình đa diện. Sau mỗi 2-3 ngày thì tiến
hành thay môi trường và kiểm tra tình trạng phát triển của các tế bào gốc. Sau khoảng 2 tuần nuôi cấy, mật độ tế
bào phát triển bao phủ 50-60% bề mặt đĩa nuôi cấy. Sau đó tiến hành cấy chuyển nhằm tạo không gian cho tế bào
gốc phát triển và nuôi cấy sang môi trường đặc biệt để biệt hóa tế bào gốc thành các loại tế bào khác nhau.
2. Biểu hiện dấu ấn OCT-4 của tế bào gốc màng ối
Kết quả PCR cho thấy tế bào gốc có biểu hiện dấu ấn OCT-4. Kết quả phù hợp với kết quả nhuộm hóa miễn dịch
tế bào với kháng thể kháng OCT-4 của người (hình 2).
DAPI OCT-4 MERGE


Hình 2. Biểu hiện dấu ấn OCT-4. A, B, C: Hình ảnh tế bào nhuộm hóa
miễn dịch với OCT-4, màu xanh lá OCT-4, màu xanh tím nhuộm nhân bằng
DAPI. C: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của OCT-4. Ba mẫu tế bào gốc
màng ối khác nhau được cho vào 3 giếng điện di đánh số 1, 2, 3.

BÀN LUẬN
1. Quy trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế
bào gốc màng ối:
Để thu được tế bào có khả năng sống tốt trong môi
trường nuôi cấy, tế bào cần phải được phân lập trong
thời gian 4 giờ kể từ khi mổ lấy thai. Nếu để sau 4h mới
bóc tách và phân lập tế bào thì tỷ lệ nuôi cấy tế bào phát
triển kém và dễ bị nhiễm khuẩn và nhiễm nấm.
Về phân tách tế bào gốc từ màng ối bằng các
enzym, nếu chỉ phân cắt màng ối bằng trypsin thì số
lượng tế bào thu được thấp và thời gian thường phải
kéo dài, có khi phải 60 phút các tế biểu mô màng ối mới
bị phân cắt hết. Nếu cho thêm collagenase B vào trypsin
thì số lượng tế bào thu được sẽ nhiều hơn và thời gian
tan rã màng ối sẽ nhanh hơn. Hyaluronidase hầu như
không có tác dụng phân rã màng ối mặc dù đã có một
số tác giả trên thế giới dùng enzym này để phân lập tế
bào từ các mô liên kết.
Tế bào gốc được nuôi cấy trong đĩa plastic đường
kính 10cm, với môi trường DMEM high glucose có thêm
10% FBS + 1% Penicilline-Streptomycine + 1% L-
glutamate, trong tủ nuôi cấy HEPA-NUAIRE ở 37
O
C,
không khí có 5% CO
2
, độ ẩm bão hòa. Ngay sau khi
nuôi cấy 24 giờ, các tế bào gốc màng ối có xu hướng
bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, phát triển thành

những cụm tế bào hình tròn và có kích thước trung bình.
Sau 2 tuần nuôi cấy, mật độ tế bào phát triển bao phủ
khoảng 50-60% bề mặt đĩa nuôi cấy thì cấy chuyển
nhằm cung cấp đủ chất dinh dưỡng và đảm bảo không
gian cho các tế bào tăng sinh. Kết quả nuôi cấy và môi
trường nuôi cấy cũng tương tự như kết quả của các
nghiên cứu khác.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, với 30 mẫu màng
ối, chúng tôi đã tiến hành phân lập thành công tế bào
gốc từ màng ối bằng enzym. Các vị trí trên màng ối thu
được nhiều tế bào nhất là vị trí gần trung tâm màng ối
gần với cuống rốn, còn vị trí vùng dìa càng xa cuống rốn
thì thu được ít tế bào hơn.
2. Định danh tế bào gốc màng ối
- Các tế bào màng ối biểu hiện nhiều marker tế bào
gốc như octamer-binding transcription factor 4 (OCT-4),
GATA-4, hepatocyte nuclear factor-3β (HNF-3β)…
Những yếu tố này cho thấy không chỉ tế bào gốc biểu
mô màng ối mà còn cả tế bào gốc trung mô màng ối
cũng là tế bào gốc đa tiềm năng. Chúng tôi định danh tế
bào gốc màng ối bằng quan sát trực tiếp trên kính hiển
vi đảo ngược sau đó tiến hành các phản ứng RT-PCR,
hóa miễn dịch tế bào để phát hiện marker của tế bào
gốc. Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi chỉ xác định
sự biểu hiện của marker OCT-4, là marker biểu hiện tính
gốc của tế bào.
Việc xác định tính gốc của tế bào gốc màng ối bằng
OCT-4 đã được nhiều tác giả sử dụng. Trong nghiên
cứu này chúng tôi cũng đã xác định sự thay đổi của
marker OCT-4 trong quá trình nuôi cấy. Kết quả chỉ ra

rằng marker OCT-4 giảm dần theo thời gian. Trong thời
gian nuôi cấy tế bào gốc màng ối, mặc dù đã cố gắng
đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho nuôi cấy như thời
gian phân lập tế bào gốc từ màng ối, phòng nuôi cấy tế
bào luôn được vệ sinh tiệt khuẩn, môi trường nuôi cấy
335

bp
Y học thực hành (806) số 2/2012




36
thớch hp, t nuụi cy cú nhit 37
0
C, CO
2
5% luụn n
nh, bo m vụ trựng, nhng chỳng tụi cng ch nuụi
cy t bo gc mng i c trong khong 30-40 ngy.
KT LUN
Trong quỏ trỡnh nghiờn cu chỳng tụi ó cú c
quy trỡnh phõn lp t bo gc t mng i ngi cú hiu
qu cao v nuụi cy tng sinh c cỏc t bo gc
mng i trong mụi trng DMEM high Glucose cú thờm
10% FBS v Penicilline-Streptomycine thnh cụng.
TI LIU THAM KHO
1. Trn Vn Bộ (2006). Tỡnh hỡnh ghộp t bo gc
ti TP. H Chớ Minh Vit Nam. Y hc Vit Nam, s

5/2006: 1-4.
2. Nguyn Th Thu H (2004). T bo gc v ng
dng trong y sinh hc. TCNCYDH ph bn 32 (6): 13-
26.
3. Phan Kim Ngc v CS (2008). Thu nhn t bo
gc trung mụ a nng t mỏu cung rn ngi. Tp chớ
y dc hc quõn s. 33(2):119-124.
4. Phan Kim Ngc, Phm Vn Phỳc, Trng nh
(2009). Cụng ngh t bo gc. Nh xut bn giỏo dc
Vit Nam.
5. Anna M. Wobus et al (2002). Embryonic stem cell
as a model to study cardiac, skeletal muscle, and
vascular smooth muscle cell differentiation. Method in
Molecular Biology, 184: 127 - 155.
6. Ben - Num IF, Benvenisty (2006).
Humanembryonic stem cells as cellular model for human
disorder. Mol Cell Endocrinol.
7. Ayaka Toda, Motonori Okabe, Toshiko Yoshida,
and Toshio Nikaido (2007). The Potential of Amniotic
Membrane/Amnion-Derived Cells for Regeneration of
Various Tissues. J Pharmacol Sci 105, 215 228.
8. Toshio Miki, Keitaro Mitamura, Mark A. Ross,
Donna B. Stolz, Stephen C. Strom (2007). Identication
of stem cell marker-positive cells by
immunouorescence in term human amnion. Journal of
Reproductive Immunology 75 (2007) 9196.
9. Toshio Miki, Thomas Lehmann, Hongbo Cai,
Donna B. Stolz, Stephen C. Stroma (2005). Stem Cell
Characteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem Cells
2005;23:15491559.

NGHIÊN CứU Tỷ Lệ PHÂN LOạI MÔ BệNH HọC CủA UNG THƯ TUYếN GIáP NGUYÊN PHáT

Nguyễn Bá Đức,
Trần Giang Châu

TểM TT:
Mc tiờu nghiờn cu: T l Phõn loi mụ bnh hc
ca ung th tuyn giỏp nguyờn phỏt. i tng v
phng phỏp nghiờn cu: Phõn loi mụ bnh hc da
theo UICC v AJCC s dng trong thc hnh lõm sng
v nghiờn cu. Chn oỏn mụ bnh hc c tin hnh
ti bnh vin K. Phng phỏp c nh bnh phm bng
Formaldehyde, vựi nn, ct nhum Hematoxylin Eosin.
Kt qu v kt lun: T l ung th th nhỳ v nhỳ nang
chim nhiu nht l 82,3%; th nang ng th hai l
9,7%; th ty l 6,4%; gp ớt nht l th khụng bit húa
ch cú 1 trng hp chim 1,6%.Mi tng quan gia
mụ bnh hc v hch trờn lõm sng th nhỳ v nhỳ
nang cú kh nng thy hch lõm sng l cao nht
(57%). Th nang l 50%. Th ty l 75%
T khúa: mụ bnh hc, ung th tuyn giỏp nguyờn
phỏt
SUMMARY: RESEARCH HISTOPATHOLOGICAL
CLASSIFICATION OF PRIMARY HYROID CANCER
Objectives: The rate of histologic classification of
primary thyroid cancer. Subjects and Methods:
Histologic classification based on the UICC and AJCC
used in clinical practice and research. Histopathological
diagnosis was conducted at the K hospital. Method of

specimens fixed with formaldehyde, burying candles, cut
staining Hematoxylin-Eosin. Ket results and
conclusions:The rate of papillary cancer and follicular
papilla up to a maximum of 82.3%,the capsule is 9.7%,
bone marrow 6.4%, not differentiate only one case
accounted for 1.6T%. The correlation between
histopathological and clinical lymph nodes, papillary and
follicular papilla is the highest T(57T%). Marrow is
75%,Cysts is 50%.
Keywords: histologic classification, primary thyroid
cancer
T VN
Khong mt th k nay bnh ung th tuyn giỏp
trng mi c cp n mt cỏch rừ rng hn.
Trc õy ung th tuyn giỏp trng c xem nh mt
phn ca hi chng u c ớt c núi ti. Nm 1883
J.Breack u tiờn bỏo cao mt trng hp ung th
tuyn giỏp trng, n nm 1904 hai nh lõm sng Thy
in l Klink v Winship núi ti ung th tuyn giỏp th
n. Nm 1907 Langhans tỏc gi ngi c nhc ti ung
th biu mụ tuyn giỏp nhng cha cú phõn loi gii
phu bnh lý, 1909 Hedinger ó nờu ra s sp xp mụ
bnh hc, tuy nhiờn s hiu bit v ung th tuyn giỏp
trng vn cũn rt hn ch. Cho n nm 1940 tr i mi
cú nhiu nhng nghiờn cu v ung th tuyn giỏp trong
ú Marchant cú cụng ln trong phõn loi mụ bnh hc.
cú c s ỏnh giỏ cỏc phng phỏp cn lõm
sng trong chun oỏn ung th tuyn giỏp nguyờn
phỏp, trong nghiờn cu ny chỳng tụi tp trung vo mc
tiờu: Nghiờn c t l Phõn loi mụ bnh hc ca ung th

tuyn giỏp nguyờn phỏt.
I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU.
i tng nghiờn cu:
Gm 62 bnh nhõn ung th tuyn giỏp trng nguyờn
phỏt ó c xỏc nh sau khi cú kt qu mụ bnh hc
chớnh xỏc sau phu thut ti bnh vin K H Ni.
Phng phỏp nghiờn cu
Phõn loi mụ bnh hc da theo UICC v AJCC s
dng trong thc hnh lõm sng v nghiờn cu [44,45].
- Ung th th nhỳ v nhỳ nang.
- Ung th th nang.
- Ung th th ty.
- Ung th th khụng bit húa.
Phõn loi mụ hc.
- GR
xR
: Khụng ỏnh giỏ c .
- GR
1R
: Bit húa.