HNTS 2012 18 xác ĐỊNH LIỀU LD50 và KHẢ NĂNG đáp ỨNG MIỄN DỊCH của cá rô PHI đỏ đối với STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI sử DỤNG THỨC ăn có bổ SUNG β GLUCAN

XÁC ĐỊNH LIỀU LD
50
VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ
ĐỐI VỚI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG Β
GLUCAN
Trần Ngọc Thiên Kim
(1)
, Nguyễn Thị Kiều Tuyên
(1)
, Nguyễn Tùng Chi
(2)
,
(1) Bộ môn Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm TPHCM
(2) Trung tâm KNKN – sở NN PTNT Khánh Hòa
1. GIỚI THIỆU
Giá trị sản xuất nông lâm nghiệp và thủy sản năm 2010 đạt 232,700 tỷ đồng, tăng 4.7% so
với năm 2009. Trong đó thủy sản đạt 56,900 tỷ đồng tăng 6.1% với cá đạt 3,848.000 tấn tăng
4.8%. Nghề nuôi thủy sản nước ngọt mà đặc biệt là rô phi đỏ đã được Bộ Thủy Sản xác định là
một trong những đối tượng nuôi quan trọng trong quá trình phát triển nuôi trồng thủy sản trong
10 năm trở lại đây.
Việt Nam là nước trong khu vực Đông Nam Á, có khí hậu ấm áp và có đủ điều kiện để sản
xuất cá rô phi hướng tới xuất khẩu. Tuy nhiên, do việc mở rộng khu vực nuôi không theo quy
hoạch cùng với việc nuôi với mật độ cao làm cho nghề nuôi bị thiệt hại nhiều do dịch bệnh. Tác
nhân gây bệnh trên cá rô phi nói chung và rô phi đỏ nói riêng thường là vi khuẩn, virus, hoặc
protozoa trong đó đáng chú ý nhất là bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp.
Do đó việc tìm hiểu ảnh hưởng của bệnh gây ra bởi Streptococcus sp. trên cá rô phi đỏ
đồng thời cải thiện sức khoẻ cá nuôi để cá có sức đề kháng tự nhiên tốt với dịch bệnh mà không
cần sử dụng kháng sinh đang là một nhu cầu cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài nhằm xác định liều LD
50
và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi

đỏ đối với Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β-glucan. Để đạt mục tiêu
trên, lần lượt các nội dung sau sẽ được tiến hành
- Xác định liều LD
50
(lethal dose 50) trên cá rô phi đỏ bằng vi khuẩn Streptococcus
agalactiae.
- Xác định khả năng miễn dịch của cá rô phi đỏ ở các khẩu phần ăn khác nhau có bổ sung
β-glucan.
- Thử nghiệm kháng sinh đồ trên Streptococcus agalactiae.
- Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration
MIC) trên Streptococcus agalactiae.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Cá rô phi đỏ cỡ cá 10 – 15 g/con.
- Streptococcus agalactiae phân lập từ khu vực nuôi cá rô phi ở quận 9 TPHCM
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định LD
50
- Tiến hành gây cảm nhiễm cho cá bằng phương pháp tiêm (T) và ngâm (N) với vi khuẩn
Streptococcus agalactiae ở những độ pha loãng khác nhau 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
để xác định liều gây
chết 50% số cá thí nghiệm.

- Thí nghiệm được theo dõi trong 20 ngày, trong thời gian này cho cá ăn thức ăn viên hàm lượng
đạm 30%, với tỷ lệ 2% trọng lượng thân/ngày.
Bảng 1: Liều vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức trong thí nghiệm 1
Nghiệm thức
Mật độ (cfu/mL)
0 1.28 x 10
3
1.28 x 10
4
1.28 x 10
5
1.28 x 10
6
Tiêm T0 TI TII TIII TIV
Ngâm N0 NI NII NIII NIV
Sau khi gây bệnh, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong
vòng 24 giờ sau khi tiêm là vì cá bị sốc do tiêm. Sau 2 đến 3 ngày gây nhiễm, ghi nhận số lượng
cá chết mỗi ngày ở mỗi nghiệm thức để xác định LD
50
. Quan sát và ghi nhận những biểu hiện bất
thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập vi khuẩn từ gan thận lách và não,
định danh để xác định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ
- Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), sử dụng thức ăn khác
nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Bảng 2: Khẩu phần thức ăn ở các nghiệm thức
β-glucan
Protein
Nghiệm thức
50% Protein 55% Protein

Bổ sung β-glucan T I T III
Không bổ sung β-glucan T II T IV
- Cá được nuôi trong vòng 14 ngày, xác định trọng lượng cá trước và sau khi nuôi. Hàng ngày cho
cá ăn 2 lần vào lúc 8 giờ sáng và 4 giờ chiều. Cho cá ăn tối đa. Sau đó tiến hành gây cảm nhiễm.
Các nghiệm thức gây bệnh tiêm 0,1 mL vi khuẩn với liều LD
50
đã xác định ở thí nghiệm 1 là 7.4
x 10
4

cfu/mL. Trong quá trình tiêm có sử dụng MS222 gây mê để hạn chế cá bị sốc
- Theo dõi tình trạng của cá, thu mẫu cá lờ đờ, cá chết trong thời gian 14 ngày thí nghiệm cảm
nhiễm để xác định khả năng xâm nhập của vi khuẩn Streptococcus agalactiae quan sát và ghi
nhận những biểu hiện bất thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập để xác
định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh.
Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae
- Tiến hành thử nghiệm với 15 loại kháng sinh penicilin, ampicilin, ceftriaxone, cefaclor,
gentamycin, kanamycin, spectinomycin, erythromycin, tylosin, tetracyclin, doxycyclin,
oxytetracyclin, norfloxacin, nitrofurantoin, rifampin
Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số loại kháng sinh trên vi
khuẩn Streptococcus agalacitae
- Sử dụng mật độ vi khuẩn Streptococus agalactiae 1.5x10
8
cfu/mL
- Tiến hành theo phươg pháp pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm (NCCLS, 2000)
Bảng 3: Phương pháp pha loãng kháng sinh
Ống nghiệm 0 1 2 16 17
Môi trường BIH (mL) 2 1.95 1.95 1.95 1.95
Huyền phù vi khuẩn 0 0.05 0.05 0.05 0.05
Kháng sinh (mL) 2 2 2 2 2 mL nước cất

Nồng độ kháng sinh (µg/mL) 1 1 1/2
1
1/2
15
0
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Xác định LD50 của Reed và Muench (1938)
- Tính số cá thể chết và sống trong mỗi nhóm thí nghiệm, sau đó cộng dồn từ thấp đến cao
- Tính tỷ lệ chết trên tổng của cột chết và cột sống cộng dồn.
- Tính khoảng cách tương ứng giữa hai độ pha loãng có tỷ lệ chết cao hơn và thấp hơn 50% gần
nhất.
pd = (> 50% - 50%)/(> 50% - < 50%)
LD
50
= pd x (độ pha loãng thấp hơn 50% - độ pha loãng) + độ pha loãng cao hơn 50%.
Hoặc logLD
50
= [log (> 50%)] + [log (10
-1
) x pd] = y →LD
50
= 10
y
.
Phương pháp xác định ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ
Tỷ lệ sống của cá theo thí nghiệm(%)
X(%) = (N
t
/ N
o

) x 100 Với N
o
: Số lượng cá đầu thí nghiệm
N
t
: Số lượng cá sau thí nghiệm
Tăng trọng
W = W
t
– W
o
Với W
o
:
Trọng lượng cá đầu thí nghiệm
W
t
: Trọng lượng cá sau thí nghiệm
Phương pháp xác định kháng sinh đồ
Các số liệu đường kính vòng vô khuẩn được đo trong thí nghiệm và biện luận tính kháng,
tính nhạy trung gian và tính nhạy của vi khuẩn đối với các kháng sinh thử nghiệm
Phương pháp tính MIC
Nồng độ tối thiểu của kháng sinh ngăn cản sự tăng trường của vi khuẩn (MIC) là tích số
của nồng độ kháng sinh ban đầu với tỷ lệ pha loãng của kháng sinh ở ống trong cuối cùng trong
dãy ống nghiệm.
MIC = C
M
x 1/2
n
.

Trong đó:
o MIC: nồng độ ức chế tối thiểu
o C
M
: nồng độ kháng sinh ban đầu
o 1/2
n
: tỷ lệ pha loãng của kháng sinh ở ống trong cuối cùng trong dãy ống nghiệm.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn
Quá trình phân lập vi khuẩn trên cá chết và cá lờ đờ đều cho những khuẩn lạc tròn, màu
trắng sữa, bóng, lồi thấp, rìa đều, tâm đậm hơn rìa.
Qua định danh sơ bộ cho phản ứng oxidase (-), catalase (-). Vi khuẩn bắt màu tím, Gram
dương hình cầu thành từng đôi, có khi đứng riêng lẻ (trên môi trường thạch), tạo thành chuỗi dài
(trong môi trường tăng sinh).
(a): Vi khuần hình cầu (môi trường thạch) (b): Vi khuẩn dạng chuỗi (môi trường tăng sinh)
Hình 1: Hình thái của vi khuẩn
Xác định LD
50
Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ở phương pháp tiêm và ngâm
Mặc dù trong cùng điều kiện chăm sóc, quản lý như nhau ở hai phương pháp ngâm và
tiêm nhưng thời điểm phát sinh bệnh khác nhau ở mỗi nghiệm thức. Cả ba lần lặp lại thì nghiệm
thức đối chứng hoàn toàn không có dấu hiệu bệnh lý. Ở nghiệm thức IV (1.28 x 10
6
cfu/mL) của
cả phương pháp tiêm và ngâm thì dấu hiệu bệnh lý xuất hiện sau 21 giờ từ lúc gây cảm nhiễm.
Với thời gian biểu hiện này cho thấy tính nhạy cảm của ký chủ và khả năng gây bệnh của chủng
này.
Bảng 4: Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh
Phương pháp

Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh
ĐC NT I NT II NT III NT IV
Tiêm - 48±0.29
c
46±0.0
c
30±1.53
b
21±0.0
a
Ngâm - 49±1.26
c
46.5±0.5
c
31±1.15
b
24.3±0.88
a
Ghi chú: (-) không có biểu hiện bệnh
Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau
thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)
Đối với phương pháp tiêm và ngâm chúng tôi thấy rằng thời gian cá bắt đầu biểu hiện dấu
hiệu bệnh lý ở các nghiệm thức là có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy
95% (P < 0.05).
Tỷ lệ cá chết, các dấu hiệu bệnh lý, kết quả tái phân lập
- Dấu hiệu bệnh lý: Hầu hết cá bệnh đều có dấu hiệu bệnh lý giống nhau là tách đàn, bỏ ăn, bơi lờ
đờ trên mặt bể, bụng trương, mắt lồi, mù mắt, xuất huyết các gốc vây, toàn thân. Khi giải phẫu
thấy có hiện tượng tích dịch xoang bụng, gan nhạt màu, đôi khi xuất huyết, lách, thận và mật
sưng, bóng khí phình to, não bị xuất huyết.
(b)

(a)
Hình 3: Cá thí nghiệm bị mù mắt và trương bụng sau 4 ngày gây bệnh
Hình 2: Cá thí nghiệm bị mù mắt và trương bụng sau 4 ngày gây bệnh
Bảng 5: Kết quả tỷ lệ cá chết và tái phân lập
Ghi chú:
Những giá
trị của các
nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý
nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)
Ở phương pháp ngâm và tiêm, tỷ lệ chết ở nghiệm thức đối chứng thấp hơn có ý nghĩa về
mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P < 0.05) so với các nghiệm thức còn lại. Cá chết ở nghiệm
thức đối chứng là do một số cá đã bị xây xát trong quá trình vận chuyển cá vào các bể thí nghiệm
và bị sốc do tiêm. Khi tái phân lập thì ở nghiệm thức đối chứng hoàn toàn không phân lập được
vi khuẩn, ở các nghiệm thức còn lại vi khuẩn luôn được phân lập từ các thực thể thí nghiệm.
Mặc dù tỷ lệ cá chết tăng dần theo mật độ vi khuẩn thí nghiệm, tuy nhiên không có sự
khác biệt về tỷ lệ chết giữa hai phương pháp gây cảm nhiễm bệnh tiêm và ngâm (P>0.05). Tuy
nhiên, kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn càng cao thì tỉ lệ cá chết càng nhiều. Ở nghiệm thức có
mật độ 1.28 x 10
6
cfu/mL cho tỉ lệ cá chết cao nhất, chiếm 51.67% ở phương pháp tiêm và
46.67% ở phương pháp ngâm.
Liều LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Trong quá trình nuôi, đến ngày thứ 10, bắt đầu xuất hiện bể có 50% số cá chết.
Vi khuẩn luôn được tái phân lập từ các thực thể thí nghiệm nên thể hiện vai trò của vi khuẩn
trong quá trình diễn tiến bệnh lý của cá.
Bảng 6: Kết quả LD
50
của vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Ngày
Liều (cfu/mL) (theo Reed và Muench)

PP Tiêm PP Ngâm
10 - -
11 - -
12 1.22 x 10
5
-
13 9.34 x 10
4
-
14 7.3 x 10
4
1.14 x 10
5
Ghi chú: (-) không xác định được LD
50
Nghiệm
thức
Tỷ lệ cá chết (%) Số mẫu tái phân lập
PP Tiêm PP Ngâm PP Tiêm PP Ngâm
ĐC 16.67 ± 3.33
a
15 ± 2.89
a
0 0
NT I 40 ± 5.00
b
36.67

± 1.67
b

6 6
NT II 40 ± 2.89
b
38.33

± 1.67
b
6 6
NT III 46.67 ± 3.33
b
41.67 ±4.41
b
6 6
NT IV 51.67 ± 3.49
b
46.67 ±3.33
b
6 6
Ở phương pháp ngâm, thời gian để vi khuẩn làm chết 50% số cá thí nghiệm là 14 ngày
chậm hơn phương pháp tiêm 2 ngày, đồng thời liều vi khuẩn gây chết 50% số cá thí nghiệm của
phương pháp ngâm cao hơn của phương pháp tiêm trong cùng thời điểm (1.14 x 10
5
cfu/mL so
với 7.3 x 10
4
cfu/mL. Phương pháp tiêm có tác dụng gây bệnh hiệu quả hơn phương pháp ngâm
trong cùng điều kiện thí nghiệm, do ở phương pháp tiêm vi khuẩn được đưa trực tiếp vào cơ thể
cá, trong khi đó ở phương pháp ngâm vi khuẩn được pha vào nước cần có thời gian xâm nhập
vào cơ thể ký chủ, quá trình này còn phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cá.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá

Tăng trọng của cá thí nghiệm
Tăng trọng của cá ăn khẩu phần 55% Protein cao hơn có ý nghĩa về mặt thống kê so với
các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức 50% Protein cho sự tăng trọng của cá thấp nhất có ý nghĩa
về mặt thống kê (P>0.05). Điều này cho thấy sự khác biệt hàm lượng protein tác động đến tăng
trọng của cá thí nghiệm, tuy nhiên việc bổ sung β glucan ảnh hưởng không đáng kể đến tăng
trọng cá thí nghiệm trong 14 ngày nuôi. Ở cá ăn khẩu phần proetin 50%, sự bổ sung β-glucan
cho thấy sự tăng trọng cao hơn với khẩu phần không bổ sung β-glucan (1.11 so với 0.75). Khẩu
phần thức ăn bổ sung β-glucan thương mại như EcoActiva cho thấy sự tăng trưởng rõ ràng trên
cá pink snapper (Cook et al., 2001), cá Rohu (Misra et al., 2006), large yellow croaker (Ai et al.,
2007).
Tỷ lệ cá sống là 100% giữa các nghiệm thức. Điều này chứng tỏ việc bổ sung β glucan
không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cá.
Bảng 7: Tăng trọng của cá thí nghiệm
Chỉ tiêu
Nghiệm thức
50%P + β-glucan 50%P 55%P + β-glucan 55%P
T1 T2 T3 T4
Trọng lượng đầu 12.55±1.53
a
12.48±0.89
a
13.01±0.79
a
10.93±0.65
a
Trọng lượng cuối 13.66±1.37
a
13.23±1.04
a
14.14±0.55

a
13.51±0.77
a
Tăng trọng 1.11±0.31
ab
0.75±0.15
a
1.13±0.24
ab
2.58±0.89
b
Tỷ lệ sống 100% 100% 100% 100%
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự
giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P>0.05)
Kết quả đáp ứng miễn dịch của cá
Gây cảm nhiễm bệnh cho cá nuôi thí nghiệm sau 14 ngày cho ăn β–glucan để xem khả
năng đáp ứng miễn dịch của cá. Tiêm vi khuẩn Streptococcus agalactiae với mật độ 7.4.10
4
cfu/mL (đã được xác định ở thí nghiệm 1) cho 4 nghiệm thức. Thí nghiệm được theo dõi trong
14 ngày, cá chết hay hấp hối đều được ghi nhận và mổ khám bệnh tích. Các dấu hiệu ở các
nghiệm thức gây bệnh chúng tôi ghi nhận được là tách đàn, bỏ ăn, bơi lội lờ đờ trên mặt bể, cá
chết thường có biểu hiện bên ngoài là xuất huyết toàn thân, vây ngực, vây đuôi, một số con bị lồi
mắt. Bệnh tích bên trong ghi nhận được là gan nhạt màu, thận sưng, lách sưng, tích dịch xoang
bụng, có trường hợp bóng khí phình to. Sau khi mổ khám bệnh tích, các mẫu gan, thận, lách
được cấy trên đĩa môi trường BHIA và định danh sơ bộ.
Bảng 8: Kết quả cá chết và tái phân lập giữa các nghiệm thức
Nghiệm thức % cá chết Số mẫu tái phân lập
T I 65 ± 2.89
a
6

T II 81.67 ± 4.41
b
6
T III 61.67 ±7.26
a
6
T IV 76.67

± 3.33
ab
6
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự
giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)
Ở cá ăn sử dụng khẩu phần có bổ sung β-glucan (nghiệm thức T I và T III) đều cho tỉ lệ
cá chết thấp nhất có ý nghĩa thống kê (P<0.05). Điều này chứng tỏ β-glucan có tác động làm tăng
khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Dharmendra
(2012), khẩu phần có bổ sung β-glucan cho thấy sự cải thiện về sức khỏe, và tăng trưởng ở nhiều
nhóm động vật khác nhau như tôm, cá và những động vật trên cạn khác. Theo Ai và cộng sự
(2007), β-glucan có khả năng tăng cường khả năng bảo vệ cho cá croaker đề kháng vi khuẩn
Vibrio harveyi. Tương tự, β-glucan tăng cường sức đề kháng cho cá da trơn (Aisan catfish) với vi
khuẩn Aeromonas hydrophila (Kumari and Sahoo, 2006), cá Rohu với vi khuẩn Edwardsiella
tarda (Sahoo and Mukherjee, 2001).
Hàm lượng protein 50 và 55% không cho thấy sự sai khác về mặt thống kê ở tỉ lệ chết
(nghiệm thức T II và T IV). Kết quả này cho thấy hàm lượng đạm trong thức ăn không có tác
động làm tăng khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh.
Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ
Tiến hành thử nghiệm với 15 loại kháng sinh penicillin (Pn), ampicilin (Am), ceftriaxone
(Cx), cefaclor (Cr), gentamycin( Ge), kanamycin (Kn), spectinomycin (Sp), erythromycin (Er),
tylosin (Ty), tetracycline (Te), doxycyclin (Dx), oxytetracyclin (Ox), norfloxacin (Nr),
nitrofurantoin (Fr), rifampin (Rf)

Bảng 9: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình
Kháng
sinh
Đường kính vòng kháng khuẩn đo được
Đường kính vòng
kháng khuẩn
trung bình
Nhận xét
Lần lặp lại thứ
nhất
Lần lặp lại thứ hai
Pn 16 15 15.5 Kháng
Hình 4: Vi khuẩn phân lập từ cá bệnh cấy
thuần trên đĩa thạch sau 24 giờ ủ ở 30
o
C
Am 22 21 21.5 Kháng
Cx 23 23 23.0 Nhạy
Cr 23 22 22.5 Nhạy
Ge 25 24 24.5 Nhạy
Kn 27 26 26.5 Nhạy
Sp 19 18 18.5 Nhạy
Er 21 22 21.5 Trung gian
Ty 16 16 16.0 Kháng
Te 26 25 25.5 Nhạy
Dx 28 28 28.0 Nhạy
Ox 25 25 25.0 Nhạy
Nr 28 28 28.0 Nhạy
Fr 16 16 16.0 Trung gian
Rf 21 21 21.0 Nhạy

Kết quả thu được như sau:
Vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng sinh sau: Pn, Am, Ty.
Vi khuẩn Streptococcus agalactiae nhạy với các loại kháng sinh sau: Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx,
Rf, Cx, Nr, Sp và ít nhạy với kháng sinh: Er và Fr.
Hình 5: Vòng kháng khuẩn các kháng sinh
Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Từ kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán kháng sinh, một số
loại kháng sinh cho kết quả nhạy và ít nhạy trên Streptococcus agalactiae để tiếp tục thử nghiệm
kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp, nhằm xác định nồng độ tối thiểu của kháng
sinh có thể ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Bảng 10: Kết quả thử nghiệm xác định MIC của một số kháng sinh trên vi khuẩn
Streptococcus agalactiae
Kháng sinh Ký hiệu
Kết Quả
Kháng Trung gian Nhạy
Cefaclor Cr 8.192 4.096 2.048
Gentamycin Ge 5.461 2.731 1.365
Kanamycin Kn 6.827 3.413 1.707
Erythromycin Er 0.512 0.256 0.128
Tetracyclin Te 4.096 2.048 1.024
Oxytetracycli
n
Ox 0.683 0.512 0.427
Doxycyclin Dx 4.096 2.048 1.024
Rifampin Rf 1.024 0.512 0.256
Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh trong thí nghiệm trên
vi khuẩn Streptococcus agalactiae là khác nhau, trong đó nồng độ của kháng sinh cefaclor là cao
nhất (8.192 µg/mL), nồng độ của kháng sinh erythromycin là thấp nhất (0.512 µg/mL).
Có nhiều dạng kháng thuốc như: đề kháng tự nhiên, đề kháng sinh học, đề kháng điều
trị… Nhưng trong nghiên cứu này, khả năng đề kháng tự nhiên của Streptococcus agalactiae

được loại trừ. Đề kháng tự nhiên được hiểu là hiện tượng mỗi loài sinh vật sẽ có khả năng không
bị ức chế hoặc tiêu diệt bởi một số kháng sinh nhất định. Ví dụ như nấm, virus, nguyên sinh
động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của kháng
sinh β-lactam (cefalor). Khả năng đề kháng sinh học là sự đề kháng ngẫu nhiên của vi sinh vật
gây bệnh đã hình thành trong quần thể vi sinh vật gây bệnh trước khi tiếp xúc với môi trường
chứa chất kháng sinh. Đây là hiện tượng xảy ra không phổ biến, nguyên nhân có thể do đột biến
ngẫu nhiên nhiễm sắc thể nên trong quần thể vi sinh vật gây bệnh sẽ xuất hiện một (hoặc vài tế
bào) có khả năng kháng thuốc. Do đó, ở lần điều trị bệnh đầu tiên sẽ có dấu hiệu giảm nhưng sẽ
bùng phát trở lại ngay sau đó vì chỉ có tế bào vi sinh vật thường bị tiêu diệt, còn các tế bào vi
sinh vật kháng thuốc vẫn còn sống sót, tiếp tục sinh trưởng bù đắp cho tế bào đã bị tiêu diệt. Hậu
quả là chúng làm thay đổi bản chất của vi sinh vật gây bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của
thuốc kháng sinh đó trong tất cả các lần điều trị sau này. Như vậy, với tình hình bệnh trên cá rô
phi đỏ do Streptococcus sp. thì Streptococcus sp không có đề kháng sinh học với các loại kháng
sinh trên. Từ đó, khả năng điều trị được cân nhắc đến. Thực tế cho thấy, khả năng đề kháng điều
trị của vi sinh vật gây bệnh xuất hiện rất phổ biến sau khi tiếp xúc nhiều với một loại kháng sinh.
Hiện nay, đa số người nuôi sử dụng nhóm β-lactamine (kháng sinh cefalor) và nhóm
aminoglycoside (gồm gentamycin và kanamycin) trong việc điều trị bệnh. Chính vì vậy, chúng
tôi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cefalor là cao nhất (8.192 µg/mL), kế tiếp là
kanamycin (6.827 µg/mL), và gentamycin (5.461 µg/mL). Trong khi đó, các nhóm kháng sinh
còn lại ít được lựa chọn trong việc trị bệnh như rifampin (có tác dụng gắn với enzyme mRNA
polymerasa ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA). Vì vậy, nồng độ ức chế tối thiểu của
rifampin khá thấp (1.024 µg/mL). Như vậy, kết quả của MIC đối với chủng Streptococcus
agaalactiae trong phòng thí nghiệm khá phù hợp với thực tế sử dụng thuốc của người dân (Đạt
and Tuyền, 2005, Uyên, 2005). Tuy nhiên, mặc dù nhóm Macrolide (kháng sinh erythromycin)
là một trong những kháng sinh được người dân lựa chọn khá nhiều trong việc điều trị nhưng vẫn
cho nồng độ MIC thấp (0,512 µg/mL). Điều này có thể được giải thích rằng nhóm Macrolide có
tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp protein, chúng gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã của các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide, nên việc điều trị
khá hiệu quả và khả năng kháng thuốc thấp.
Tóm lại, kết quả nồng độ MIC của các loại kháng sinh đối với chủng Streptococcus

agaalactiae phân lập ở khu vực Quận 9 TPHCM cho kết quả khá phù hợp với những cuộc điều
tra về việc sử dụng thuốc của người dân trong việc điều trị cá rô phi đỏ. Để giải quyết tình trạng
kháng thuốc, giải pháp trực quan và đơn giản nhất là sử dụng các loại kháng sinh mới. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu và sản xuất một loại kháng sinh mới là cả một khối lượng công viêc
khổng lồ, tiêu tốn thời gian và tiền bạc. Nguy hiểm hơn, tình trạng lạm dụng kháng sinh ngày
càng phổ biến sẽ khiến vật chủ trở nên thụ động hơn về khả năng tự đề kháng trong khi yếu tố
gây bệnh trở nên nguy hiểm hơn… Chính vì vậy, định hướng sử dụng kháng sinh mới là giải
pháp mang tính tình thế. Việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch sinh học như β-glucan cũng
có thể được xem là một hướng đi trong việc phòng bệnh thủy sản trong tương lai.
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
- LD
50
của vi khuẩn Streptococcus agalactiae đối với cá rô phi đỏ là 7.3 x 10
4
cfu/mL (phương
pháp tiêm) và 1.14 x 10
5
cfu/mL (phương pháp ngâm).
- Về thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ, β–glucan đã cho kết quả tốt trong
việc đáp ứng miễn dịch trên cá trong thời gian nuôi 15 ngày. Do đó có thể sử dụng để tăng khả
năng miễn dịch của cá trong phòng và trị bệnh.
- Đối với thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng
sinh : Pn, Am, Ty, nhạy với các loại kháng sinh : Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx, Rf,Cx, Nr, Sp và ít
nhạy với kháng sinh: Er và Fr.
- Về thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh dao động từ 0.512 µg/mL đến 8.192
µg/mL tùy loại kháng sinh. Kết quả này cũng phù hợp với thực tế sử dụng thuốc của người dân
trong việc điều trị bệnh cá rô phi đỏ do Streptococcus agalactiae gây ra.
Đề nghị
- Cần nghiên cứu thêm liều LD

50
của các loài vi khuẩn khác nhau trên cá rô phi đỏ cũng như các
đối tượng khác tạo thuận lợi cho việc quản lý dịch bệnh trên cá.
- Tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của β–glucan lên khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô
phi đỏ cũng như một số đối tượng nuôi khác trong những khoảng thời gian khác nhau để có cái
nhìn chi tiết hơn về tác động của β–glucan tạo thuận lợi trong phòng và trị bệnh.
- Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ trên các chủng Streptococcus sp. khác nhau và trên nhiều
loại kháng sinh nhằm rút ra kết luận chính xác về hiệu lực các loại các sinh từ đó đề nghị cách sử
dụng kháng sinh hiệu quả góp phần đảm bảo sức khoẻ cộng đồng.
- Nên có biện pháp hướng dẫn người nông dân sử dụng đúng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản
tránh tình trạng lờn thuốc và không được sử dụng các loại kháng sinh cấm.
- Tiếp tục thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh khác trên vi khuẩn
Streptococcus agalactiae và các chủng vi khuẩn khác để có thể chọn lựa và sử dụng có hiệu quả
kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
AI, Q., MAI, K., ZHANG, L., TAN, B., ZHANG, W., XU, W. & LI, H. (2007) Effects of dietary
[beta]-1, 3 glucan on innate immune response of large yellow croaker, Pseudosciaena
crocea. Fish & Shellfish Immunology, 22, 394-402.
COOK, M. T., HAYBALL, P. J., HUTCHINSON, W., NOWAK, B. & HAYBALL, J. D. (2001)
The efficacy of a commercial [beta]-glucan preparation, EcoActiva(TM), on stimulating
respiratory burst activity of head-kidney macrophages from pink snapper (Pagrus
auratus), Sparidae. Fish & Shellfish Immunology, 11, 661-672.
ĐẠT, P. Q. & TUYỀN, C. T. (2005) Điều tra tình hình dịch bệnh và khảo sát đáp ứng miễn dịch
của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus sp. Khoa Thủy Sản. Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm
TPHCM.
DHARMENDRA, K. M., PRONOB, D., SHAHBAZ, M. A., SEKAR, M. & SATENDRA, K.
(2012) Beta glucans in aquaculture.
KUMARI, J. & SAHOO, P. K. (2006) Non-specific immune response of healthy and immuno
compromised Clarias batrachus to several immunostimulants. Aquaculture, 255, 133-141.
MISRA, C. K., DAS, B. K., MUKHERJEE, S. C. & PATTNAIK, P. (2006) Effect of

long term administration of dietary beta-glucan on immunity, growth and survival
of Labeo rohita fingerlings. Aquaculture, 255, 82-94.
NCCLS (2000) Performance standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. National
Committe for Clinical Laboratory Standards. Aprroved Standard.
REED, L. J. & MUENCH, H. (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints.
American Journal of Hygiene, 27, 493-497.
SAHOO, P. K. & MUKHERJEE, S. C. (2001) The effect of dietary beta-glucan on immune
response and disease resistance of healthy and aflatoxin B1-induced
immunocompromised Labeo rohita. Fish & Shellfish Immunology, 11, 683-695.
UYÊN, D. P. (2005) Khảo sát kỹ thuật nuôi và bệnh do Streptococcus sp. trên cá rô phi nuôi bè.
Khoa Thủy Sản. Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm TPHCM.
ABSTRACT
Vietnam has several farms active in the production of catfish, tilapia, fresh water prawn. However, their
sustainability is in question due to discriminate use of antibiotics and harmful chemicals. Currently, the red tilapia
aquaculture has been developed in Mekong Delta resulting in disease outbreak. Therefore, the impact of disease
caused by Streptococcus sp. on red tilapia and how to improve the immune system by minimize using antibiotics is
priority requirement. The research has four sesions (1) Determine the LD
50
dose of red tilapia with Streptococcus
agalactiae by injection and immersion method. (2) Determine the immunity of red tilapia in the diets supplemented
with and without β-glucan. (3) Testing antibiotic on Streptococcus agalactiae with 15 strains Ampicillin, Penicilein,
Ceftriaxone, Cefaclor, Gentamycin, Kanamycin, Spectinomycin, Erythromycin, Tylosin, Tetracyclin, Doxycyclin,
Oxytetracyclin, Norfloxacin, Nitrofurantoin, Rifampin. (4) The antibiotics which were sensitive with Streptococcus
sp. were further tested to determinie the minumim inhibitory concentration (MIC). The results in experiment (1)
showed that LD
50
of red tilapia on Streptococcus agalctiae was 7.3x10
4
cfu/mL and 1.14 x 10
5

cfu/mL for injection
and immersion, respectively. In experiment (2), the fish mortalities in the treatments supplemented with β-glucan
were significantly lower than without β-glucan (p<0.05). The results of this study suggested that β-glucan improved
the immune response for cultured red tilapia. In experiment (3) while Pn, Am, Ty were resistant to Streptococcus
agalctiae, Ge, Kn, Te, Ox, Rf, Cr, Dx, Nr, Sp were sensitive to Streptococcus sp. Er and Fr were less sensitive to
Streptococcus sp. Finally, the last experiment obtained MIC ranged from 0.512 mg/mL to 8.192 mg/mL relied on
each antiobiotics.